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La culture in vitro

 

Certaines cellules végétales ont la capacité de régénérer la plante entière. Cette propriété, qui s'exprime dans la multiplication végétative naturelle, est connue et utilisée depuis longtemps, avec le bouturage par exemple. Afin d'étudier les mécanismes de régénération et de pouvoir mieux exploiter cette caractéristique, différentes techniques de culture des cellules végétales ont été développées en laboratoire :
- culture de tissus provoquant la multiplication inorganisée des cellules à partir de cellules totalement indépendantes. On a ainsi pu mettre en évidence les 2 mécanismes essentiels de régénération selon les espèces : par la formation de méristèmes (donc de bourgeons) ou bien par la différenciation d'embryons somatiques (issus de cellules non sexuelles). La formation de méristèmes a été mise à profit dans des expériences de transfert de gènes,
- micro-bouturage qui, par simple enracinement sur milieu de culture, augmente la rapidité et la fiabilité du processus de croissance,
-  culture de méristème, petit organe fragile de moins de 1 mm présent au sein du bourgeon apical assurant la croissance et la mise en place des différents organes de la plante. Exempt de virus, sa culture permet la régénération de plantes saines,
- culture de protoplastes, c'est à dire de cellules sans paroi. Leur multiplication permet l'obtention d'un très grand nombre de plantes et peut être utilisée pour la production de plantes nouvelles issues de fusion de cellules d'origines différentes.

Les applications de ces techniques sont nombreuses et variées : étude de la différenciation, production de plantes identiques, guérison, amélioration, sélection de mutants... L'INRA a largement contribué à l'élaboration des connaissances utilisées par la culture in vitro et à la mise au point et au développement des techniques elles-mêmes.

 

Régénération de plantes entières et multiplication végétative

Après la mise en évidence de l'auxine dans les années 30, l'étape scientifique décisive a été la découverte, dans les années 50, de l'existence et des propriétés d'autres hormones de croissance végétales, qui contrôlent la rhizogenèse (formation des racines) et le développement des parties aériennes des plantes. Indispensables à la multiplication et à la différentiation cellulaires, ces hormones doivent être fournies aux cellules en culture. L'autre facteur déterminant pour la réussite de la culture in vitro a été la mise au point de l'asepsie des techniques de prélèvement et des milieux de culture.

Guérison des plantes par culture de méristèmes

La première application agronomique de ces connaissances en physiologie végétale date des années 1950. Elle est liée à la démonstration du fait que, même lorsqu'une plante parait totalement infestée par un virus ou une bactérie, les méristèmes (extrémités des bourgeons - et des racines -) sont indemnes ; d'où l'idée de régénérer une plante à partir de ces cellules embryonnaires saines.

Ces travaux, menés à l'INRA, ont abouti en 1952 à la "guérison" d'une première plante, un dahlia. La technique, toujours utilisée actuellement, a permis depuis de sauver de nombreuses espèces ou variétés (oeillet, pomme de terre...) atteintes de viroses graves.

L'objectif initial de la culture de méristème était d'obtenir une petite plante saine transplantable dans un sol, qui était ensuite multipliée par des techniques traditionnelles.

Multiplication végétative

Ce n'est que dans les années 60 et 70 que fut exploité le potentiel de multiplication exponentielle de la culture in vitro. Il est en effet possible, en modifiant le milieu de culture, de faire produire au méristème, non pas une tige, mais un buisson comportant de nombreux bourgeons que l'on peut facilement séparer les uns des autres et repiquer dans d'autres tubes. Répétable toutes les 3 ou 4 semaines, cette opération permet théoriquement de produire, à partir d'un seul bourgeon, plusieurs millions de nouvelles plantes en un an.

Cette technique a progressivement été appliquée à de nombreuses espèces et elle est passée au stade de l'exploitation industrielle. Elle a de plus permis la multiplication végétative d'espèces dont le bouturage était peu performant ou impossible : c'est le cas par exemple des orchidées, dont la production s'est considérablement développée grâce à la culture in vitro.

La mise en oeuvre de ce mode de multiplication nécessite toutefois, pour chaque nouvelle espèce ou variété, l'élaboration de milieux de culture particuliers... et certaines plantes restent en fait très difficiles à cultiver in vitro.

La maîtrise du micro-bouturage a également permis l'élaboration d'une nouvelle technique de greffage : la greffe bouture herbacée. L'INRA, en collaboration avec le groupe champenois MUMM, a ainsi mis au point la production de plants de vigne greffés par assemblage de deux boutures herbacées. Cette méthode présente de nombreux avantages : le taux de réussite du greffage est supérieur, la "soudure" entre greffon et porte-greffe est améliorée, le système racinaire est mieux développé et la qualité sanitaire des plants est meilleure.

Production de plantes génétiquement nouvelles

Progressivement, diverses techniques de culture in vitro ont été élaborées. Elles permettent la création et le développement d'individus génétiquement originaux, support d'analyse scientifique.

Culture d'embryons

La culture d'embryons immatures permet de raccourcir la durée du cycle végétatif (de l'embryon à la floraison) et de réduire fortement les phénomènes de dormance. Mais son principal intérêt est en fait d'autoriser le "sauvetage" et le développement d'embryons peu viables dans des conditions naturelles (issus de certains croisements interspécifiques) ou d'embryons obtenus en laboratoire (à partir de cellules somatiques ou de gamètes non fécondés par exemple).

Obtention d'haploïdes

Les individus haploïdes (possédant un seul jeu de chromosomes) constituent un matériau privilégié pour l'étude de l'expression des gènes ; ils permettent également de produire rapidement, par doublement chromosomique, des individus totalement homozygotes (dont tous les gamètes porteront les mêmes gènes). Des haploïdes peuvent apparaître naturellement, par parthénogénie spontanée ou lors d'hybridations interspécifiques. Le phénomène est toutefois peu fréquent, et des méthodes de production d'haploïdes ont été recherchées. Les plus employées sont les techniques de culture in vitro d'organes reproducteurs mâles ou femelles immatures, voire même de cellules sexuelles : pollen, ovules.

Culture et fusion de protoplastes

Les protoplastes sont des cellules végétales débarrassées, par un traitement enzymatique, de leur paroi pecto-cellulosique et qui peuvent ainsi être fusionnées entre elles. Cette fusion permet la création d'hybrides interspécifiques qui ne peuvent être obtenus par fécondation. Ces hybrides présentent de plus la particularité de posséder à la fois les noyaux et les cytoplasmes des deux cellules initiales (lors d'une fécondation, seul le noyau de la cellule mâle passe dans l'ovule). Il est ainsi possible d'associer transitoirement dans une même cellule des organites (mitochondries et chloroplastes notamment) de deux origines, porteurs de caractéristiques différentes et donc de favoriser la recombinaison des génomes de mitochondries.

Tout récemment, une équipe INRA est par exemple parvenue à obtenir la première fécondation in vitro chez une plante, opération rendue complexe par l'existence d'une double fécondation (l'une donnant l'embryon et l'autre les tissus nourriciers de l'albumen).

Culture d'individus transgéniques

La culture in vitro permet de manipuler des végétaux à l'état unicellulaire et notamment de transformer le génome d'une seule cellule pour obtenir une plante uniformément modifiée génétiquement. L'introduction du gène utile (et des séquences qui contrôlent son expression) est réalisée par l'intermédiaire d'un plasmide (molécule circulaire d'ADN d'origine bactérienne) selon diverses techniques.

Le transfert de gènes d'origines variées (végétale, animale, bactérienne, virale ou construite au laboratoire) dans des cellules végétales ouvre de nouvelles et importantes perspectives pour l'amélioration des plantes. Le transfert de gènes de résistance aux insectes, aux virus ou aux herbicides est en cours de validation agronomique. A plus long terme, l'introduction de gènes modifiant la qualité des produits ou codant pour des molécules d'intérêt pharmaceutique est en projet.

Exemple d'application

Le cas du colza illustre l'utilisation de ces diverses techniques dans les programmes d'amélioration génétiques actuels (voir Fiche Variétés de colza). La création d'une lignée mâle-stérile, indispensable à la production à grande échelle de semences hybrides, a ainsi nécessité le sauvetage des embryons issus du croisement avec le radis porteur de la stérilité recherchée, puis le recours à des fusions de protoplastes. Les techniques de transgenèse ont ensuite été utilisées pour introduire chez le colza des gènes dont les produits modifient la composition en huile des graines.


Pour en savoir plus :

1997. Biofutur. Dossier plantes transgéniques. février.


Laboratoires :

INRA - Versailles : Biologie cellulaire
Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles cedex

INRA - Versailles : Génétique et amélioration des plantes
Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles cedex

INRA - Dijon : Génétique et amélioration des plantes
17 rue de Sully, 21034 Dijon cedex

INRA - Avignon : Amélioration des plantes maraîchères
Domaine de Saint-Paul, BP 91 ; 84143 Montfavet cedex

INRA - Rennes : Amélioration de la pomme de terre et des plantes à bulbes
Domaine de Keraiber, 29260 Ploudaniel

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