Concepts et Techniques

1. ES Balakirev et al.; Annual Review of Genetics 37 (DEC03) 123-151, discutent d'un sujet éternel (jusqu'à présent) celui de savoir si les pseudogènes (des duplicata, engendrés par des duplications ou des transpositions, de gènes devenus non fonctionnels du fait de l'accumulation de défauts qui n'ont pas été contre sélectionnés) ont un sens biologique caché. Beaucoup d'entre eux sont, cependant impliqués dans diverses fonctions autres que celle d'origine, ne serait qu'à l'occasion de conversions géniques ou de recombinaisons avec des gènes fonctionnels. Ces recombinaisons engendrent une diversité utilisable.

On observe une conservation des séquences avec un excès de substitutions nucléotidiques synonymes par rapport aux non synonymes, ce qui est attendu de séquences ayant une fonction.

Partant de la Drosophile (chez qui les pseudogènes sont relativement rares par rapport aux Vertébrés), et étendant leurs observations à d'autres eucaryotes animaux ou végétaux comme l'homme ou la tomate, les auteurs concluent que c'est une réserve de gènes potentiels plus que des détritus de l'évolution, contrairement à ce que l'on observe chez les bactéries (encore que l'on puisse trouver plusieurs exemples d'utilisation de pseudogènes, comme chez Borrelia hermsii, où le pseudogène vmp est une source de polymorphisme antigénique.

Les auteurs concentrent leur attention sur les pseudogènes pour lesquels on a des informations fonctionnelles ou évolutives. Il existe des pseudogènes qui ont tous les éléments d'un gène actif. Le locus Cecropin de la Drosophile comporte un gène dit "normal" et deux pseudogènes Cecy1 et Cecy2. La divergence par rapport à Cec est considérable avec de nombreux codons stops intempestifs, ainsi que des délétions, et une absence de sites d'épissage. Et pourtant le promoteur est conservé et des messagers auraient été détectés. On a décrit deux pseudogènes Adh qui se sont révélés, plus tard, être de nouveaux gènes fonctionnels, ce que laissait supposer une bonne conservation des séquences régulatrices.

Le gène Stellate (Ste) du chromosome X de D. melanogaster est homologue d'une séquence répétée logée dans le locus Suppressor of [Su(Ste)] du chromosome Y où on observe des séquences pseudogéniques répétées en tandem avec des codons stops prématurés et des décalages de phase de lecture. Et pourtant ces gènes en Su(Ste) sont transcrits. Or les séquences Su(Ste) du chromosome Y régulent l'activité du locus Ste du chromosome X en réprimant la transcription par un mécanisme d'interférence ARN (voir Y Tomari et al.; Cell 116 (19MAR04) 831-841 par exemple).

Les auteurs avaient décrit un pseudogènecryptique” au sein du groupe de gènes de b-estérase de D.melanogaster. Ce groupe comprend deux gènes homologues en tandem, d'abord décrits sous les noms d'Est-6 et Est-P.

Le gène Est-6 code la b-carboxylestérase majeure (EST-6), qui est transférée par les mâles avec le fluide séminal lors de la copulation, ce qui module le comportement reproducteur de la femelle.

Est-P a, initialement, été identifié (en 1990) comme un gène fonctionnel du fait de sa structure. Mais les auteurs de la revue ont, ensuite, démontré des altérations qui devraient en faire un pseudogène, yEst-6.

La comparaison de yEst-6 et Est-6 dans 28 souches montre la présence de nombreuses anomalies de séquences disparates entre ces souches.

Cependant yEst-6 peut être exprimé et donne une estérase active, mais dans des conditions différentes de Est-6, notamment dans les deux sexes alors que le gène "normal" n'est exprimé que chez les mâles. Les taux de recombinaison sont nettement différents entre yEst-6 et Est-6. La conclusion est que yEst-6 est un gène "fonctionnel", mais avec une structure de pseudogène.

2. Plantes et mammifères montrent une accumulation de rétrotransposons. Leurs hôtes ont développé des mécanismes de régulation de leur nombre mais, de temps à autre au cours de l'évolution, ont a assisté à une expansion massive de ces éléments mobiles qui constituent 50% du génome des mammifères, et jusqu'à 90% de ceux de certaines plantes. Ceci montre que ces éléments sont relativement bien tolérés.

La question est de savoir quel peut être le bénéfice pour l'hôte dans cette prolifération. On peut commencer à aborder cette question en comparant les génomes actuellement séquencés. C'est ce se propose de faire HH Kazazian; Science 303 (12MAR04) 1626-1632. Il se concentre sur le cas des mammifères. Il souligne les lacunes de nos connaissances à propos des rétrotransposons des mammifères.

3. La cellule doit, à la fois, répliquer fidèlement le génome (mais cela coûte cher, comme dans l'industrie, de vérifier et corriger les erreurs de fabrication), et tolérer les imperfections pour assurer d'autres fonctions. C'est notamment le cas de certaines polymérases laxistes de l'ADN, qui assurent la réparation des ADNs endommagés. La création d'erreurs au cours de ce processus peut être utilisée pour engendrer une variabilité génétique, ce que certains utilisent pour améliorer des protéines avec la PCR où on encourage vivement les erreurs pour obtenir des protéines que l'on crible ensuite pour une fonction donnée ou améliorée.

La revue d'AJ Rattray et al.; Annual Review of Genetics 37 (DEC03) 31-66, se penche sur ces fonctions adventices du système polymérasique. L'auteur souligne que le nom d'"error prone polymerases" est une injustice à leur égard, car cela suppose que d'autres feraient mieux (mais pas la même chose). Les auteurs soulignent, à juste titre, l'anarchie régnant dans les dénominations des ces polymérases.

Ces polymérases font, certes, des erreurs quand on leur demande (au laboratoire) de copier un ADN intact (mais la cellule ne les convoque pas dans ce cas), mais elle sont capables de relayer une polymérase fidèle quand celle-ci s'interroge devant une lésion, et s'arrête de fonctionner. Un génome humain perd environ 10 000 bases par jour uniquement par hydrolyse de la liaison glycosyle, sans parler des dimères de pyrimidines collectionnés aux sports d'hiver ou sur la plage. Or il ne subsiste qu'une seule modification de nucléotide par division.

Certaines de ces polymérases sont, en effet, dédiées au franchissement des lésions, ce qui suppose deux choses: d'abord qu'elles n'aient pas d'états d'âme et ne soient pas arrêtées au niveau de la fourche bloquée et, ensuite, de reconnaître le brin endommagé de celui qui est intact, pour ne pas copier l'erreur cause de ces émois.

Le problème est donc celui de la convocation de la bonne "réparase", car il en existe plusieurs s'attaquant à des lésions différentes. Il existe, cependant, des redondances fort utiles et des utilisations différentes dans les divers tissus du corps, ce qui pose des questions de régulation. Ainsi, chez Escherichia coli, Pol II, Pol IV et Pol V sont exprimées en permanence, mais à bas bruit. La transcirption de leurs gènes est lancée par la réponse SOS bien connue aux dommages de l'ADN. Elle a lieu quand RecA se lie à de l'ADN simple-brin (signal d'une coupure) et est alors activée (RecA*). RecA* se lie au répresseur de LexA entraînant l'auto-clivage de LexA. En temps normal, LexA réprime ces transcriptions, mais son inactivation induit l'expression de plus de 30 gènes de réparation. Mais il faut éviter leur activité quand cela n'est pas nécessaire (ce qui induirait des mutations non souhaitables quand on vient d'en éliminer une).

PolV est composée de la sous-unité UmuC catalytique et deux sous-unités UmuD (activées par clivage sous le nom d'UmuD'2 par la même RecA*, sinon elles ne peuvent s'assembler avec UmuC). Ces deux protéines sont éliminées par la protéase bien connue LonA, tandis qu'UmuD' est rapidement éliminée par la protéase ClpXP. Tout ceci fait que l'on n'a suffisamment de PolV que quand RecA* est présente et, donc, qu'une lésion a été détectée.

4. La méiose suppose un comportement particulier des centromères chromosomiques lors des deux divisions successives. Lors de la première division, ce sont les chromosomes homologues qui se séparent, et les centromères doivent rester cohésifs. A la seconde, ce sont les chromatides résultant de l'unique cycle de réplication qui se séparent et les centromères doivent perdre leur cohésion. AL Marston et al.; Science 303 (05MAR04) 1367-1370 décrivent les résultats d'un criblage général du génome de la levure Saccharomyces cerevisiae ayant pour objectif d'identifier les gènes intervenant dans cette cohésion. Ils ont utilisé des souches dépourvues de tous les gènes non essentiels.

Ils ont, ainsi, caractérisé les gènes Sgo1, Chl4 et Iml3 qui interviennent dans cette cohésion jusqu'au début de l'anaphase II, après quoi celle-ci peut se dérouler, car la cohésion n'est plus maintenue.

5. On n'a pas fini d'entendre parler de l'interférence ARN, probablement et pour un moment à juste titre. On sait détecter la présence de ces petits ARNs, mais beaucoup moins leurs cibles, ce qui est le plus intéressant.

JG Doench et al.; Genes & Development 18 (01MAR04) 504-511, montrent que ce sont les huit premiers nucléotides amont qui conditionnent la reconnaissance du messager dont la traduction va être inhibée. Ils examinent la thermodynamique de cette interaction, mais elle n'explique pas tout. Ils indiquent, par ailleurs, que le même messager peut être neutralisé de cette manière) par plusieurs miRNAs.

6. On trouvera, par ailleurs dans A Reynolds et al.; Nature Biotechnology 22 (MAR04) 326-330, un article sur la construction rationnelle de siRNAs adaptés aux besoins par des chercheurs de la firme Dharmacon.

L'interférence ARN (RNAi) implique plusieurs interactions ARN/protéines. Quatre étapes ont été caractérisées avec : l'interaction siRNA avec le complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex, voir le Bulletin de décembre 2003 §12), activation de RISC, reconnaissance du messager cible et destruction de ce messager. Mais faut-il, encore, que le siRNA reconnaissent le bon brin et avec efficacité. La cible est bien un seul brin, mais les siRNAs dérivent d'ARNs doubles brins, le mieux serait que celui qui est majoritaire soit bien le complément du messager. Les auteurs ont recherché comment, dans cette cascade, améliorer le rendement.

Ils ont construit 180 siRNAs ciblant une partie des messagers de deux gènes, celui de la luciférase de la luciole et celui de la cyclophiline B humaine. Ils ont, ainsi, décelé huit critères qui permettent une efficacité importante, indépendamment d'une structure éventuelle de la cible mRNA, ce qui est différent de ce qui se passe pour les antisens où la cible doit être accessible et dépend donc de la conformation du messager. L'addition de tous ces critères entraîne que la probabilité d'obtenir des siRNAs très efficaces est faible.

Un des critères fait intervenir la présence ou non de répétitions internes dans le siRNA qui risquent de donner lieu à la formation d'épingle à cheveux. Il est alors nécessaire d'obtenir des épingles instables. Une faible teneur en G/C est également indispensable, ainsi qu'une faible stabilité interne de l'extrémité 3' dans le brin sens (donc 5' pour l'extrémité antisens).

7. L'utilisation des siRNAs peut entraîner une réponse parallèle, et non spécifique de séquences, des interférons a/b dans les cellules de Mammifères, ce qui risque de compliquer les interprétations de l'interférence ARN dans les opérations de "knock-down". Cela est vrai dans le cas de siRNAs transcrits in vitro par des polymérases du phage T7, mais pas dans celui des siRNAs synthétisés "chimiquement". DH Kim et al. Nature Biotechnology 22 (MAR04) 319–323, analysent le rôle de l'extrémité 5' triphosphate (pppGGG amont) du siRNA obtenu par polymérases de phages dans l'induction de l'interféron. L'ablation du triphosphate diminue très sensiblement l'induction des interférons. Ceci devrait permettre de tourner cette difficulté dans l'interprétation. Lire également le commentaire de CE Samuel; p.280-282. Des ARNs simple brins transcrits par les polymérases de T3, T7 et Sp6 induisent également la production des interférons a/b.

8. Des localisations cytoplasmiques asymétriques de messagers entraînent des concentrations locales des protéines codées qui peuvent être critiques pour un processus biologique donné. Pour obtenir cet effet, démontré dans le changement de type sexuel ou dans les synapses, les transcrits doivent être muets durant leur transport jusqu'au site de traduction précis (et au moment) où ils seront utiles et traduits.

L'axe embryonnaire de Drosophila est un cas bien connu de coordination temporelle et spatiale de la localisation des messagers au cours du développement. Le messager de bicoid (bcd) code le morphogène primaire antérieur qui est déposé dans la partie antérieure de l'ovocyte. Mais, comme pas mal de messagers maternels, il n'est traduit qu'après l'activation de l'œuf lors de la fécondation, moment où il est polyadénylé (dans le cytoplasme).

La localisation asymétrique du messager d'oskar (osk) est inverse, dans la partie postérieure de l'ovocyte. Il est transcrit durant toute l'ovogenèse, mais traduit uniquement après son transport dans cette partie au milieu de la différenciation de l'ovocyte. Il sera alors indispensable à la formation du cytoplasme germinal polaire de l'œuf. La répression traductionnelle d'osk est assurée par des éléments aval du gène dans la partie 3' non traduite reconnue par la protéine Bruno qui intervient également dans la répression traductionnelle en coopération avec Cup.

Contrairement aux messagers de bcd et osk, celui de gurken (grk) est traduit durant toute l'ovogenèse et gère deux voies spatialement et temporellement distinctes de signalisation grâce à un TGFb spécifiant les axes antéropostérieur (A/P) et dorsoventral (D/V). On assiste à une cascade de signaux au sein de l'ovocyte, mais à la suite d'interactions avec les cellules folliculaires adjacentes.

Durant le début de l'ovogenèse les microtubules provenant de la partie postérieure tirent le messager de grk et la protéine correspondante Grk vers la partie postérieure. Grk induit les cellules folliculaires à commander la différenciation postérieure de l'ovocyte, ce qui, finalement restructure le cytosquelette des microtubules. A la suite de cette réorganisation le messager de grk se place dans la partie antérodorsale de l'ovocyte et Grk déclenche la différenciation dorsale des cellules folliculaires adjacentes.

On vient de montrer que le gène armitage (armi) participe à la fois à ce ballet et à la répression de la traduction du messager d'osk au début de l'ovogenèse, ainsi qu'à sa localisation à la mi-ovogenèse. Le gène armi code une ARN hélicase potentielle ressemblant à SDE3, requise pour le PTGS (PostTranscriptional Gene Silencing) d'Arabidopsis. HA Cook et al.; Cell 116 (19MAR04) 817-829.

Ce mécanisme utilisé par les plantes pour lutter contre les virus est un mécanisme de "silencing" conservé apparenté à l'interférence ARN. Or armi est également impliqué dans cette interférence dans les ovaires en permettant le montage du complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Y Tomari et al.; Cell 116 (19MAR04) 831-841.

L'interférence ARN est donc indispensable à l'initiation des axes embryonnaires. Les cellules germinales mêles de drosophiles mutantes pour armi n'arrivent pas à bloquer l'expression de Stellate, qui est normalement régulé par interférence ARN, et les lysats d'ovaires ne présentent pas de complexe RISC actif.

Il faudrait pouvoir identifier leurs cibles dans le génome. Ce que l'on n'a pas encore pu faire. Chez les plantes, la complémentarité presque parfaite des séquences cibles et des miRNAs a facilité une détection informatique des cibles. De plus le mécanisme le plus fréquent est alors une destruction des messagers. Le mécanisme le plus fréquent est alors une destruction des messagers. Les génomes animaux séquencés abondent en séquence codant des miRNAs. L'appariement n'est pas parfait ce qui gêne l'approche informatique. Beaucoup d'entre eux semblent, d'ailleurs, plutôt réguler la traduction des messagers d'autres gènes en se liant à eux. N Rajewsky et al.; Developmental Biology 267 (15MAR04) 529-535 décrivent une technique informatique permettant de le faire. Les auteurs ont vérifié qu'elle permet bien de détecter les cibles expérimentalement connues.

Leur modèle utilise les composantes cinétiques et thermodynamiques de la reconnaissance. En analysant les séquences conservées de Drosophila melanogaster et D.pseudoobscura, ils prévoient que l'expression de deux gènes importants dans le développement, hairy et fushi-tarazu sont très probablement régulés traductionnellement par des microRNAs.

9. La possibilité de faire pénétrer des peptides fonctionnels à travers la membrane plasmique avec une efficacité suffisante serait intéressante. Il est possible de réaliser cette opération en couplant la cargaison avec la partie hydrophobe du peptide signal de protéines sécrétées. On vient de montrer qu'il est fort possible d'utiliser de telles séquences uniquement avec des acides aminés D avec une efficacité identique à celle avec des acides aminés L. RA Veach et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (19MAR04) 11425-11431.

Cela fonctionne même sur des vésicules monolamellaires phospholipidiques, ce qui indique que le mécanisme ne fait pas intervenir des transporteurs associés à des récepteurs.

10. La sécrétion des protéines est liée à leur repliement et à leur assemblage correct dans la lumière du réticulum. Ce stade est surveillé par la cellule et on a démontré que le rythme d'acquisition de la conformation finale dans le réticulum endoplasmique a un effet sur la traduction en amont, plusieurs cascades intervenant dans cette interaction. Une revue sur ces interactions est parue avec RJ Kaufman; Trends in Biochemical Sciences 29 (MAR04) 152-158.

Lors d'un stress lié à une surcharge de ces capacités du réticulum, on a inhibition de l'initiation de la traduction. La surcharge est captée par IRE1 (Inositol-REquiring 1), PERK (dsRNA-activated protein kinase-like endoplasmic réticulum kinase) et ATF6 (Activating Transcription Factor 6) possédant, tous, un domaine luminal détectant les protéines restées déroulées.

 L'"atténuation" de la traduction fait intervenir une phosphorylation de la sous-unité a d'eIF2 (eukaryotic Initiation Factor 2) hétérotrimérique. Le complexe ternaire eIF2–GTP–tRNAMet transfère le méthionyle tRNA à la sous-unité ribosomale 40S et permet la détection de l'AUG initiateur lors du balayage du messager par cette sous-unité. Lors du montage de la sous-unité ribosomale 60S, le GTP est hydrolysé en GDP. Le GDP lié à eIF2 nécessite une substitution par du GTP dans une réaction facilitée par eIF2B. Or si eIF2a est phosphorylé au niveau de la Ser51 par PERK, il n'y a pas substitution, et eIF2B est bloqué dans le complexe avec eIF2. Comme eIF2B est 10 à 20 fois moins abondant qu'eIF2, une très petite augmentation de la phosphorylation d'eIF2a séquestre eIF2 dans un complexe avec eIF2B et réduit l'efficacité de la reconnaissance de l'AUG initiateur. Cette phosphorylation peut, de ce fait, entraîner l'utilisation d'AUG alternatifs et donner des produits pleine longueur, tronqués où (à la suite de décalage de phase) des protéines alternatives. Celà dépend de la phosphorylation ou non d'eIF2a mais aussi de séquences ou de structures amont du messager qui favorise l'utilisation d'AUG particuliers. On a donc une modification quantitative, mais aussi qualitative de la traduction.

11. La ß-caténine est une protéine multifonctionnelle assurant au moins deux fonctions : l'adhésion intercellulaire et l'activation de la cascade Wnt. On vient de montrer que cette protéine assure une troisième fonction : l'orientation bipolaire du fuseau mitotique. DD Kaplan et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (19MAR04) 10829-10832.

12. On trouvera, dans SL Forsburg; Microbiology & Molecular Biology Reviews 68 (MAR04) 109–131, une revue sur les fonctions des protéines MCM (MiniChromosome Maintenance). Celles-ci ont été identifiées aux débuts des années 80s chez Saccharomyces cerevisiae, et on leur a, alors, attribué un rôle dans l'initiation de la réplication des ADNs. On a, depuis, montré qu'elles ont également un rôle d'hélicase au cours de l'élongation. On a, enfin, montré qu'elles ont de multiples rôles additionnels dans la transcription, le remodelage de la chromatine et la stabilité du génome. On retrouve là une constatation faite à propos de nombreuses autres protéines du cycle cellulaire qui cumulent de multiples fonctions.

Comme les noms de ces protéines sont modifiés au fur et à mesure qu'on décrit leurs fonctions additionnelles, un tableau des synonymies n'est pas de trop et figure dans la revue.

13. Les méthodes de microscopie et de spectroscopie par fluorescence se répandent et se raffinent actuellement. Un article de KM Berland Journal of Biotechnology 108 (APR04) 127-136, passe en revue les progrès récents dans le domaine, plus particulièrement les techniques d'analyse des molécules individuelles (voir le chapitre méthodes de l'article) et apporte des perfectionnement.

La FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) est un outil puissant de ce type qui permet de caractériser et quantifier les interactions moléculaires, les réactions chimiques, l'hydrodynamique et les propriétés photophysiques d'ensembles biologiques complexes.

Un des aspects est l'utilisation de la mesure de la corrélation croisée de fluorescence avec des marqueurs fluorescents différents pour chacun des intervenants (deux pour l'instant). On peut ajuster la sensibilité de la technique pour focaliser la mesure sur des interactions moléculaires particulières en minimisant la contribution des autres signaux.

L'article cité montre qu'on peut détecter des espèces moléculaires particulières qui ne nécessitent pas un marqueur fluorescent. Les auteurs ont appliqué une technique à deux photons pour détecter un ADN simple brin codant la g-tubuline. On savait le faire depuis 1994 pour des ADNs. On devrait pouvoir étendre les applications pour quantifier l'assemblage de protéines ou d'ADN/protéine dans des complexes in vivo ou in vitro.

La FCS peut détecter les interactions par le biais de changements de mobilité après interaction (comme on peut le faire avec la polarisation de fluorescence classique), ou en mesurant la concentration des molécules. Cette dernière est divisée par deux quand deux molécules monomères s'assemblent en un dimère, par exemple. Contrairement à ce qui se passe dans le cas d'une utilisation de la polarisation de fluorescence, on n'a que peu de contraintes de taille des molécules, et la mesure est moins sensible aux effet du milieu de mesure.

Les mesures d'autocorrélation et de corrélation croisée de fluorescence classique sont calculées à partir de la fluctuation. Dans le cas d'une espèce moléculaire monodisperse, l'amplitude des fonctions de corrélation est inversement proportionnelle à la concentration des espèces présentes. Pour des systèmes avec de nombreuses espèces fluorescentes, il devient difficile à la FCS de quantifier les concentrations individuelles.

Avec la technique de FCS à deux couleurs utilisées par les auteurs, on mesure les interactions entre deux molécules marquées par deux fluorophores différents. On sépare les mesures avec deux canaux accordés sur les deux longueurs d'onde. On se débarrasse de toutes les corrélations croisées dues aux molécules isolées, et une molécule n'est plus détectée que si les deux canaux perçoivent l'interaction entre les deux molécules marquées par deux fluorophores différents .

Les composants isolés ne contribuent plus à la corrélation croisée, sinon pour un facteur constant que l'on peut calibrer.

Les auteurs ont amélioré la technique en se servant des deux molécules marquées pour détecter une troisième molécule non marquée, ce qui en constitue l'originalité.

Deux oligomères du gène de la g-tubuline choisis pour leur faible propension à la dimérisation (et à la formation d'épingle à cheveux) ont été respectivement marqués par le Cy3.5, et l'Oregon Green 488. Les deux sondes hybrident avec deux segments distincts du gène qui n'a pas besoin d'être marqué.

Les Productions Végétales

Les gènes et les génomes

14. Le numéro d'Avril de Current Opinion in Plant Biology est consacré à la complexité des génomes végétaux. Le début de la génomique des plantes date d'à peine 6 ans et la séquence complète d' Arabidopsis était l'objectif principal. On pensait, en effet, que la conservation des gènes était suffisante pour que ce modèle permette aborder l'ensemble des plantes supérieures. C'était compréhensible, vu l'état des techniques qui rendait inabordable le séquençage des génomes de plantes comme les céréales. On abordait le problème d'une façon différente, en utilisant seulement les séquences exprimées par le biais des ESTs (Expressed Sequence Tags et en analysant les synténies entre familles (ordre conservé des gènes). Mais le génome du riz a été un premier pas vers ceux des céréales en général.

Arabidopsis est bien un modèle générique pour les fonctions, mais est moins généralisable pour le nombre des gènes, ainsi que la conservation de leurs liaisons dans le génome. Pendant ce temps le coût des séquences a considérablement baissé et la qualité des séquences s'est beaucoup améliorée. On a donc attaqué des séquences beaucoup plus grosses et complexes, ainsi que la comparaison de multiples génotypes d'une même espèce ou d'espèces apparentées. Par ailleurs, les organismes liés aux plantes comme les pathogènes ainsi que les symbiotes sont parallèlement séquencés. Les approches évolutives ont maintenant du grain à moudre autrement que par spéculations intellectuelles.

La génomique fonctionnelle a rapidement démarré de façon variées avec d'une part l'inactivation des gènes [par exemple par TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes), ou par mutagenèse insertionnelle systématique par des T-DNA, ou par blocage de leur expression (par exemple par interférence ARN ou RNAi).

Là aussi l'analyse de la variabilité génétique et la distinction entre variation adaptative et dérive génétique (aléatoire) est maintenant abordée. Ceci rend intéressant les approches de génomique des populations, même dans espèces très difficiles sur le plan génétique comme le pin de Douglas. Cela devrait également faciliter l'épuration des génomes des plantes cultivées et l'amélioration des plantes, ainsi qu'une meilleure caractérisation des landraces et des gènes à conserver dans une région donnée. Le génotypage à haut débit est, d'ailleurs, en train de se mettre en place.

On ne manque pas de gènes végétaux pouvant être intéressants. Il faut maintenant choisir ceux qui pourraient être utilisés avec succès. La génomique est un des outils pour valider des fonctions. Des chercheurs de Mendel Biotechnology développent un exemple avec les C-box binding factors (CBFs) permettant une plus grande résistance au gel et à la sécheresse. N Gutterson et al.; Current Opinion in Plant Biology 7 (APR04) 226–230.

RA Martienssen et al.; p.102–107 décrivent les avantages et inconvénients des diverses approches du génome bigrement complexe et fluide du maïs. Les stratégies d'enrichissement comme la filtration des zones méthylées et des zones à fort Cot permettent d'isoler la majorité des gènes, sont meilleur marché que l'approche Bac par Bac.

AE Hall et al., p.108–114 s'intéressent aux régions complexes du génome d'Arabidopsis comme les centromères et télomères. La génomique comparée permet maintenant de mieux comprendre les interactions entre séquences de ces régions et les protéines qui les reconnaissent ainsi que les conséquences de ces interactions, puis de vérifier expérimentalement leurs fonctions sur des minichromosomes.

N Jiang et al.; p.115–119 s'intéressent aux MITEs (Miniature Inverted Repeat Transposable Elements), ces courts éléments répétés découverts il y a longtemps chez les céréales. On vient de révéler que ces éléments, pourtant non autonomes, peuvent s'exciser et se réinsérer, participant ainsi à l'évolution d'un génome comme celui du riz.

On sait maintenant qu'en dehors des gènes codant des protéines ou des ARNs fonctionnels, il existe de multiples gènes codant des petits ARNs régulateurs. AC Mallory et al.; p.120–125 (avec Vaucheret de l'INRA qui a beaucoup contribué à l'émergence de ce domaine) passent en revue les progrès faits dans le domaine de la connaissance des petits ARNs non codant.

M Delseny; p.126–131 examine la question de l'ordre des gènes chez les végétaux. Cette conservation semble maintenant être une exception plutôt que la règle. Ceci est en partie lié à la duplication des génomes, bien admise dans le cas d'Arabidopsis, mais qui a, probablement, également eu lieu chez beaucoup d'autres plantes. Cette duplication a été suivie par des réarrangements qui ont brouillé les pistes, d'autant que les divergences (notamment de fonctions) ou les délétions dans les régions dupliquées ont accru le désarroi du généticien.

Malheureusement, cette plasticité du génome empêche souvent les comparaisons, même à des distances phylogéniques relativement faibles. Il faut donc bien choisir les espèces modèles pour se placer dans une situation la moins brouillée possible, et pouvoir extrapoler aux plantes phylogéniquement voisines.

JO Borevitz et al.; p.132–136 traitent des avancées récentes dans le domaine de l'analyse des caractères quantitatifs. L'objectif d'une cartographie des QTLs est de déterminer les loci intervenant dans la variation de caractères complexes et quantitatifs. L'étape limitante dans la cartographie des QTLs passe maintenant plus par l'analyse des phénotypes, les catalogues de génotypes étant maintenant bien fournis.

Que ce soit pour élucider les bases moléculaires de caractères complexes, ou les combiner dans un programme d'amélioration, il faut pouvoir prévoir comment l'environnement module l'expression des caractères quantitatifs. Dans certaines situations la détermination du nombre, la localisation et les interactions entre ces loci est l'objectif. Cela permet de les rassembler dans des lignées dites d'"élite". C'est pourquoi la mesure des effets de l'environnement sur leur expression fait partie de l'adaptation des lignées à une région de cultures donnée, un QTL n'étant, en principe, valable que dans des conditions environnementales données. Cela faciliterait la caractérisation et l'utilisation des "accessions" naturelles (ce terme est détestable et signifie n'importe quel échantillon d'une plante).

Il est cependant plus intéressant de cloner ces gènes pour savoir ce qu'ils codent et déterminer leur fonction, plutôt que de se contenter de mesurer leur contribution au phénotype. On a donc à cloner les gènes importants du locus.

Plusieurs techniques à haut débit transférant la charge de la cartographie des QTLs vers la collection des informations sur le phénotype sont maintenant utilisées en routine. La revue décrit les outils (y compris les réseaux) de la génomique de la cartographie des QTLs et leur clonage chez Arabidopsis. Les auteurs analyse ce que l'on peut tirer des synténies et des ESTs, à défaut de séquences génomiques complètes.

A Puhler et al.; p.137–147 s'intéressent aux génomes des microbes associés aux plantes, ce qui est quand même plus simple (on dit, maintenant, avec quelque exagération, qu'une séquence complète d'une bactérie, c'est une après-midi de travail). L'interprétation et l'annotation des gènes sont un peu plus complexes, mais on dispose maintenant de beaucoup de points d'appuis avec les nombreuses autres séquences connues.

Les auteurs s'intéressent, évidemment plus à l'élucidation, par ce moyen, des interactions entre ces deux types d'organismes qu'aux séquences proprement dites. La liste des gènes intervenants putatifs va en croissant. Il faut maintenant établir leur fonction exacte par des techniques de mutations à haut débit.

L'une des découvertes intéressantes réside dans le fait que les systèmes de sécrétion dits de type III (qui injectent dans la cellules hôte des composants bactériens facilitant la colonisation chez les pathogènes animaux comme végétaux), sont également présents chez les symbiotes et même des bactéries considérées comme non pathogènes, mais associées à des organismes eucaryotes.

15. On sait que la transposition d'un élément mobile peut entraîner des réarrangements dans le génome. On utilise pourtant abondamment l'élément Ds (Dissociation) dans la mutagenèse insertionnelle chez Arabidopsis. On vient de montrer qu'un élément Ds hybride entraîne de larges délétions flanquant l'élément.

Les mutants anat et haumea résultent d'une transposition locale de Ds de l'ADN répliqué vers l'ADN non répliqué, suivi d'une excision de Ds, où une extrémité de l'élément fraîchement transposé et une extrémité de Ds au site donneur constituent le substrat de la transposase, créant un élément hybride qui, à l'excision, emporte le segment chromosomique entre les deux sites avec l'élément Ds complet flanqué des deux segments chromosomiques flanquants.

On peut de la sorte avoir excision au voisinage de n'importe quel élément Ds inséré dans le génome. DR Page et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (02MAR04) 2969-2974. De telles insertions et excisions d'élément hybrides ont été décrites pour l'élément P de Drosophila ou Tam3 d'Antirrhinum.

16. L'infection du tabac par les virus de la mosaïque du tabac (TMV) ou celui de l' oilseed rape mosaic virus du colza engendre une vague de recombinaisons (un triplement) dans la plante grâce à un signal qui est transporté en avant de la vague d'infection. On retrouve, curieusement, cet accroissement dans les descendants des plantes infectées? Est-ce une adaptation héritable à l'environnement? C'est une facette de plus du problème, abondamment débattu depuis plusieurs années des mutations naturelles "adaptatives". Cela est discuté dans la revue de X Dong; Trends in Plant Science 9 (FEB04) 60-61 qui exploite une publication de I Kovalchuk et al.; Nature 423 (12JUN03) 760–762.

Le groupe de Barbara Hohn avait montré que l'infection par l'oomycète Peronospora parasitica avait le même effet dans des cellules somatiques de plantes. Les auteurs de l'article commenté ont montré que le signal déclenchant ces réarrangements génomiques était systémique (généralisé dans la plante). Il fonctionne dans les cellules somatiques mais aussi, probablement, méiotiques du fait du caractère héritable. Ces derniers auteurs ont utilisé un tabac transgénique porteur des extrémités 5' et 3' du gène de la luciférase. Ces deux segments se recouvrent au milieu du gène de sorte que s'il y a recombinaison, on observe l'activité enzymatique. Ils ont fait la même chose avec un gène gouvernant le nombre des chloroplastes.

Le produit du gène N reconnaît la présence du TMV, ce qui entraîne la réponse hypersensible à 22°C. Mais, à cette température, aucun accroissement du taux de recombinaisons homologues n'est détecté. Cette résistance sombre au dessus de 30°C et c'est alors qu'on constate le triplement du taux de recombinaison. Il faut donc que l'infection se déroule convenablement.

Il faut, dans ces conditions 24–36 h pour que le virus se répande dans la plante, alors que la recombinaison se déclenche 8 heures après l'inoculation. C'est pourquoi les auteurs estiment que le signal précède le virus dans la plante. Ils ont également pu le confirmer par des expériences de greffe de feuilles infectées ou pas.

Ce signal n'est pas encore identifié (pas plus que celui de la résistance systémique acquise ou SAR) et semble indépendant de la fonction du gène N qui est, lui, nécessaire à la réponse SAR au TMV. Ceci est curieux car, chez Arabidopsis l'accroissement des recombinaisons est observé sous l'action d'une forme avirulente de Peronospora parasitica ou des inducteurs chimiques de la SAR, l'acide 2,6-dichloroisonicotinique et le benzothiadiazole. On l'observe également chez les mutants cim3 où la SAR est active en permanence. Les raisons de cette discordance restent à établir.

L'effet global probable de ces recombinaisons doit porter, en particulier, sur les paquets de gènes de résistance R et modifier leur spécificité de reconnaissance.

17. Les cultivars actuels du blé tendre (Triticum aestivum, hexaploïde) présentent un faible polymorphisme, ce qui ne facilite pas l'analyse du génome assistée par marqueurs. Il faudrait donc disposer de méthodes appropriées permettant de détecter des différences entre lignées très proches.

Des chercheurs de la Plant Research Unit, University of Dundee, associé à ceux de Monsanto GB ont utilisé des marqueurs SSAP (Sequence-Specific Amplification Polymorphism) déjà utilisés chez plusieurs graminées ainsi que chez des Légumineuses. RA Queen et al.; Molecular Genetics & Genomics 271 (FEB04) 91-97. Ici ces marqueurs sont des rétrotransposons (BARE-1 (de l'orge)/Wis-2-1A (du blé), mais aussi de Thv19, Tagermina et Tar1 (du blé) pour étudier systématiquement le polymorphisme d'insertion dans le génome. Les auteurs ont examiné des blés tendres et les parents sauvages avec des blés di- et tétraploïdes. Cet article est un développement d'un poster présenté en 2002 à la Plant, Animal & Microbe Genomes X Conference à San Diego. Tagermina et Tar1 ont manifestement été nettement plus actifs dans un passé évolutivement récent, et ces marqueurs sont probablement les plus utiles dans le cas du blé.

18. Les Aegilops (ancêtres du blé, ayant contribué aux génomes B et D) comportent des espèces diploïdes, tétraploïdes et hexaploïdes. Les génomes chloroplastiques et nucléaires des Aegilops ont évolué de façon discordante. Ceci a été démontré à l'ICARDA d'Alep par utilisation de l'AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). T Sasanuma et al.; Theoretical & Applied Genetics 108 (FEB04) 612–618.

19. Le melon est encore un organisme génétiquement très peu connu. Les croisements entre Cucumis melo et les Cucumis sauvages sont stériles, ce qui ne facilite pas les choses. On en connaît une centaine de gènes, mais presqu'aucune régulation. Il existe pourtant une très grande variabilité phénotypique. Elle est vraisemblablement due à de multiples allèles au sein de nombreux QTLs (Quantitative Traits Loci). L'analyse de ces QTLs nécessite la connaissance de nombreux marqueurs cartographiés. Ce n'est pas encore le cas pour le melon mais on avance dans ce sens. Des chercheurs espagnols ont identifié des QTLs de la "qualité" du melon en utilisant un croisement entre le cultivar ‘Piel de Sapo’ et une accession coréenne qui est un des croisements les plus éloignés possibles sans perdre la fertilité. AJ Monforte et al.; Theoretical & Applied Genetics 108 (FEB04) 750–758. L'analyse a été pratiquée sur un F2 et des haploïdes doublés. Les auteurs envisagent la précocité, la forme, le poids et la teneur en sucre, mais aussi la couleur externe et de la chair. La couleur externe est manifestement l'objet d'une régulation complexe avec au moins deux loci dont l'un a pu être localisé dans le groupe de liaison 9 (vraisemblable chromosome) avec des interactions épistatiques entre les deux.

20. B Mikki et al.; Journal of Biotechnology 107 (FEB04) 193–232, s'intéressent aux marqueurs utilisables dans la sélection des plants transgéniques, y compris sous leurs aspects "sécurité". On en utilise une cinquantaine.

Les marqueurs donnant lieu à une sélection positive sont ceux qui donne un avantage de croissance aux tissus transformés. Ceux donnant lieu à une sélection négative entraînent une destruction des mêmes tissus.

Les premiers marqueurs sélectifs positifs utilisés ont été ceux qui confèrent une tolérance à des agents toxiques (antibiotiques, herbicides ou autres substances toxiques) qui ont soulevé bien des polémiques, certaines justifiées, d'autres moins. Sont, ensuite, apparus des marqueurs conférant une capacité à croître sur une substance donnée, ou induisant la croissance en présence de ces substances. De nouvelles stratégies, ne dépendant pas forcément de l'addition de substances exogènes, mais modifiant certains processus physiologiques se font jour. Les gènes marqueurs en font partie

Mais, pour des raisons techniques mais aussi économiques (les criblages sont coûteux), seuls un tout petit nombre de marqueurs ont encore été utilisés. Beaucoup de ces gènes ont des limitations spécifiques ou n'ont pas été encore suffisamment essayés pour qu'on leur fasse confiance. Même en recherche, un seul marqueur polyvalent n'existe pas et c'est une batterie de marqueurs différents qui est utile. Par ailleurs, comme il est extrêmement coûteux de prouver qu'un marqueur n'est pas dangereux, il vaut mieux l'éliminer dès qu'il ne présente plus d'intérêt. Deux techniques sont utilisables, l'une consiste à co-transformer la plante avec deux transgènes (l'un est celui à perpétuer et l'autre sert à la sélection) qu'on disjoint par ségrégation, ce qui est, en principe, trivial. On peut se compliquer la tâche en utilisant les recombinaisons sites-spécifiques. C'est compliqué au niveau du montage, mais aussi sur le plan de la propriété industrielle car les systèmes les plus efficaces sont, à ma connaissance, solidement brevetés.

Le développement

21. On trouvera dans S Kessler et al.; Current Opinion in Plant Biology 7 (FEB04) 65-72, une revue sur la régulation de la morphologie foliaire. La revue de B Veit; p. 57-64, s'intéresse, d'une façon plus générale à la détermination des cellules méristématiques apicales, racinaires comme caulinaires.

L'initiation des feuilles autour du méristème caulinaire apical (SAM) implique un équilibre entre prolifération cellulaire et détermination des primordia foliaires. Les gènes CLAVATA1, CLAVATA3, WUSCHEL, KNOTTED1 ainsi que PHANTASTICA, interviennent à ce niveau. Les gènes KNOTTED1-like agissent, de plus, en modifiant les équilibres hormonaux.

Le SAM comporte la tunica (L1–L2), avec des divisions essentiellement anticlinales qui augmentent la surface et le corpus (L3, le cœur du méristème) avec des divisions dans tous les sens qui en augmente le volume. Pour ceux qui souhaitent plus d'informations voir la revue claire de JC Fletcher; BioEssays 24 (JAN02) 27-37.

Ces zones ne sont en réalité pas strictement délimitées et, de plus, on constate la superposition d'une autre organisation avec les zones (ou domaines) centrale, périphérique et la Rib Zone (je ne sais pas traduire) située juste sous la zone centrale et enveloppé comme elle par la zone périphérique.

 L1 (va donner l'épiderme) tandis que les autres couches vont donner le reste de la plante. Les primordia foliaires sont initiés dans la zone périphérique.

Le maintien du méristème apical caulinaire (SAM) dépend de plusieurs gènes. CLAVATA1 (CLV1) code un récepteur kinase riche en leucines exprimé dans la zone centrale. CLV3 est probablement le ligand de CLV1. WUSCHEL (WUS), est une protéine à homéodomaine exprimée dans un petit groupe de cellules du domaine central où elle régule la population des cellules indifférenciées apicales. On admet que WUS est l'organisateur du SAM régulé par les gènes CLV. CLV3 réprime à courte distance l'expression de WUS et limite la taille du SAM. En retour, le domaine produisant WUS induit la nature méristématique des cellules au dessus de lui.

CLV et WUS régulent donc la taille du méristème, tandis que les gènes KNOX (KNOTTED-like homeoboX), KNOTTED1 (KN1), SHOOTMERISTEMLESS1 (STM1), ROUGHSHEATH1 (RS1) et LeT6, maintiennent la nature méristématique de ces cellules.

Chez les plantes à feuilles les plus simples; les gènes KNOX1 sont exprimés dans le SAM, mais plus dans les primordia foliaires présomptifs (P0) et au delà. Ils contribuent donc à l'initiation de la feuille.

La protéine PHANTASTICA (PHAN d'Antirrhinum) à domaine MYB, et ses orthologues ROUGHSHEATH2 du maïs, ASYMETRIC LEAVES1 (AS1) d'Arabidopsis assurent la répression du gène KNOX1 dans les primordia foliaires. Inversement, STM et son orthologue de la tomate, LeT6, répriment l'expression de PHAN. Chez la tomate, LeT6 requiert pourtant PHAN pour son activité, c qui indique qu'un dosage des deux expressions est important pour leur fonction. Enfin il n'est pas impossible que CLV et WUS, de par leur interaction avec les gènes KNOX, puissent jouer un rôle dans l'initiation de la feuille.

Ces gènes normalement exprimés dans le SAM ont un effet sur la forme de la feuille s'ils continuent à être exprimés au delà de l'initiation. La surexpression des gènes KNOX1 dans la feuille de plantes à feuilles simples, comme Arabidopsis ou le Tabac, entraîne la formation de lobes par expansion différentielle des zones marginales où ils sont exprimés. Ils sont exprimés lors du développement des folioles de nombreuses plantes à feuilles composées, notamment la tomate.

Mais l'expression de ces gènes ne conduit pas obligatoirement à la formation de telles feuilles composées. Certaine feuille subissent une morphogenèse secondaire post-primordiale qui ramène à la forme simple en comblant les interlobes.

De plus certaines plantes, pourtant à feuilles composées comme le pois, n'expriment pas de gènes KNOX1. La mutation unifoliata du pois est causée par l'inactivation ou la délétion du gène PEAFLO (l'homologue de LEAFY/FLORICAULA). Ce gène est exprimé au début de l'initiation des primordia et cette expression se restreint aux régions distales du primordium de la feuille, amorce des folioles et vrilles. La perte de la fonction LEAFY/FLORICAULA entraîne l'indétermination de l'inflorescence et des méristèmes floraux chez Antirrhinum et Arabidopsis. La perte de la fonction PEAFLO chez les mutants unifoliata entraîne l'acquisition d'une phase transitoire d'indétermination de la feuille donnant une feuille unilobée.

Des mutations de PHAN chez Antirrhinum entraînent une perte de l'asymétrie dorsiventrale des feuilles et des organes floraux. Des mutants sévères de l'orthologue AS1 (ASYMMETRIC LEAVES1) de PHAN chez Arabidopsis donne des pétioles et des limbes foliaires de type Lotus dans le contexte génétique ERECTA. Les gènes de la famille PHAN doivent réguler l'élargissement du limbe foliaire et le placement des folioles dans les feuilles composées.

Bien d'autres protéines comme PHABULOSA (PHAB), PHAVOLUTA (PHAV) et REVOLUTA (REV) à homéodomaines ainsi que LATERAL ORGAN BOUNDARIES (LOB) exprimée du côté adaxial de la base des organes latéraux, ou YABBY et KANADI exprimées du côté abaxial, interviennent naturellement.

Comme ces gènes codent vraisemblablement des facteurs de transcription, il doit y avoir des intersections entre plusieurs voies liées à l'action d'autres voies de signalisation comme celles des hormones végétales. Ce qui a été démontré dans le cas des gènes KNOX qui interagissent avec les voies de l'acide gibbérellique (GA), des cytokinines et de l'auxine. Des inhibiteurs ou des mutations altérant les niveaux d'auxine ou sa perception affectent le développement du méristème apical racinaire (RAM). Des études récentes sur le maïs ont montré qu'il existe une co-localisation du centre quiescent (situé sous la columelle de la racine et qui constitue la réserve de cellules indifférenciées et donnant occasionnellement les colonnes de cellules qui vont se différencier) et du maximum de concentration d'auxine est une indication. Dans le SAM la situation est nettement plus confuse.

Contrairement à ce qui se passe dans le SAM, le RAM parait avoir un fonctionnement plus simple. Des files de cellules dérivent des cellules à divisions plus lentes du centre quiescent. Leur différenciation est peu perturbée par l'apparition des racines secondaires qui ne se forment que beaucoup plus tard et plus loin de l'apex. Par contre, l'organisation radiale apparaît suivre un schéma analogue pour les dérivés des deux apex. Le développement des cellules endodermiques sensibles à la gravité de la tige et de la racine fait intervenir, chez Arabidopsis, l'activation de SCARECROW (SCR) par SHORTROOT (SHR), qui sont, tous deux des facteurs de transcription GRAS (pour GAI, RGA, SCARECROW, rien à voir avec les organismes et molécules dites GRAS en alimentation). Comme le montre le cas des trichomes de la tige et, au contraire, des atrichoblastes de la racine (les cellules que la plante n'autorise pas à se différencier en poils absorbants), les deux voies convergent vers les mêmes cibles moléculaires avec des effets "opposés"

WUSCHEL (WUS) assure donc le rôle d'organisateur du SAM (méristème apical caulinaire). On ne sait cependant pas si ces cellules indifférenciées ont une capacité intrinsèque à donner des tissus de la tige, ou si elles le font sous l'influence de tissus déjà différenciés de la tige, comme le suggéraient des expériences d'ablation de cellules par irradiation laser, ainsi que des données génétiques. C'est un peu le problème général rencontré chez les cellules souches.

JL Gallois et al.; Genes & Development 18 (15FEB04) 375-380 viennent de montrer que l'expression de WUS dans la racine induit une identité caulinaire et la formation de feuilles sans autre intervention, un développement floral (en association avec LEAFY), ou une embryogenèse somatique en réponse à l'auxine. Ce gène induit donc bien l'identité caulinaire dans les cellules méristématiques, et les cellules souches de la zone centrale du méristème apical caulinaire (voir plus haut) doivent avoir, sous l'action de WUS une gamme intrinsèque fixée de déterminations possibles.

La Physiologie des Plantes

22. Un article de K Murase et al.; Science 303 (05MAR04) 1516-1519, apporte une contribution intéressante à la compréhension de l'auto-incompatibilité pollinique chez les Brassica.

Dans ce genre, l'incompatibilité repose sur la reconnaissance du ligand SP11(SCR) de la surface du pollen par un récepteur à kinase (SRK) des cellules du stigmate. La kinase lance alors une cascade de signaux dans le pistil qui aboutit à la réjection du pollen. Mais le seul élément connu, jusqu'à présent, de cette cascade est ARC1 (Arm Repeat Containing), une ubiquitine ligase E3. Murase et al. décrivent un nouvel acteur, la protéine kinase du locus M (MLPK). Ce qui est intéressant c'est qu'un récepteur à kinase collabore avec une kinase non réceptrice pour déclencher la cascade.

Le locus modifier (m) locus d'une variété de Brassica rapa permet une complète suppression de l'auto-incompatibilité, chez les plants m/m. Cependant le locus m ségrége indépendamment du locus S d'auto-incompatibilité (comprenant les gènes SCR et SRK). On pensait à l'époque (1983) que le locus m codait une aquaporine, ce qui a été ensuite infirmé en 1997. Murase et al.ont cloné le gène et identifié un mutant qui abolit la fonction kinase par absence de messager in planta. Les auteurs ont utilisé une expression transitoire dans les cellules du stigmate du gène normal MLPK qui restaure l'auto-incompatibilité chez les plants m/m. Il code une RLCK (Receptor-Like Cytoplasmic Kinase) c'est à dire une kinase ayant perdu le domaine récepteur extracellulaire et le domaine transmembranaire, tout en conservant l'ancrage membranaire par myristoylation, mais ayant conservé le reste c'est-à-dire le domaine kinase cytoplasmique.

23. Plusieurs revues et articles sur les mécanismes de la vernalisation sont récemment parus. Le froid empêche le développement des organes floraux qui y sont trop sensibles. La vernalisation lève cette inhibition. Ce phénomène, où une ambiance hivernale prolongée, est nécessaire pour permettre le déclenchement de la floraison (il faut passer l'hiver avant de fleurir efficacement) suppose deux choses: le stimulus froid doit d'abord être prolongé pour éviter de répondre à une épisode plus frais de l'automne, ensuite il faut garder en mémoire malgré des divisions et la remontée de la température, l'effet de ce stimulus.

Il faut bien distinguer l'acclimatation au froid, qui est une adaptation rapide au froid pour résister aux froids précoces de l'automne d'une part, de la vernalisation qui exige une longue période de froid (plusieurs semaines) pour s'établir d'autre part.

 Après les articles de S Sung et al.; Nature 427 (08JAN04) 159-164 et R Bastow et al.; p.164-167, (mentionnés dans le Bulletin de Mars §39), la revue du groupe de Caroline Dean (IR Henderson et al.; Annual Review of Genetics 37 (DEC03) 349-370), note la stabilité mitotique du caractère qui indique l'existence probable d'un mécanisme épigénétique. L'analyse génétique chez Arabidopsis a permis d'identifier les gènes répresseurs floraux, FRI (FRIGIDA) et FLC (FLORICAULA), dont l'effet est neutralisé par la vernalisation, et une série de gènes de la voie autonome de la floraison qui est, par ailleurs, analysée sur le plan génétique. FLC est un répresseur de la floraison et la présence d'un allèle dominant de FRI stimule l'expression de FLC, ce qui inhibe la floraison. La vernalisation annihile l'effet de FRI en réprimant l'expression de FLC. L'histoire n'est manifestement pas complète, car il existe manifestement des acteurs indépendants de FLC.

Les allèles récessifs fri chez les mutants annuels estivaux (qui enchaine la floraison sur croissance printanière sans hiver) ont souvent des pertes de fonction par rapport aux Arabidopsis hivernales annuelles qui fleurissent très tard dans la saison ou au printemps suivant après vernalisation.

Certains de ces mutants peuvent, cependant, posséder un gène FRI actif, mais c'est FLC qui devient insensible à l'action de FRI.

La revue de S Sung et al.; Current Opinion in Plant Biology 7 (FEB04) 14-10, traite du même sujet en insistant sur les aspects épigénétiques avec le rôle de la méthylation de l'ADN, qui sont également traités dans la revue précédente avec les gènes VRN (VERNALIZATION) identifiés par ses auteurs. Les méristèmes apicaux sont les sites de perception du froid. La vernalisation nécessite, par ailleurs, des mitoses pour s'établir, ce qui est normal pour un mécanisme épigénétique.

Le gène VRN1 (codant une protéine liant l'ADN) et VRN2 (codant une protéine Polycomb) contribuent à cet effet. Ils présentent des interactions épistatiques et font probablement partie d'une même voie régulatrice. VRN1 du blé ressemble beaucoup au gène d'identité méristématique APETALA1 (AP1) d'Arabidopsis qui initie la transition de l'apex végétatif en apex reproducteur.

Ils sont nécessaires au maintien de la vernalisation, mais pas à son établissement. C'est VIN3 qui intervient dans les modifications initiales de la chromatine liées à la vernalisation. Durant la vernalisation, l'acétylation de la chromatine autour de FLC décroît et la méthylation de l'histone H3 au niveau des Lys9 et Lys27 augmente.

VIN3 (VERNALIZATION INSENSITIVE3) n'est induit qu'après une longue période de froid. VIN3 code une protéine à domaine PHD. Ces protéines ont été impliquées dans l'évasion immunitaire des virus en ubiquitinylant leurs cibles en fonctionnant comme ubiquitine ligase E, ce qui requiert le motif PHD. Ce qui n'exclue probablement pas une dégradation de protéines dans cette régulation, Bien que les auteurs ne mentionnent pas cette éventualité.

La revue de IR Henderson et al. se penche sur l'utilisation de ces gènes dans les plantes cultivées, avec une étude comparée.

On trouvera, enfin, dans l'article de L Yan et al.; Science 303 (12MAR04) 1640-1644, la caractérisation du gène VRN2 du blé. VRN2 est réprimé par la vernalisation. La perte de fonction de VRN2, par mutation ou délétion, a donné le blé de printemps bien connus. On peut obtenir le même effet avec une interférence ARN. Celle-ci n'est jamais complète et les auteurs n'ont obtenu qu'une réduction de l'expression entraînant une accélération de la floraison des blés d'hiver transgéniques de plus d'un mois.

Chez le blé diploïde T monococcum aussi bien que chez l'orge, VRN1 est dominant pour la croissance printanière, tandis que VRN2 est dominant pour la croissance hivernale.

24. Au cours des 10 dernières années, la stratégie pour détecter de nouvelles familles d'herbicides est passée de la technique "spray & pray" sur les plantes en serre, de collections monstrueuses de n'importe quelle famille de molécules chimiques (avec une utilisation de la chimie combinatoire, en particulier) à une recherche de cibles potentielles essayées in vitro. Mais il ne faut pas oublier que la technique ancienne avait l'énorme avantage de tout intégrer dans l'analyse, la disponibilité de la molécule, sa pénétration et son transport dans la plante, etc… Une revue de chercheurs allemands (notamment de BASF), menés par Uwe Sonnewald, discute de ce que la génomique pourrait apporter au montage des essais in vitro. W Lein et al.; Current Opinion in Plant Biology 7 (APR04) 219-225.

Les auteurs rappellent à juste titre que le marché des pesticides est 100 fois plus petit que celui de la pharmacie et, de plus, est stagnant voire en régression. Ceci impose des contraintes financières considérables.

Les molécules actives actuellement disponibles sont efficaces, même si des résistances se font également jour. Par ailleurs, beaucoup tomberont dans le domaine public assez rapidement. Enfin les problèmes de rémanence dans les sols et les nappes phréatiques font que beaucoup d'autorisations vont être annulées.

Il faudra donc quand même et, dans cette ambiance maussade, mettre au point de nouveaux pesticides. On admet qu'il faut 10 à 12 ans pour développer un "lead", c'est à dire une amorce de lignées de molécules actives. Or les essais sur plantes n'ont pas donné suffisamment de nouveaux "lead". Cela explique le changement de stratégie.

On peut d'ailleurs se demander pourquoi l'approche sur plantes amorcée à la fin des années 40s n'a pas été plus efficaces (270 molécules actives correspondant à 17 modes d'action différents). Cela aurait l'air satisfaisant si on n'examinait pas en détail ces données. La moitié n'agit que sur trois cibles : l'acétolactate synthase, le photosystème II et la protophoyrogène oxydase. De plus 10 des herbicides correspondent à 45% du marché. Il doit cependant exister bien d'autres cibles possibles. Une explication de la faiblesse de cette approche traditionnelle réside probablement dans sa qualité principale, la prise en compte de toute la chaîne des mécanismes amenant la molécule à la cible en échappant à toutes les défenses éventuelles de la plante. Une autre raison est la nécessité d'une bonne capacité de synthèse chimique ce qui explique l'association étroite, jusqu'à il n'y a pas si longtemps, de grands chimistes à la production de pesticides. Mais synthétiser des molécules en quantités suffisantes pour des essais sur plante n'est pas à la portée de tout le monde. La chimie combinatoire a le défaut de donner un plus grand nombre de molécules différentes, mais en petites quantités, insuffisantes pour des essais sur plantes entières. Le passage aux essais sur cibles moléculaires a atténué cette dépendance (encore que…)..

La plupart des cibles des herbicides actuels sont des enzymes qu'ils inhibent. On peut se demander pourquoi. Les premiers herbicides découverts dans les années 40s étaient des analogues auxiniques. Cela n'a pas été suivi. Quelques uns s'attaquent au cytosquelette ou à la division.

Les stratégies pour découvrir de nouvelles cibles sont passées par plusieurs phases au cours des 10 à 15 dernières années. L'idée que si on inhibe une enzyme dans une voie on peut également s'attaquer avec succès à d'autres enzymes de la voie s'est révélée peu productive.

Une autre idée avancée était de s'intéresser aux protéines limitantes. Mais les critères correspondant à cette notion sont finalement assez subjectifs pour que le succès n'ait pas été au rendez vous.

Une troisième approche est de considérer qu'un gène "essentiel" code une protéine cible potentielle. Cette approche a été rendu possible au début des années 90s quand des méthodes de transformation de routine ont pu être utilisées. On a commencé par explorer les voies considérées comme vitales pour la plante. On a inhibé les gènes par antisens, ou plus récemment, par interférence ARN. On détecte chez environ 10% des plantes une inhibition de l'expression comprise entre 30 et 90%, mais c'est suffisant pour un effet "herbicide" car l'inhibition de 60–80% de l'activité suffit. Les lignée knockout ne sont pas une bonne méthode car supprimant complètement la fonction du gène. Elles permettent seulement d'éliminer les gènes dont la suppression du produit ne donne aucun phénotype perceptible.

On peut vérifier par immunoblotting la diminution de l'expression au niveau protéique et comparer avec l'effet phénotypique global. On estime que 20% des enzymes des voies centrales du métabolisme peuvent être des cibles. On a d'ailleurs trouvé là l'explication de l'échec évoqué plus haut des enzymes limitantes supposées hautement régulées et catalysant des réactions irréversibles. On peut les inhiber sans gros dégâts.

La génomique aidera sûrement dans le futur mais, pour l'instant, les fonctions d'à peine la moitié des gènes sont vaguement indiquées et 30% n'ont pas de fonction connue.

L'étude de JH Jun et al.; Planta 214 (MAR02) 668-674 décrit comment 1000 lignées différentes d'Arabidopsis ont été créées par des antisens aléatoires. Leur phénotype indiquait qu'1 à 2% des gènes codent des cibles herbicides potentielles.

Les auteurs ont repris cette stratégie chez le tabac avec 20 000 cDNAs (sens ou antisens). Ils ont identifié de cette façon 46 cibles identifiées par des phénotypes chlorotiques, des nécroses ou des malformations. Ils comprennent des gènes de glutamine synthase, dont on sait que ce sont des cibles.et des gènes comme ceux de la Rubisco et de la ferredoxine:NADP oxydoréductase dont l'inhibition par antisens mime l'effet d'herbicides. La moitié de ces gènes codent d'ailleurs des enzymes, et on retrouve le biais antérieurement observé. La recherche d'autres cibles non enzymatiques doit probablement faire intervenir l'analyse des interactions protéine/protéine.

Il est, par ailleurs vraisemblable que beaucoup plus de gènes sont connus par des industriels qui se gardent bien de les révéler.

De nouveaux programmes utilisant l'interférence ARN sont actuellement lancés et les résultats devraient être connus au cours de l'année prochaine. On peut également penser à une stratégie basée sur le silencing induits par les virus.

Quant à établir les fonctions de gènes pour lesquelles elles sont inconnues, c'est un problème classique de la post-génomique.

25. Le nectar joue un grand rôle dans l'interaction des plantes avec les insectes (et certains oiseaux), notamment, lors de la pollinisation. Une revue sur cette production par les plantes est parue avec E De la Barrera et al.; Trends in Plant Science 9 (FEB04) 65-69.

Le nectar dérive du contenu du phloème. Tous deux présentent une forte concentration en sucres (10–30%) avec surtout du saccharose, mais également du glucose et du fructose et très peu d'acides aminés (à peine 1%). La concentration recherchée en sucres varie selon les pollinisateurs. Les oiseaux-mouches se dérangent pour 10% de sucres, tandis que les abeilles exigent 30%.

La transpiration du nectar au niveau des fleurs est liée au fait que c'est le phloème qui alimente en eau les fleurs et pas le xylème (absent, et qui serait d'ailleurs non fonctionnel pour des raisons thermodynamiques) comme dans les autres organes de la plante. L'énergie consacrée au nectar varie beaucoup et peut atteindre 20% pour la Luzerne et même 35% pour Asclepias syriaca qui est d'ailleurs utilisée pour attirer les abeilles;

Le maximum de production du nectar coïncide avec la maturité du pollen, notamment chez la citrouille Cucurbita pepo et certains Agaves. Dans d'autres cas c'est à la réceptivité maximale des stigmates, comme pour le cierge Stenocereus stellatus.

Les nectaires sont des glandes spécialisées superficielles qu'on trouve chez la plupart des angiospermes, mais également chez certaines fougères et gymnospermes. Ce sont des glandes florales mais on peut également trouver des glandes extra-florales chez les Angiospermes comme chez les fougères et les gymnospermes. Ces derniers nectaires ne sont irrigués directement par des vaisseaux mais sont situés à leur voisinage.

La production du nectar peut avoir deux explications, soit il s'agit d'une exsudation du phloème, soit d'une soustraction d'eau à la sève élaborée qu'il véhicule, par évaporation dans la fleur, qui serait telle que l'accumulation de sucres est inévitable, les sucres étant sécrétés pour éviter l'abaissement du potentiel hydrique (activité de l'eau). Une autre solution eut été de polymériser les sucres en amidon, ce que l'on observe dans certaines fleurs, mais avec une hydrolyse brutale dans les nectaires à la maturité des fleurs.

26. ZY Wang et al.; Trends in Plant Science 9 (FEB04) 91-96, s'intéressent à la transduction du signal des brassinostéroïdes. Les brassinostéroïdes (BRs) sont perçus par le récepteur à protéine kinase BRI1. C'est un récepteur périphérique et pas un récepteur nucléaire comme ceux des stéroïdes chez les animaux.

Un fait curieux est que, au moins chez la tomate jusqu'à présent, BRI1 perçoit aussi bien les brassinostéroïdes que la systémine, qui est pourtant un peptide (impliquée dans les défenses généralisées).

Il existe vraisemblablement de tels récepteurs périphériques chez les animaux (voir RM Losel et al.; Physiological Review 83 (JUL03) 965-1016) et ils ont été clonés chez l'homme et les poissons. Ce sont des récepteurs couplés à des protéines G, mais qui semblent distincts de ceux des plantes. Les auteurs essayent d'éclaircir leur rôle dans les réponses aux blessures (herbivorie) en parallèle à ce qui se passe dans les voies Toll de la Drosophile qui intervient aussi bien dans l'embryogenèse que dans les défenses innées de l'insecte.

Toll est une protéine transmembranaire avec un domaine extracellulaire N-terminal avec des répétitions riches en leucines (LRR) tout comme le récepteur à fonction kinase BRI1. Toll est activé par le ligand Spaetzle qui est synthétisé sous une forme inactive qui est activée par clivage, comme l'est la prosystémine. La fixation de Spaetzle sur Toll induit une dimérisation du récepteur et l'activation de la kinase aval Pelle, une sérine/thréonine kinase apparentée au domaine kinase de BRI1.

La réponse de BRI1 de la tomate est une réponse généralisée par le biais de la synthèse du jasmonate qui induit, à son tour, la production de systémine, ce qui amplifie le signal. Mais le brassinostéroïde réprime la production de systémine, ce qui pourrait indiquer une compétition entre les réponses développementales et de défense à l'activation du récepteur.

27. On trouvera dans H Guo et al.; Current Opinion in Plant Biology 7 (FEB04) 40-49, une mise à jour de nos connaissances sur la voie de signalisation par l'éthylène.

Au cours de l'an passé on a déterminé le complexe récepteur au niveau du réticulum endoplasmique, défini le rôle de l'histidine kinase du récepteur et établi la régulation de l'activité CTR1 (Constitutive Triple Response1) de ces récepteurs par une cascade MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) particulière.

On a cloné et caractérisé de nombreux facteurs de transcription EIN3)/EIN3-like (Ethylene INsensitive3) chez de nombreuses plantes. L'intégration des voies de réponse à l'éthylène et aux jasmonates par les facteurs de transcription ERF (Ethylene Response Factor) a été précisée.

28. Les chalcone synthases (CHS) sont des polycétides synthases de type III homodimériques, qui assurent une condensation itérative dans la synthèse des flavonoïdes, selon un processus ressemblant à la synthèse des acides gras. On vient de caractériser un enzyme de ce type chez la rhubarbe (Rheum palmatum) qui condense six malonyl-CoA avec décarboxylation, puis cyclise le produit en un heptacétide aromatique, l'aloesone. I Abe et al.; FEBS Letters 562 (26MAR04) 171-176.

Je rappelle que la rhubarbe produit une variété de polycétides aromatiques, comme chromones, naphtalènes, anthraquinones, phénylbutanones et stilbènes (je ne comprend pas pourquoi on n'interdit pas l'excellent confiture qu'on en fait à la suite de ces dangers, ajoutés à la présence d'acide oxalique, si fâcheux pour les reins). Le procès étant fait, on doit expliquer que cette plante est une plante médicinale, en particulier anti-inflammatoire grâce au dicétide lindleyine. L'enzyme caractérisée est la polycétide synthase de la famille des chromones.

Les Symbioses

29. Deux articles impliquant des chercheurs INRA/CNRS de Toulouse portent sur deux de trois gènes impliqués dans les symbioses aussi bien bactériennes de fixation de l'azote atmosphérique, que fongiques mycorhiziennes. Les mutants des gènes DMI1, DMI2 et DMI3 (Does not Make Infections) n'exhibent pas la plupart des réponses aux facteurs Nod de la nodulation par les Rhizobium et ne nodulent donc pas. Ils ne donnent pas plus lieu à la formation de mycorhizes. DMI1 et DMI2 sont nécessaire à l'induction du pic de calcium dans les poils absorbants et fonctionnent manifestement en amont de DMI3.

 DMI3 de la luzerne modèle Medicago truncatula code une protéine kinase Ca2+ dépendante qui agit immédiatement en aval du pic de calcium dans la voie commandant la nodulation par les Rhizobium, permet également la formation des mycorhizes arbusculaires. Ce gène est placé sur le chromosome 8 et a été cloné par marche sur le chromosome à partir de BAC couvrant la zone du gène

 DMI1 est placé à une extrémité du chromosome 2. Il code une protéine vaguement apparentée à un canal à cation des archées. DMI1 représente probablement une innovation ancienne des plantes qui a dû faciliter la formation des mycorhizes (qui sont plus anciennes que la nodulation fixatrice d'azote).

Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense

30. Les viroïdes et la plupart des satellites viraux, sont de petits génomes non codants très structurés. On se demande toujours comment ils peuvent être pathogènes pour les plantes. Une découverte pas très ancienne a été qu'ils peuvent donner lieu à une interférence ARN, et donc perturber l'expression de gènes autochtones de la plante.

On vient de montrer que si on empêche, par un inhibiteur, cette interférence, on réduit considérablement les symptômes causés par le satellite Y du virus de la mosaïque du concombre. MB Wang et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (02MAR04) 3275-3280. Des tomates exprimant un ARN en épingle à cheveux dérivant du viroïde du fuseau de la pomme de terre, exhibent des symptômes analogues à ceux d'une infection par ce viroïde.

Ces deux types d'ARNs sont, eux-mêmes, fort résistants à la dégradation liée à l'interférence ARN. Ceci indique que leur structure très compacte doit contribuer à cette résistance et à leur perpétuation.

31. Les déterminants viraux du virus du court-noué de la vigne (Grapevine fanleaf virus ou GFLV) permettant sa transmission par son vecteur, le nématode Xiphinema index sont regroupés dans les 513 acides aminés (aa) C-terminaux de la protéine codée par le RNA2 de ce virus bipartite avec les 9 aa C terminaux de la protéine de mobilisation (2BMP) et les 504 aa de la protéine de capside (2CCP). P Andret-Link et al.; Virology 320 (01MAR04) 12-22. Seuls les acides aminés de la protéine de capside sont impliqués.

Les auteurs de l'INRA de Colmar ont recombiné les séquences des deux virus GFLV et l'Arabis mosaic virus (ArMV) transmis, lui, par Xiphinema diversicaudatum) et leur protéines de capside

32. Des chercheurs australiens ont établi les séquences des segments génomiques 5, 6, 8 et 10 du Fiji disease virus (FDV), un REOvirus de la canne à sucre et c'est le virus le plus redouté en Australie. RB McQualter et al.; Archives of Virology 149 (APR04)713-721 Il se manifeste par des galles blanchâtres sous les feuilles et un nanisme des plants infectés. Chaque segment code une protéine. Les auteurs ont identifié la fonction probable de chacune.

33. La protéine virale HC-Pro qui assure le clivage des polyprotéines des Potyvirus, participe à la réplication, mais également à la lutte contre le "silencing" de défense de la plante (voir le Bulletin de Mars §38). Des tabacs transgénique exprimant cette protéine sont beaucoup plus sensibles à plusieurs pathogènes. Mais elle peut contribuer à la résistance à plusieurs pathogènes non apparentés. GJ Pruss et al.; Virology 320 (01MAR04) 107-120Elle renforce la résistance des tabacs transgéniques l'exprimant, liée à la présence du gène N, au virus de la mosaïque du tabac.On constate également une résistance accrue au tomato black ring nepovirus (TBRV) ainsi qu'à l'oomycète Peronospora tabacina. Les choses doivent être compliquées car le renforcement de la résistance au TBRV est indépendante de la réponse salicylate, tandis que celle à P.tabacina en dépend.

35.Beaucoup de virus à ARN directement tradu ctible (+) ne possèdent pas de poly(A) greffée en aval des messagers cellulaires et qui facilite leur traduction. Une structure tRNA-like (TLS) qui peut être fonctionnelle à la place de la queue poly(A) des messagers normaux.

La partie non traduite aval (3'UTR) de ces génomes devrait conférer les mêmes propriétés et ceci est réalisé de différentes façons. D Matsuda et al.; Virology 321 (30MAR04) 36-46 montrent que la 3'UTR du virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV) qui comprend une structure de tRNAvaline de 109 nucléotides plus un pseudonoeud juste en amont et qui jouent joue le rôle d'activateur de la traduction, en synergie avec la partie amont de l'ARN viral qui est ici normalement coiffé par le 5'-m7GpppN, comme les messagers cellulaires. Cette partie de l'ARN doit conserver sa capacité d'aminoacylation par la valine ou, à la rigueur par la méthionine. L'affinité pour le facteur d'élongation de la traduction eEF1A est impliquée.

Cette structure fonctionne comme un appât pour les ribosomes pour faciliter la traduction du brin (+) messager) et guide ceux-ci vers le site interne d'initiation de la traduction du second ORF du génome et qui peut, secondairement, être aminoacylée par une valine. On retrouve des caractéristiques identiques chez le Brome mosaic virus (BMV), un virus qui possède un génome ARN tripartite avec un ARN subgénomique RNA4 codant la protéine de capside. Ces quatre ARNs porte une TLS volumineuse d'environ 200 nucléotides correspondant à une tyrosylation contre une valylation pour le TYMV. On vient de montrer que les protéines du BMV n'ont pas besoin de la tyrosylation pour l'initiation de la traduction S Barends et al.; Journal of Virology 78, n°8 (APR04) 4003-4010. Mais la disruption de la TLS réduit la traduction des RNA1 et RNA2, et moins fortement, du RNA3, sans affecter celle du RNA4. Cette anomalie de la traduction peut être rétablie si on fournit la séquence en trans et que même une partie de la TLS suffit.

36. Les promoteurs utilisés pour la réplication du brin (+) en brin (-) des virus à ARN directement traductible ainsi que pour les ARNs subgénomiques de ces virus ne possèdent pas de structures comparables, même si c'est la même polymérase qui les reconnaît.

Le promoteur du brin (-) de l'Alfalfa mosaic virus (AMV), consiste en une épingle à trois boucles, rattachée en aval à une structure tARN. Le promoteur utilisé pour les copies subgénomiques est une simple épingle à trois boucles, hpE, sans aucune homologie avec la précédente. On vient de montrer que si on délète la partie tARN du promoteur, peut fonctionner comme un promoteur subgénomique in vitro et peut remplacer le promoteur subgénomique dans le virus. Les promoteurs subgénomique et du brin (-) sont fondamentalement identiques et l'adjonction de la structure tARN force la polymérase à commencer son travail à l'extrémité 3'. RCL Oslthoorn et al.; Journal of Virology 78, n°8 (APR04) 4048-4053

37. Alternaria brassicae est un champignon pathogène des Crucifères. Il produit, comme Trichotecium roseum et Ophiosphaerella herpotricha un petit peptide spécifique de son hôte entraînant des nécroses et des chloroses. Ce cyclo-depsipeptide destruxine B du champignon a été abondamment étudié. Des chercheurs d'Angers ont caractérisé le gène d'une peptide synthase non ribosomique de 22 kb de long, AbrePsy1 qui est non seulement impliquée dans la synthèse de la destruxine B, mais également d'un sidérophore. La protéine de 792 kDa présente une organisation typique modulaire multidomaines, avec quatre domaines d'élongation, dont deux sont complétés par un domaine d'épimérisation. Un second gène voisin, AbreAtr1, code un transporteur à cassette à ATP. Ces deux gènes sont exprimés durant l'infection mais avec des modulations différentes. T Guillemette et al.; Current Genetics 45 (APR04) 214-224.

38. TD Allen et al.; Journal of Virology 78, n°8 (APR04) 4145-4155 ont utilisé des réseaux cDNA pour suivre les réponses transcriptionnelles du champignon du chancre du châtaigner Cryphonectria parasitica, à une infection par les fameux hypovirus qui atténuent la virulence du champignon. L'hypovirus CHV1-EP713 atténue fortement la virulence de C.parasitica et il est donc classé comme puissant atténuateur. CHV1-Euro7, classé comme hypovirus atténué (le virus) entraîne une invasion vigoureuse par le champignon jusqu'à ce que le chancre ait atteint une taille trois fois plus grosse qu'avec l'isolat précédent, puis la croissance du chancre cesse brutalement.

Les souches de C.parasitica infectées par CHV1-EP713 ont une croissance plus faible sur milieu solide et ne donnent pas de spores asexuées (conidies). Les souches infectées par CHV1-Euro7 poussent plus vite que les souches sans virus atténuateur, produisent des conidies, mais moins que dans les souches sans virus. Les deux souches supprime le pigment orange marqueur caractéristique et entraîne une stérilité femelle.

L'isolat CHV1-Euro7 (atténué) entraîne une expression différentielle de 166 gènes (90 surexprimés et 76 réprimés) de l'hôte, soit moitié moins qu'après une infection par CHV1-EP713. On y trouve 80 gènes communs entre les deux isolats. Les effets de CHV1-EP713 sont, par ailleurs, plus amples. La réponse transcriptionnelle du pathogène-hôte par CHV1-EP713 est donc beaucoup plus dynamique qu'après une infection par la souche atténuée CHV1-Euro7.

39. Rosellinia necatrix est un champignon s'attaquant à la vigne et qui induit des pourritures du collet et des racines avec présence d'un mycélium laineux superficiel. Les plants présentent différents degrés de décoloration, une croissance lente et peuvent connaître le dépérissement après une période de sécheresse ou un lent déclin au fil des années. Un suintement gommeux, noir, est observé à l'extrémité de la racine. Les feuilles restent attachées à la plante qui meurt rapidement. Les plantes en déclin présentent un dessèchement et des feuilles rabougries sur les rameaux de la base. La séquence des segments 1 et 3 du Rosellinia anti-rot virus (RArV, un REOvirus) d'un isolat hypovirulent pathogène du champignon a été établie. CZ Wei et al.; Archives of Virology 149 (APR04) 773-777. Le segment 1 code une ARN polymérase ARN-dépendante potentielle qui ressemble à celle d'autres REOvirus comme le Colorado tick fever virus (CTFV) et au virus Eyach (EYAV). Ces virus font donc partie d'une famille commune.

40. Les nématodes sont des plaies des cultures dans le monde entier, et très difficiles à éradiquer sans provoquer les "verts" du fait du danger des traitements chimiques. Les plus gênants sont ceux des régions méditerranéennes et tropicales comme Meloidogyne arenaria, Meloidogyne incognita et Meloidogyne javanica qui sont polyphages et se reproduisent parthénogénétiquement sur des centaines d'espèces végétales sauvages et cultivées.

Les Prunus ont des résistances variables aux nématodes à galles des racines comme les Meloidogyne. Ils sont très divers et adaptés à un grand nombre de situations et beaucoup constituent des porte-greffes intéressants, mais la plupart des porte-greffes sont sensibles aux nématodes ce qui est fâcheux. Prunus cerasifera a été introduit dans les programmes de sélection, car certains clones ont des caractéristiques agronomiques intéressantes.et expriment des résistances aux nématodes à galles. Il possède un gène dominant de résistance à très large spectre, Ma, contre les trois Meloidogyne mentionnés plus haut et à une population mal identifiée de Meloidogyne sp. dite Florida qui surmonte pourtant la résistance issue des amandiers (qui sont également des Prunus au sens large). Il existe probablement un autre gène de résistance, Rja, du même type chez le prunier du Japon (Prunus salicina, alias triflora). Ces deux gènes ont été localisés par des chercheurs de l'INRA à Antibes et Bordeaux. M Claverie et al.; Theoretical & Applied Genetics 108 (FEB04) 765-773.

Les gènes de résistance Ma1, Ma2 et Ma3, avaient été caractérisés chez des clones différents. Chacune de ces résistances est active sur M.arenaria, M.incognita, M.javanica et M.sp. Florida, ainsi que sur l'espèce mineure Meloidogyne mayaguensis. Le prunier Myrobolan pourrait donc être intéressant. Des marqueurs associés à Ma1 et Ma3 ont été caractérisés et devraient faciliter la sélection assistée par marqueurs.

Le pêcher Shalil et un hybride pêcher-amandier (GF.557) sont résistants à M.arenaria et M.incognita, mais sensibles à M.javanica et à Meloidogyne sp. Florida. Le pêcher Nemaguard et le pêcher Nemared qui en dérivent, ainsi que des hybrides amandier x Nemared (GxN), résistent également à la plupart des populations de M. javanica mais pas à Meloidogyne sp. Florida.

Les auteurs ont également localisé un gène du pêcher permettant une résistance à M.incognita et M.arenaria et présent dans les pêchers Shalil (RMia557) et Nemared (RMiaNem). Les sources sont indépendantes, mais le gène est localisé au même endroit en position sub-télomérique sur le chromosome 2. Comme on le retrouve chez le pêcher japonais Juseitou, il doit s'agir d'un gène majeur de résistance. Mais les gènes de prunier et de pêcher sont indépendants.

41. On trouvera dans Z Nimchuk et al.; Annual Review of Genetics 37 (DEC03) 579–609, une revue sur les récepteurs et leurs réponses dans le système immunitaire des végétaux.

La perception des molécules plus spécifiques de pathogènes (mais ne pas oublier le cas ambigu des symbiotes) par les tissus végétaux et leur réaction, ou l'absence de réaction va gouverner l'évolution des populations d'envahisseurs.

En théorie, toute molécule étrangère devrait pouvoir entraîner une reprogrammation et un déclenchement de l'expression des gènes de défense. Cette reconnaissance génétiquement simple déclenchée par la simple interaction récepteur/ligand, a besoin de co-facteurs cellulaires qui sont les cibles de facteurs de virulence.

La transduction du signal requiert probablement une dégradation régulée de protéines et un basculement de l'homéostasie cellulaire entraînant la mort cellulaire programmée caractéristique de la réaction hypersensible, qui peut être considérée comme une réaction peut être exagérée de la plante.

Les éliciteurs des défenses de la plante sont codés par ce que l'on considère comme les gènes d'avirulence (avr) du pathogène.

Les auteurs se concentrent sur les mécanismes de réponse des gènes R de résistance spécifiques. Ils correspondent à un vaste spectre de pathogènes: bactéries, champignons, oomycètes, nématodes, virus et même insectes. Ce qui est sûr c'est que le modèle simple qui voudrait que le produit des gènes R soit un récepteur est, au mieux, approximatif.

Les protéines Avr sont reconnues dans l'espace périplasmique (apoplaste), cas des champignons pathogènes, ou au sein de la cellule après injection par un système de sécrétion de type III, comme dans le cas de Pseudomonas syringae. Les gènes avr devraient être donc contre-sélectionnés dans la nature. Il n'en est rien, car ils ont un rôle dans la virulence. On constate, d'ailleurs, que les mécanismes jouant dans le déclenchement d'une défense efficace sont aussi ceux qui se développent au cours d'une infection réussie (ce qui n'est pas aberrant), mais on peut caractériser des mutations individuelles qui entraînent un échec des deux processus. Il en résulte une bataille évolutive constante.

Ce qui en résulte, probablement, est une défense à bas niveau, même en l'absence d'éliciteurs spécifiques, qui tient en éveil les systèmes de défense.

La revue traite de la reconnaissance des éliciteurs et comment la protéine R est activée. Elle traite également des mécanismes en aval de cette reconnaissance.

Les plantes recombinantes

42. Le numéro d'Avril de Current Opinion in Plant Biology contient également une série d'articles sur le "molecular farming" et l'ingéniérie métabolique des plantes.

On sait que (et on le reproche indûment aux semenciers) que l'on a, jusqu'à présent, privilégié l'intérêt des cultivateurs (et les semenciers) aux dépens de ceux des industriels en aval et des consommateurs.

Il ne faut pas oublier que les premières générations de plantes transgéniques ne pouvaient reposer, à l'époque (les années 80s) que sur le transfert de caractères liés à des gènes uniques ou en très petit nombre accumulés par croisements. La résistance aux herbicides est possible avec cette limitation. On reproche la nature des marqueurs alors utilisés qui étaient alors à peu près les seuls opérationnels. Le résultat est un succès auprès des cultivateurs, dont elles simplifiaient la vie, et des semenciers pour lesquels elles étaient une "cash machine" et un instrument de domination du marché. Les refus de certains pays ont gêné l'expansion, mais les semenciers locaux ayant longtemps hésité à se lancer dans cette direction deviendront des sous-traitants et cela va accentuer les oligopoles actuels.

Une des voies de propagande pour ces cultures est la démonstration des bienfaits de ces plantes pour les consommateurs (mais voir le §147).

Le "molecular farming" est supposé aller dans ce sens. L'idée est d'abaisser considérablement les coûts de production de certaines molécules utiles à l'homme et de les rendre donc abordables pour le plus grand nombre

R Fischer et al.; p.152– 158 illustrent les différentes approches pour faire produire des protéines dans divers organes des plantes avec leurs avantages et inconvénients.

SE Franklin et al.; p.159–165 envisagent l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii, qui est le seul végétal où la transformation a été réussie dans le noyau, la mitochondrie et le chloroplaste. Et pourtant on ne s'en est jamais servi dans des applications. Il est vrai que la culture d'algues de ce type nécessite de l'installation bien plus coûteuses que l'exploitation d'un champ. Un bioréacteur est une meilleure protection, mais il est coûteux à acheter et à faire fonctionner.

Une optimisation des codons pour une expression nucléaire et chloroplastique est indispensable, ainsi que la neutralisation de l'interférence ARN.

EL Decker et al.; p.166–170 s'intéressent à un outil plus exotique encore la mousse (donc organisme haploïde) Physcomitrella patens cultivée également en bioréacteurs par la firme allemande de Freiburg, Greenovation. Des améliorations comme la délétion des gènes de glycosylation, sont disponibles.

La plupart des protéines thérapeutiques requièrent une forme ou une autre de modifications post-traductionnelles pour devenir actives. V Gomord et al.; p.171–181 discutent des différences entre ces modifications chez les plantes et les mammifères.. Ils proposent plusieurs façons d'humaniser les protéines produites dans des plantes.

La production de protéines chez les plantes nécessite des vecteurs adaptés. Dans certains cas une expression transitoire, souvent intense, est recherchée. L'une d'entre elle est l'agroinfiltration (utilisée par la firme canadienne Medicago) où on injecte dans les feuilles des Agrobacterium recombinants. Cela est surtout utile pour des essais, mais non viable sur le plan économique. Le groupe de Baulcombe a récemment montré comment on pouvait bloquer l'interférence ARN qui en est responsable en exprimant la protéine p19 de la tomate.

Les vecteurs viraux sont intéressants quand on veut produire rapidement des protéines intéressantes. Y Gleba et al.;p.182–188 analysent les progrès récents dans ce domaine. On peut les envisager aussi bien pour une production expérimentale limitée que pour une production industrielle de masse. Une des stratégies potentielles est d'exprimer préalablement quelques unes des protéines virales dans le génome de la plante. C'est une des façons d'augmenter la production et de confiner cette expression aux seules plantes préadaptées. Une des difficultés potentielles réside dans les phénomènes de "silencing" qui ont été inventé par la nature pour contrer les infections virales. Il peut également exister des interférences avec le métabolisme de la plante, et tout ceci influe sur la production.

Il existe,évidemment une réticence à voir se répandre dans la nature des plantes produisant des substances actives. (Voir le Bulletin de Février-Mars §196).On recherche donc des procédés de confinement biologique. Le groupe de Flavell (PN Mascia et al.; p.189–195) décrit de telles stratégies industrielles pour assurer cette sécurité. La plus efficace est celle qui consiste à empêcher la plante de monter à graine sans une commande délibérée, ou de jouer de la même façon sur la germination. Cela fait alors penser aux problèmes de "Terminator" qui serait d'une aide précieuse.

L'ingénierie métabolique apporte son lot de problèmes et de solutions. La première chose est de mieux connaître le métabolisme normal, avec ses stocks et flux, ses réseaux, etc.

Ce qui régule les flux dans ces conditions n'est pas toujours évident. RN Trethewey; p.196–201 souligne le caractère "essai/erreur" de beaucoup de programmes d'ingénierie du métabolisme. Il insiste sur le fait que ce n'est pas en travaillant une voie que l'on obtient la meilleure solution, mais qu'il faudrait envisager le métabolisme dans son ensemble? ce qui est plus vite dit que fait. Il souligne, cependant, que la multiplicité des substances chimiques impliquées, empêche tout profilage systématique des métabolites, et il plaide pour le développement de techniques ciblées, ce qui est un peu paradoxal, mais pas tant que cela.

Plutôt que de manipuler des enzymes particulières dans une ou plusieurs voies, faudrait-il jouer sur les facteurs régulateurs, comme les facteurs de transcription. Arabidopsis en possède environ 1700 dont seulement 7% sont génétiquement caractérisés. P Broun; p.202–209 s'intéresse précisément à ces facteurs chez les plantes. On vient d'augmenter la teneur en flavonols de la tomate en utilisant deux de ces facteurs du maïs.

On peut modifier une ou deux étapes dans la synthèse d'un produit et cela avec succès. C'est le cas pour obtenir des amidons modifiés. Ce cas est discuté par S Jobling; p.210–218 (voir le §43). On , ainsi, pu obtenir des amidons de pomme de terre dont les amidons résistent mieux à la congélation-décongélation, ce qui évite d'avoir à les modifier chimiquement, par pontage, par exemple.

43. Une revue de S Jobling; Current Opinion in Plant Biology 7 (APR04) 210-218, dans la même série traite de l'amélioration des amidons.

Beaucoup de gènes impliqués dans la synthèse de l'amidon ont été clonés chez diverses plantes. On sait que l'amylose, qui constitue 20–30% d'un amidon normal est essentiellement linéaire. L'amylopectine constitue 70–80% de l'amidon total est c'est une molécule ramifiée. Les amidon-synthases prélèvent les glucoses sur l'ADP-glucose et les greffent sur les extrémités non-réductrices du glucane. La GBSS (Granule-Bound Starch Synthase) est responsable de l'élongation de l'amylose. Celle de l'amylopectine a surtout lieu à la surface du grain d'amidon. Au moins 9 isoenzymes sont impliquées dans cette synthèse. Les ramifications permettent un compactage de l'ensemble et confère à l'amidon sa pseudocristallinité (recherchée ou pas). La localisation de l'amidon dans le grain est encore l'objet de débats agités.

La structure et la composition des grains d'amidon a une influence sur les propriétés physique de l'amidon. C'est ainsi que l'amidon de l'orge est idéal pour faire de la bière par ce qu'il est relativement homogène, et se gélatinise (solubilise) à relativement basse température (55-60°). Quand on veut passer à celui du maïs, moins cher, on se heurte à une difficulté - il faut chauffer à plus de 100° pour obtenir une gélatinisation. Les grains d'amidon de pomme de terre ont une taille très hétérogène, mais l'amidon est fortement phosphorylé en C3 et C6, ce qui confère des propriétés intéressantes, comme une capacité de gonflement exceptionnelle.

On connaît bien les mutations du locus Waxy qui sont utilisées dans certaines variétés de céréales (maïs, orge et sorgho) et de l'amarante. Elles corresponde au gène de la GBSS,mais seuls les mutants waxy du maïs sont cultivés de façon significative. Cela facilite sa gélatinisation (voir plus haut). Il est utilisé comme épaississant et stabilisant dans les aliments et comme émulsifiant dans les sauces pour salade. Un mutant de ce type est connu chez le blé et des utilisations ont été suggérée, mais son utilisation dans les produits traditionnels du blé tendre n'est pas recommandable. On a donc préféré des blés partiellement waxy, notamment pour les blés durs où ces blés facilitent la production de pâtes.

Des amidons waxy ont été obtenus dans le tubercule de pomme de terre en utilisant la technique antisens et par l'approche "sens" chez la patate douce. L'amidon waxy de la pomme de terre donne une pâte claire et stable qui pourrait trouver une utilisation dans le domaine alimentaire (si les consommateurs) l'accepte et surtout dans les papiers. Des essais vraie grandeur ont eu lieu pour vérifier les qualités de ces pommes de terre au champ, et la demande d'autorisation est en cours d'examen.

Bien que les amidons waxy aient de bonnes capacités de résistance à la congélation-décongélation, elles ne sont pas excessives. Il faudrait des amidons plus stables. C'est pourquoi on utilise les pontages chimiques. Si on pouvait les éviter…

Un amidon de pomme de terre ayant clairement cette qualité existe maintenant. Il résulte d'une triple inactivation antisens des gènes d'amidon synthases GBSS, SSII et SSIII, entraînant la formation d'un amidon à amylopectine à courtes ramifications. On obtient presqu'aussi bien avec une inactivation des GBSS et SSIII rassemblées par croisements.

Inversement des amidons à hautes teneurs en amylose liées à l'inactivation de l'enzyme ramifiante SBEIIb (Starch Branching Enzyme), ont été obtenus (on arrive actuellement à 90%. La haute capacité de gel de ces amidons en fait des ingrédients intéressants en confiserie. Leur capacité à donner des films est utile en friture où l'absorption des graisses est limitée et conserve le caractère croustillant à la friture. Par ailleurs, ces amidons sont difficilement hydrolysables (résistants) dans l'intestin grêle, mais sont fermentés dans le colon par la microflore locale.

On peut également les utiliser dans des colles, le carton ondulé etc…On connaît le gène de la pomme de terre, et on sait l'inactiver par antisens. Mais il faut inactiver les deux gènes de SBEI et SBEII pour arriver à plus de 60% d'amylose. Une dernière méthode a consisté à exprimer un anticorps monoclonal contre l'enzyme. On a obtenu une teneur encore plus élevée.L'amidon de ces pommes de terre ne gonfle pas à la cuisson et la texture est plus agréable que celle des tubercules normaux car ils contiennent plus d'eau libre.

On peut, par ailleurs, utiliser des GBSS à activité spécifique plus élevée que celle des plantes vasculaires, comme celle de Chlamydomonas reinhardtii,ou plus modestement des enzymes foliaires qui donnent de l'amylose plus long.

Malheureusement, et pour l'instant, les rendements des cultures à forte teneur en amylose sont mauvais, et il faut payer le différentiel aux agriculteurs pour qu'ils veuillent bien les cultiver.

La synthèse de l'amylose ne requiert qu'un seul gène. Dans le cas de l'amylopectine plusieurs enzymes agissant de concert sont nécessaires (amidon synthases, enzymes ramifiantes et déramifiantes) avec, chacune, plusieurs isoformes. Ceci explique les déboires rencontres dans la production d'amylopectines améliorées. Des modifications substantielles de la structure et des propriétés de l'amidon sont observées quand les isoformes d'amidon synthases SSII et SSIII sont simultanément inhibées. L'amidon gélatinise alors à moins de 50°.

44. La production de protéines dans les plantes vise un double objectif : assurer des coûts inférieurs à ceux des bioréacteurs, et une sécurité du produit qui sera (théoriquement) indemne de tout pathogène animal ou toxine microbienne.

Il faut cependant réaliser que la production dans les plantes posent des problèmes de rendement en produit recombinant, souvent lié à une instabilité du produit, des difficultés de récupération avec des fluctuations de qualité et une glycosylation particulière. La réglementation actuelle est édictée en conséquence.

Le tabac a toujours été une plante de choix pour jouer à la transgenèse du fait des techniques efficaces de transformation, de la bonne connaissance de ses régulations. Les protéines sont produites dans les feuilles. Comme la biomasse produite est importante, même avec un pourcentage de protéine recombinante faible on récolte quand même quelque chose. Et si cela ne suffit pas on agrandit le champ. De plus, et théoriquement, ce n'est pas une plante alimentaire et les risques de contamination d'autres aliments sont faibles. C'est la plateforme de production de Meristem Therapeutics et Planet Biotechnology qui sont les deux seules compagnies ayant un produit en phase clinique II. L'inconvénient du tabac, comme celui de beaucoup de solanacées, est la présence de toxines, nicotine et autres alcaloïdes. De ce point de vue, la laitue semble plus sûre (vaccin contre l'hépatite B) et la luzerne de la compagnie canadienne Medicago Inc. Pour l'instant cette compagnie concentre son attention sur les cultures de cellules et l'expression transitoire dans ces cellules avant de retourner à la plante et au champ. L'avantage de la luzerne est, au-delà de son bon rendement, son caractère pérenne, et sa glycosylation homogène. Le fait que cette plante est un aliment pour bétail est un handicap pour la sécurité et les feuilles contiennent de l'acide oxalique qu'il faut éliminer et qui peut interférer avec le "processing" aval.

Un défaut commun à toutes productions dans les feuilles est le caractère périssable de ces dernières et la protéine recombinante peut fort bien disparaître pendant qu'on les stocke.

On essaye donc une production dans les graines ou grains, où la déshydratation naturelle permet d'avoir un produit primaire stable sur des périodes prolongées. Riz, blé, orge et maïs sont envisagés et même utilisés à moyenne échelle. Prodigene utilise le maïs. On y a produit avidine et b-glucuronidase qui sont des réactifs, et ne suscite pas trop de protestations bien qu'un incident regrettable de stock de maïs transgénique ait été égaré). Mais plusieurs produits sont en cours de développement.

La production de vaccins dans ces conditions a souvent été évoquée. La justification est que l'on peut facilement stocker ces vaccins dans des pays où la chaîne du froid est douteuse et, en le faisant dans des plantes comestibles, on facilite l'a vaccination. Mais cela limite la production à des organes non périssables, à très bon rendement en protéine recombinante, et pas trop incomestibles. Exprimer un vaccin dans la laitue me parait aller à l'encontre d'un des objectifs initiaux. On a bien produit les premiers vaccins de ce type dans la pomme de terre, mais il faut la manger crue. Les souris n'ont pas le choix, mais les enfants du tiers monde???

Les oléagineux peuvent être un bon choix si on veut purifier le produit, car en fusionnant la protéine recombinante avec les oléosines (protéines associées aux gouttelettes lipidiques des graines) on facilite la purification. C'est le choix de la firme canadienne SemBioSys Genetics. La firme finlandaise UniCrop travaille différemment en faisant germer les graines et en en extrayant les oléosines.

La lentille d'eau (Lemna sp.) se rapproche techniquement des microorganismes et peut être utilisée dans des bioréacteurs (idée de Biolex Inc). Physcomitrella patens, de Greenovation est une autre idée originale.

45. La vitamine E (tocophérols, essentiellement a-tocophérol) est prônée pour les vieillards, la demande s'amplifie donc dans nos pays où on peut se payer le luxe d'essayer de ne pas vieillir. On cherche donc à enrichir les plantes (de préférence alimentaires) en cette vitamine, avant même que la preuve indiscutable de ces bienfaits ait été fournie. Au moins sa très faible toxicité aigue nous permet de nous payer ce luxe. Une revue de I Ajjawi et al.; Trends in Biotechnology 22 (MAR04) 104-107 fait la somme des travaux réalisés dans ce but.

La vitamine E comprend un groupe d'antioxydants, globalement dénommés tocols, avec une tête aromatique dérivant de l'homogentisate et une queue apolaire prényle. Tocophérols et tocotrienols diffèrent par leur queue prényle qui est, respectivement, saturée ou insaturée. On a ensuite des subdivisions basées sur la méthylation de la tête dite chromanol. Les tocols avec un groupe méthyle sont les d-tocols; ceux avec deux méthyles sont les g ou b-tocols. Une méthylation complète avec trois méthyles correspond aux a-tocols.

Nous ne savons utiliser que l'a-tocophérol par ce que nous possédons (comme les autres animaux) une protéine liant le tocophérol (TBP) qui est très spécifique de l'(R,R,R)-a-tocophérol.

Les principales sources de vitamine sont effectivement les plantes où la nature des tocophérols varie suivant les espèces et leurs tissus. Les graines oléagineuses en sont les plus riches. La teneur varie de 330 à 2000 mg par gramme d'huile. Malheureusement beaucoup de plantes synthétisent surtout du g-tocophérol, qui présente une activité 10 fois plus faible que l'a-tocophérol. Les tissus verts sont beaucoup moins riches (entre 20 et 50 mg) mais c'est surtout de l'a-tocophérol qu'on y trouve.

Il faut donc assurer deux opération parallèles : activer la production et favoriser la formation de l'a-tocophérol plutôt que les autres. L'analyse de la voie de biosynthèse montre qu'elle est constituée de deux parties. La partie amont est celle qu'il faudra remanier pour réorienter les flux et la partie aval celle qui va spécifier les tocophérols produits.

Les premiers endroits où on pouvait espérer modifier les flux sont au niveau de la hydroxyphénylpyruvate dioxygénase (HPPD) et de la géranylgéranyl diphosphate (GGDP) réductase (GGDPR) qui synthétisent respectivement l'acide homogentisique (précurseur de la partie aromatique) et le phytyl-diphosphate (PDP) (précurseur de la queue prényle). La surexpression de la HPPD a, certes, entraîné un accroissement très net de la production de l'enzyme, mais très peu des tocophérols. On n'a pas encore réalisé l'opération pour la GGDP réductase. Nous verrons plus loin que c'est très regrettable.

On a, cependant, constaté qu'en surexprimant la désoxyxylulose phosphate synthase on peut accroître de 40% la production des tocophérols dans les feuilles. On peut également surexprimer la première enzyme de la voie dédiée aux tocophérols, celle qui condense homogentisate et phytyl-diphosphate pour donner la méthylphytylbenzoquinone (MPBQ), l'homogentisate phytyltransférase (HPT). Il existe chez l'orge une enzyme de ce type, mais au fonctionnement nettement différent. Elle a une activité d'homogentisate géranylgéranyltransférases (HGGT).

La surexpression du gène chez le maïs a permis d'augmenter de 20 fois la teneur en tocotrienols des grains (c'est la forme synthétisée principalement par les monocotylédones), mais, malheureusement les tocotrienols sont mal absorbés par l'homme et cela n'ajoute donc guère à la capacité antioxydante. Quand on a exprimé la HGGT chez Arabidopsis on n'a rien amélioré côté tocophérols, mais on a également accru la teneur en tocotrienols. Ceci indique que HGGT et HPT sont spécifiques de leur substrat prényle (GGDP et PDP) et doivent entrer en compétition pour le HGA. GGDP et HGA sont manifestement abondants, et le fait que la surexpression de HGGT n'a pas d'effet sur la production des tocophérols indique que le

PDP doit être limitant, et il est, donc, fort dommage que l'on n'ait pas encore (officiellement) surexprimé la GGDP réductases.

Obtenir le tocophérol souhaité, l'a-tocophérol, nécessite de manipuler les enzymes des étapes ultérieures :MPBQ méthyltransférase (MPBQMT) qui va ajouter un méthyle, la tocophérol cyclase (TC) et la g-tocophérol méthyltransférase (g-TMT) qui va donner l'a-tocophérol.

Monsanto a surexprimé la g-TMT et la MPBQMT d'un mutant d'Arabidopsis dans la graine de soja (AL Van Eenennaam et al.; Plant Cell. 15 (DEC03) 3007-3019). Comme les autres graines oléagineuses celles de soja n'accumulent pas l'a-tocophérol, mais ses précurseurs, d et g-tocophérol). La surexpression des deux tocophérol méthyltransférases permet d'obtenir la conversion en a-tocophérol de 95% de ces précurseurs. Comme le souligne les auteurs si quatre cuiller d'huile de soja normal ne vous fournissent que 13 unités internationale's de vitamine E (contre 100 requises) les mêmes quatre cuillers de l'huile transgénique vous en fournissent 65 UI.

Aucune plante surexprimant la TC n'est officiellement connue. Quand leur existence sera dévoilée, on peut parier que leur teneur en vitamine E sera également améliorée

Les Insectes et leur Maîtrise

47. Les moustiques du Vieux Monde groupés dans le complexe Culex pipiens sont d'excellents vecteurs du virus West Nile qui a déjà fait une incursion en Camargue. Ils leur permettent de circuler entre oiseaux mais aussi vers l'homme et d'autres mammifères. On s'intéresse donc beaucoup à eux, au cas où… Ces vecteurs sont nécessaires à la propagation de l'épidémie par oiseau interposé, car la virémie (la concentration de particules infectieuses dans le sang) n'est pas suffisante pour infecter les moustiques pendant un repas de sang. L'extension de l'épidémie suppose donc des moustiques vecteurs navettes entre oiseaux et mammifères.

Un consortium comprenant l'Entente Interdépartementale pour la Démoustication Méditerranée de Montpellier, montre que les formes de l'Europe du Nord diffèrent des autres par leur comportement et leur physiologie et peuvent être distinguées par leurs microsatellites. Elles ne présentent manifestement aucun échange génétique, comme s'il s'agissait d'espèces distinctes. Au contraire, aux Etats-Unis, on observe de nombreux hybrides. De tels hybrides entre amateurs d'oiseaux et d'humains expliqueraient l'exceptionnelle sévérité de l'épidémie actuelle. Il y a, par ailleurs, une transmission transovarienne et les moustiques hibernant en sont une bonne réserve.

Ces moustiques ont des comportements et une physiologie très variés, sans que la morphologie ne puisse donner des indications. On distingue dans ce complexe les Cx.pipiens tempérés et les Cx.quinquefasciatus tropicaux, tous deux étant des colonisateurs des habitations humaines. La superposition entre populations de ces moustiques et celles de l'homme n'est pas étonnante, c'est ce dernier qui les a entretenues.

Leur comportement est bien connu, car la plupart de espèces tempérées sont anautogènes, c'est-à-dire que les femelles ont besoin d'un repas de sang pour se reproduire. Il existe cependant des populations autogènes comme celle du métro de Londres (à voir, après la Tour de Londres et Westminster). Elles ont acquis la capacité de supporter un espace confiné et sont actives toute l'année. Je suppose que la rareté des oiseaux dans ce biotope fait que leur met usuel est l'homme et le rat indépendamment du besoin pour la reproduction qui a été abandonné. Mais la plupart préfère les oiseaux que les mammifères. Une étude a clairement montré, en utilisant la diversité des isozymes, que la population souterraine dérive de celle à l'air libre. Mais les différences sont devenues telles que l'on doit admettre que le premier évènement de colonisation du Tube a été un évènement unique.

Cx.pipiens pourrait être un anautogène des oiseaux plutôt nordique qui présente une diapause et exige des espaces ouverts pour s'accoupler. Sa contrepartie méridionale, Cx.molestus, ne présente pas de diapause et tolère des espaces confinés. Dans ce scénario, la population du Tube dériverait de Cx.molestus autogènes de l'Europe du Sud ou d'Afrique du Nord (l'espèce type est égyptienne et elle a été fondue dans C.pipens car aucun critère morphologique traditionnel ne permettait de les distinguer). Il existe, dans les populations méridionales des individus anautogènes et autogènes. Mais l'autogénie est associée à une préférence pour les Mammifères et tout particulièrement pour l'homme. L'origine de la population du Tube pose donc un problème et il fallait savoir si c'était une espèce proche parente des Cx.pipiens aériens ou une immigrée.

48. On a, maintenant, identifié de nombreux gènes de l'immunité innée de Drosophila melanogaster. On ne sait cependant pas si le polymorphisme au niveau de ces gènes influe notablement sur l'immunité de l'insecte. Ce polymorphisme existe bien et BP Lazzaro et al.; Science 303 (19MAR04) 1873-1876 ont mesuré ses effets sur l'entomopathogène Serratia marcescens. Ils sont nets pour les 16 gènes essayés.

49. Les baculovirus infectent depuis toujours les insectes et il y a eu une co-évolution. Il devrait donc y avoir une spécialisation de ces interactions. EA Herniou et al.; Journal of Virology 78, n°7 (APR04) 3244-3251 ont analysé la phylogénie de 39 de ces virus pour voir s'il existe une co-évolution en se servant de deux gènes particuliers. Ces virus s'attaquent aux Lépidoptères Diptères et Hyménoptères,. Les arbres phylogéniques qu'ils ont déduits sont clairement spécialisés par ordre d'insectes. Il y a donc bien eu une co-évolution des virus et de leurs hôtes insectes.

50. L'utilisation de l'interférence ARN a permis de révéler le rôle d'une protéine reconnaissant les bactéries Gram- associée aux défenses innées de la Drosophile. S Pili-Floury et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (26MAR04) 12848-12853.

Drosophila réagit aux pathogènes par deux voies, celle de Toll et celle d'Imd. La voie Toll intervient surtout dans les défenses contre les Gram+ et les champignons. La voie Imd permet de résister aux Gram-.

La drosophile possède 13 gènes de protéines alertant les systèmes de défense en reconnaissant les peptidoglycanes bactériens. Ce sont les PGRP (PeptidoGlycan Recognition Proteins) circulante. On en connaît au moins trois impliquées dans les mécanismes de défense.

PGRP-SA, une forme circulante, active la voie Toll en présence de bactéries Gram+ mais pas en présence de champignons; PGRP-LC, une PGRP membranaire, est placée en amont de la voie IMD, et PGRP-LE est une PGRP sécrétée, activant la voie Imd lorsqu'elle est surexprimée. Les auteurs avaient montré que la voie Imd est activée préférentiellement par les peptidoglycanes à acide diaminopimélique des bactéries Gram-, mais aussi des Bacillus (Gram+).

Les auteurs montrent que les GNBPs (Gram-Negative Binding Proteins), découvertes initialement chez Bombyx mori, interviennent dans la reconnaissance des Gram+ (pourquoi faire simple…). GNBP1 est requise pour l' activation de Toll par les bactéries Gram+ et, dans un certaine mesure, à la stimulation de la production de la drosomycine (un antifongique) mais n'intervient pas en cas d'infection fongique Le phénotype induit par l'inactivation de GNBP1 est identique à la perte de fonction de PGRP-SA. GNBP1 agit, apparemment, en amont du ligand de Toll, Spätzle. Ces résultats indiquent que la reconnaissance des bactéries Gram+ dépend de la reconnaissance par deux récepteurs de patrons moléculaires PGRP-SA et GNBP1.

Les Biopesticides

51.. On trouvera dans RA de Maagd et al.; Annual Review of Genetics 37 (DEC03) 409-433, une revue sue la structure, la diversité et l'évolution des toxines protéiques des bactéries entomopathogènes sporulantes (Bacillus pour la très grande majorité). Leur diversité est liée à des recombinaisons entre gènes de toxines suivies de divergence, et leur dissémination est liée au fait qu'elles sont codées par des plasmides.

Bacillus thuringiensis (Bt), a été découvert il y a plus de 100 ans. Depuis quelques autres bactéries de ce type, comme B.sphaericus (Bsp), ont été découvertes. Leur caractère sporulant facilite grandement leur utilisation par aspersion.

Mais il est évident que c'est B.thuringiensis qui été l'objet des études les plus intensives. On en connaît des milliers de souches s'attaquent à un grand nombre d'insectes différents ,mais aussi aux nématodes et aux protozoaires.

Il n'y a pas d'épidémies de Bt, sauf quand l'homme en délivre des suspensions concentrées. Le reste du temps la bactérie vit dans le sol jusqu'à ce que les insectes en ingère par mégarde un nombre suffisant de spores. B. thuringiensis ne se distingue de B.cereus, qui occupe les mêmes niches écologiques dans la nature, que par l'absence de capacité de produire le cristal de pré d-endotoxine.  Les spores des deux bactéries causent une septicémie chez les insectes et sont des pathogènes opportunistes de l'homme. B.cereus est, d'ailleurs, un contaminant alimentaire causant quelques déboires. Bacillus anthracis (agent du charbon) est un parent dévoyé bien connu de ces deux bactéries.

Bacillus sphaericus (Bsp) forme des spores sphériques (d'où son nom) avec des cristaux de toxines antidiptères. Certaines souches, d'ailleurs moins efficaces, produisent des toxines protéiques solubles..

Penibacillus larvae est un pathogène des larves d'abeilles. Penibacillus lentimorbus et Penibacillus popilliae s'attaque aux larves des Scarabéidés, notamment de Popillia japonica contre lequel on a effectivement utilisé P.popilliae. Malheureusement les Penibacillus, anaérobies facultatifs, sont difficiles à cultiver en dehors de leurs hôtes, ce qui les rend coûteux comme biopesticide, et difficile à étudier, notamment dans le cas des facteurs de virulence impliqués.

Brevibacillus laterosporus est toxique pour les Diptères et les souches les plus actives synthétisent un cristal parasporal. On a enfin isolé des souches anaérobies de Clostridium bifermentans pour lesquelles une activité contre les moustiques a été caractérisée.

La plus grande variété dans les cristaux parasporaux se trouve chez Bt où on trouve, dans les cristaux, une ou plusieurs toxines dites Cry (pour Crystal) ou Cyt (pour Cytotoxique). On a disséqué ces familles de protéines.

Les plus nombreuses appartiennent au groupe à trois domaines. On en trouve des représentants chez P.popilliae avec Cry18, et C.bifermentans avec Cry16 et Cry17 (mais leur rôle dans l'entomophatogénicité reste à démontrer).

Les toxines de ce groupe présentent deux longueurs possibles; 130 ou 70 kDa. L'extension C-terminale qui caractérise les toxines longues est facultative pour la toxicité, et elle est probablement impliquée dans la formation du cristal parasporal.

Les protéines des cristaux de B.sphaericus contiennent une toxine binaire (BinA de 42 kDa et BinB de 51 kDa), présentant une certaine homologie avec Cry35 et Cry36 de Bt.

Les Cry35 ne sont actives sur Diabrotica virgifera virgifera sous la forme binaire qu'associées à la toxine non apparentée Cry34.

Cry37 et Cry23 sont un couple alternatif, Cry23 faisant partie d'un groupe un peu hétéroclite comprenant aussi quelques toxines de Bt (Cry 15 de B.thuringiensis sérovar thompsoni et du serovar dakota, ainsi que les toxines Mtx solubles de B.sphaericus. Ces dernières sont produites, comme les toxines Vips (Vegetative insecticidal proteins) de Bt et B.cereus, comme leur nom l'indique, en phase végétative.

Toutes ces toxines présentent jusqu'à 5 blocs conservés. Les d endotoxines activées de (Cry1Aa, Cry3Aa et Cry3Bb) et une courte pro-toxine (avant clivage protéolytique activateur) de Cry2Aa oint montré une bonne conservation de la structure des trois domaines, même si les séquences diffèrent notablement.

Le domaine I est un domaine à sept a-hélices avec une hélice centrale (a-hélice 5) entourée par six hélices amphipathiques. Il a l'allure d'une protéine créant un pore transmembranaire. Le domaine II comporte trois feuillets b formant un D. Il semble important pour l'interaction avec les récepteurs intestinaux de l'hôte. Il a de remarquables homologies avec la vitelline qui est une protéine liant les hydrates de carbone. Le domaine III est un b-sandwich avec deux feuillets b antiparallèles qui intervient à la fois dans la reconnaissance du récepteur et la formation du pore. Lui aussi présente des homologies avec une 1,4-b-endoglucanase et de nombreuses autres enzymes ayant à reconnaître les polysaccharides.

Toutes ces similitudes ne sont pas que des curiosités mais la trace de l'évolution de ces toxines.

La grande diversité de ces toxines est due à des recombinaisons homologues conduisant à des échanges entre domaine III et extension C-terminale, ainsi qu'à une divergence des séquences.

On a, ainsi, suggéré que Cry9Aa a évolué indépendamment des autres Cry9, mais a récupéré la même extension C-terminale. On a plusieurs exemples du même type au sein des Cry1. C'est le cas des toxines à double spécificité (Lépidoptères et Coléoptères) Cry1I et Cry1B où les domaines I et II sont très voisins de ceux des toxines contre coléoptères alors que le domaine III est très proche de celui contre les Lépidoptères.

Les toxines Cyt actives sur Diptères sont apparentées aux toxines Cry. On a décrit la structure de Cyt2Aa. Il n'y a qu'un seul domaine. On n'est pas trop sûr du mécanisme assurant leur toxicité. Il se pourrait que ces protéines forment des pores sous forme de multimères, ou qu'elles aient un effet détergent. En tout cas elles facilitent l'action d'autres endotoxines un peu comme chez Bacillus anthracis.

cyt1Ca codée par le plasmide pBtoxis de B.thuringiensis subsp.israelensis, présente les traces d'une fusion entre la partie N-terminale de Cyt et le domaine C-terminal qui est un homologue de la ricine et la toxine Mtx1 de B.sphaericus.

Mtx2 et Mtx3 sont très répandue chez les souches de B.sphaericus (Bsp) actives sur les moustiques. Mtx3 de 36 kDa est la moins étudiée des deux. Mtx2 de 32-kDa présentee un peu plus de variabilité que la précédente et l'acide aminé 224 est responsable des différences de la toxicité entre Aedes aegypti et Culex quinquefasciatus. Ces deux toxines son t apparentées et présentent des homologies avec la cytotoxine de Pseudomonas aeruginosa et l'e-toxine de Clostridium perfringens, l'a-toxine de Clostridium septicum et l'aérolysine d'Aeromonas hydrophila..

52. La tolérance du ver de farine Ephestia kuehniella à des préparations de Bacillus thuringiensis peut être induite, au laboratoire, par une préexposition à de faibles concentrations qui induisent une réponse immune. Plusieurs gènes semblent impliqués dans cette réaction immune. MM Rahman et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (02MAR04) 2696-2699.

53. Deux levures (Candida oleophila, Cryptococcus albidus) et deux souches de Pseudomonas syringae sont commercialisées respectivement contre les contamination fongiques post-récolte par Ecogen (Aspire™), Anchor Yeast (YieldPlus™), et EcoScience (BIOSAVE- 110 et-111).

Le principal problème rencontré avec ces biopesticides est leur efficacité limitée et, par conséquent, l'inconstance des résultats en conditions opérationnelles. Il faudrait augmenter leur efficacité (qui n'a pas été sélectionnée par la nature, les organismes prédateurs, sauf l'homme, n'ont aucun intérêt à dévaster leurs ressources).

On soupçonne, chez des levures antagonistes, l'effet d'enzymes lysant les parois des cibles. C'est le cas pour une exo-b-1,3- glucanase de la levure Pichia anomala contre Botrytis cinerea sur pommes.

Candida oleophila, d'Ecogen, est utilisée sur les agrumes et les pommes contre Penicillium digitatum. On suppose que ce biopesticide intervient surtout par compétition pour les substrats. Mais cette levure est également capable de sécréter diverses enzymes détruisant les parois (exo-b-1,3-glucanase, chitinase et protéases). Le rôle de ces enzymes a été vérifié en procédant à des inactivation ou à une surexpression des gènes correspondants. Il n'a pas l'air mirobolant et n'est perceptible qu'à faible densité des inocula sur P.digitatum et sur pamplemousses. M Bar-Shimon et al.; Current Genetics 45 (MAR04) 140-148.

54. Les protéines mitochondriales d'une souche biopesticide de Trichoderma harzianum ont été caractérisées (après un isolement difficile) par des chercheurs australiens. Ils ont utilisé la technique MALDI/ToF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) et spectrométrie de masse, ainsi que la chromatographie liquide suivie de spectrométrie de masse.

L'identification a nécessité une comparaison avec plusieurs autres champignons filamenteux. Les auteurs ont identifié 25 de ces protéines. J Grinyer et al.; Current Genetics 45 (MAR04) 170-175.

55. La transformation des champignons filamenteux est usuellement assurée par des procédés au polyéthylène glycol, par électroporation ou biolistique. Seul ce dernier procédé permet une fréquence de transformation acceptable. L'intégration par REMI (Restriction Enzyme-Mediated Integration), augmente cette fréquence, mais la distribution des inserts est non aléatoire et associée à une forte fréquence de réarrangements et de délétions dans le génome.

56. Une analyse du génome de Beauveria bassiana (champignon filamenteux entomopathogène) par mutagenèse insertionnelle avec un vecteur Agrobacterium tumefaciens du gène de résistance à l'hygromycine hgh d'Escherichia coli a été réalisée par des chercheurs allemands. A Leclerque et al.; Current Genetics 45 (FEB04) 111–119.

La fréquence de transformation est de 10-4 avec 90% de simples copies en divers endroits des chromosomes. Aucun des sites d'insertions ne subit de délétions ou de réarrangements, ce qui était à surveiller, vu l'objectif.

B.bassiana est très résistant à de nombreux fongicides, ce qui ne facilite pas la sélection des transformants. Seul les marqueurs de résistance au benomyl et la nitrate réductase sont utilisables. Même l'hygromycine est généralement très peu efficace chez les deutéromycètes entomopathogènes comme Beauveria. Les auteurs ont donc d'abord montré que la transformation par Agrobacterium est possible, puis que quelques modifications du gène hgh permet de l'utiliser dans la sélection des transformants.

Les Productions animales

Les gènes et leur expression

57. Le rat a été le premier animal domestiqué pour la recherche, et la première colonie a été constituée en 1856. Il en existe actuellement 234 souches inbred.

Le génome du rat dit de laboratoire (Rattus norvegicus) de 2,75 gigabases (celui de l'homme contient 2,9 Gb et celui de la souris 2,6 Gb) vient d'être complètement séquencé.

Ce n'est pas "un génome de plus" car le rat est un animal utilisé, notamment dans les études de physiologie, toxicologie, et modèles de plusieurs maladies. Son étude comme celle du Xénope, un batracien modèle, était handicapée par l'absence d'une génétique comparable à celle de la souris, malgré des débuts prometteurs au début du 20° siècle. Cette séquence devrait permettre de sauter en grande partie cette étape. Rat Genome Sequencing Project Consortium; Nature 428 (01APR04) 493-521. La première description de type linnéenne, en 1769, l'a appelé rat de Norvège, car on pensait qu'il en provenait. Le rat brun de laboratoire est, en fait originaire de l'Asie centrale, probablement de la Chine du nord, et a accompagné l'homme pour déboucher en Europe autour du 18° siècle. On dit qu'il a envahi l'Europe en remontant la Volga après un tremblement de terre en 1727.

Cette séquence n'est encore qu'une bonne ébauche de 90% du génome, mais c'est déjà bien. Certains des gènes observés chez le rat (et pas chez la souris) résultent d'une expansion des familles (phéromones, chimiosensibilité, immunité, détoxication et protéolyse).

Tous les gènes humains associés à des maladies possèdent des orthologues chez le rat mais le taux de substitutions synonymes de nucléotides est nettement différent de ceux des autres gènes. Ceci semble lié aux duplications segmentaires importantes qui constituent 3% du génome (contre 1-2% chez la souris et 5-6% chez l'homme).

Environ 30% du génome du rat ne s'aligne bien qu'avec la souris et correspond à des répétitions propres aux rongeurs.

Une forte corrélation existe entre la fréquence locale des insertions et délétions, les insertions d'éléments transposables depuis la divergence entre souris et rat, alors que ces évènements ont eu lieu indépendamment dans les deux animaux.

58. Le National Human Genome Research Institute (NHGRI) vient d'établir une première ébauche complète du génome du poulet. Il contient un 1 gigabase, soit le tiers du génome humain. Le centre de génomique de Beijing séquence, pour sa part, des segments de trois races de poulets domestiques pour en faire une analyse comparée. Il semble que la variabilité génétique soit très nettement supérieure à celle de l'homme. E Pennisi; Science 303 (05MAR04) 1451.

59. Les copies de gènes issus d'une rétrotransposition sont identifiables par l'absence d'introns, encore qu'on ait pu détecter des gènes ayant conservé un intron par copie d'un messager incomplètement épissé.

Plusieurs rétrogènes autosomiques (une vingtaine) issus d'une transposition de 16 gènes du chromosome X des Mammifères ont été identifiés au cours des derniers temps. Un rétrogène est un gène fonctionnel avec promoteur et tout l'arsenal des séquences régulatrices, ce qui n'arrive pas toujours, et livre alors les séquences transposées à une dégénérescence, faute de sélection fonctionnelle. Ils ont évolué, depuis, pour avoir une expression spécifique du testicule. Durant la méiose mâle les chromosomes sexuels se condensent sous la forme du corps XY et sont transcriptionnellement réprimés. On a supposé que ce '"silencing" du chromosome X a été la force majeure favorisant la rétrotransposition à partir du chromosome X. Certains de ces gènes sont en effet nécessaires à la reproduction mâle et le silencing durant la méiose est fâcheuse. Du coup les copies autosomiques fonctionnelles sont sélectionnées positivement. PJ Wang; Trends in Endocrinology & Metabolism 15 (MAR04) 79-83.

Le gène de la phosphoglycérate kinase en est un exemple classique. Chez l'homme,PGK2 localisé sur le chromosome 6, est dépourvu d'introns, et il est spécifiquement exprimé dans le testicule, alors que PGK1 du chromosome X en contient 10 et il est exprimé dans tous les tissus. La plupart- de ces rétrogènes issus du chromosome X sont exprimés dès le début de la méiose. Ils sont donc disponibles lors de la spermatogenèse, alors que le chromosome X est bloqué.

Il existe d'autres explications. Il se pourrait que ces "nouveaux" gènes assurent des fonctions nouvelles particulières de la spermatogenèse, et non plus une compensation de gènes momentanément non fonctionnels.

60. Les oestrogènes exercent leurs rôles régulateurs sur la transcription, soit directement sur des récepteurs nucléaires, soit par des mécanismes non nucléaires. Leur effet direct s'exerce (en association avec leurs récepteurs nucléaires) sur les séquences nucléaires appelées EREs (Estrogen Response Elements). Ce sont des séquences palindromiques parfaites ou imparfaites (différant par un ou deux nucléotides des palindromes parfaits) et répondant moins vigoureusement au signal. La nature du récepteur, ainsi que des interactions entre les récepteurs et d'autres facteurs de transcription modifient également les interactions avec les EREs.

Une revue de GJ Gruber et al.; Trends in Endocrinology & Metabolism 15 (MAR04) 73-78 porte sur la structure des EREs et sur les interactions de ces séquences avec les récepteurs des oestrogènes (ERa et ERb).

Le développement

61. ERa est responsable de la prolifération des cellules épithéliales de la glande mammaire sous l'action de l' œstradiol ovarien (E2). Et pourtant ces cellules n'expriment pas ERa. G Cheng et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (16MAR04) 3739-3746 ont analysé ce paradoxe, et ils concluent que ERa et ERb peuvent assurer indépendamment la prolifération sous l'action d'E2. ERb est observé à la fois dans les cellules épithéliales et du stroma, alors qu'ERa est strictement épithélial. Quatre heures après une dose unique d'E2, ERa disparaît du noyau des cellules épithéliales. ERa reçoit le signal prolifératif d'E2, induit la synthèse d'ADN, et disparaît aussitôt. La suite de la prolifération peut se dérouler en l'absence d'ERa ou ERb. ERb facilite le retour d'ERa dans le noyau et restaure donc la sensibilité à E2.

62. Le facteur embryotrophique de l'oviducte ETF-3 stimule le développement du trophectoderme et l'embryon à la naissance du souriceau. Des chercheurs de Hong Kong montrent que la cible de ce facteur est l'élément C3 du complément (un facteur de l'immunité).

C3b et iC3b dérivent de C3 et sont embryotrophiques, mais pas C3 lui-même, iC3b étant le plus efficace. L'oviducte produit donc C3 qui est ensuite clivé en C3b et iC3b qui sont les vrais facteurs embryotrophiques. YL Lee et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (26MAR04) 12763-12768.

63. MSY2 est impliquée dans la régulation de la stabilité des messagers maternels qui seront activés et utilisés au début de l'embryogenèse de la souris. J Yu et al.; Developmental Biology 268 (15APR04) 195-206 ont réduit sa concentration dans l'ovocyte par interférence ARN ciblée au seul ovocyte par un promoteur adéquat, et constatent que la fertilité des femelles est fortement réduite. La fécondation reste possible mais toute une série de phénomènes normalement observés font défaut, comme les oscillations des concentrations de Ca2+, l'exocytose des granules corticaux , etc… et, surtout n'achèvent pas leur méiose. Voir également le §8.

64. AJ Wagers et al.; Cell 116 (06MAR04) 639-648 analysent la plasticité des cellules souches des adultes. C'est le problème qui agite actuellement les foules, compte tenu du fait que les cellules souches embryonnaires posent quand même des problèmes éthiques.

Le malheur est que ces cellules sont considérées par certains comme des mythes. Chaque tissu comporte plus ou moins des cellules souches qui lui sont propres, Des déviations vers d'autres tissus ("transdifférenciation") de la différenciation de ces cellules sont l'objet du débat. Il existe, cependant, des publications sérieuses qui défendent l'existence de transdifférenciations, et ce Bulletin s'en fait, de temps en temps, l'écho. Si ces transdifférenciations existent, on doit en déduire une plasticité de ces cellules.

Le problème est qu'on évoque (ou qu'on souligne) la difficulté à caractériser de très rares cellules d'un tissu qui peuvent se loger dans un autre.

La revue analyse le rôle des cellules souches adultes dans la régénération et les exemples publiés de plasticité, dans le cas de la moelle osseuse ou celui des cellules hématopoïétiques.

La revue analyse de façon critique les éléments des démonstrations et suggère des critères le moins ambigus possibles.

65. E Fuchs et al.; Cell 116 (19MAR04) 769-778, analysent les rapports entre cellules souches et cellules environnantes. Il s'agit de leur niche écologique et de ce qui se passe quand on les en extrait (cas des utilisations thérapeutiques).

La niche protectrice est composée de cellules différenciées avoisinantes et d'une matrice extracellulaire, en sus des cellules souches proprement dites. Son rôle peut être déduit de ce qui se passe quand on injecte les cellules souches sous l'épiderme de cellules nude (sans système immunitaire) ou dans un tissu de souris normales.

Les classiques cellules souches embryonnaires (ES) isolées de la masse cellulaire centrale de blastocystes peuvent ainsi être propagées indéfiniment. Mais, si on les implante dans un tissu normal, on assiste à une explosion de différenciations anarchiques appelées tératomes. Si on les ramène vers leur niche normale, le blastocyste, elles reviennent à un comportement plus civilisé.

Le problème est de déterminer quand et comment les cellules souches somatiques, cette fois, établissent leur niche. Ce n'est pas simple car certaines de ces cellules sont relativement dispersées et isolées, comme si leur niche n'était pas strictement définie.Les auteurs analysent dans divers systèmes, les acteurs moléculaires (notamment les protéines d'adhésion) dans le maintien de la niche. Les auteurs insistent également sur les facteurs qui sont associés aux divisions asymétriques qui sont caractéristiques de ce type de cellule, avec une des cellules filles qui restent indifférenciée, tandis que l'autre va donner une lignée qui se différencie.

Dans leur niche, les cellules souches sont quiescentes et on peut donc penser que cette niche induit cette quiescence et empêche la prolifération, et surtout la différenciation.

Mais il doit bien exister un signal lançant cette différenciation, à un moment ou dans un circonstance donnée. Les cellules souches musculaires (appelées cellules satellites) restent attachées à la gaine (basa lamina) des faisceaux de fibres musculaires, et ne se différencient en myotubules qu'à la suite d'une blessure. Les tissus en constant renouvellement sont divisés en sous-unités qui possèdent chacune leur stock de cellules souches. C'est le cas du follicule pileux où elles résident dans un renflement au milieu de la racine, ou les cellules souches des cryptes intestinales localisées ver la base de la crypte , juste au dessus des cellules de Paneth.

Le follicule pileux est un cas intéressant de ce point de vue. Les cellules souches reçoivent un stimulus de cellules mésenchymateuses spécialisées de la papille dermique située nettement plus bas que les cellules souches, dans le follicule.

Durant le cycle du follicule on a une phase de croissance suivie d'une destruction où tout ce qui est au-dessous des cellules souches dégénère. Ceci ramène la papille dermique au contact de ces cellules souches ce qui déclenche la prolifération et la différenciation rapide d'un nouveau follicule.

66. Les groupes d'Axel et Jaenisch viennent de cloner une souris à partir d'un noyau de neurone olfactif d'adulte . K Egan et al.; Nature.428 (04MAR04):44-49.

Il faut rappeler que chacun de ces neurones exprime un seul récepteur olfactif parmi des milliers possibles à partir d'une famille multigénique. (environ 0.,1% des neurones récepteurs olfactifs expriment un même gène). La complexité de ce processus a fait supposer que des réarrangements géniques étaient à l'origine de cette particularité, un peu comme ceux engendrant la diversité des récepteurs dans les cellules immunitaires.

Ce clonage, en dehors du fait qu'il s'agit d'un clonage de plus à partir d'un noyau somatique, permet de démontrer qu'il n'y a pas de réarrangements géniques à l'origine des récepteurs de l'odorat. Cela prouve également que des noyaux de neurones fonctionnels peuvent donner des individus normaux et, notamment, fertiles. Les récepteurs olfactifs des souris clonées sont aussi divers que ceux de souris normales; Voir également l'analyse de cet article dans J Ngai; Cell 116 (19MAR04) 636-637.

67. On vient de montrer, chez le xénope, que l'information positionnelle antéro-postérieure dans le tronc est assurée par une séquence temporelle où un minuteur du mésoderme (hors organisateur) interagit avec ce dernier. Le minuteur active de façon colinéaire les fameux gènes Hox dans le mésoderme ventral et latéral précoce (c'est-à-dire le mésoderme non organisateur) Cette expression précoce des gènes Hox est transitoire, sauf si elle est stabilisée par des signaux provenant de l'organisateur de Spemann (la lèvre dorsale du blastopore). Une fois que le mésoderme et l'organisateur sont séparés lors de la gastrulation, aucun des deux ne peut plus déterminer l'axe antéropostérieur du tronc. Les déplacements observés à la gastrulation amènent continuellement de nouvelles cellules au contact de l'organisateur, ce qui crée le patron de structures ordonnées du tronc. SA Wacker et al.; Developmental Biology 268 (15APR04) 207-219..

68. On constate des différences spécifiques de sexe dans l'empreinte génétique indispensable au développement de l'embryon. Cela est illustrable par les gènes H19 et Igf2 dont les patrons de méthylation sont modifiés. Ces patrons sont bien spécifique des cellules, et ne dépendent pas d'une influence de la crête génitale sur les cellules germinales primordiales.. G Durcova-Hills et al.; Developmental Biology 268 (15APR04) 105-110.

Le système immunitaire

69. Le numéro d'Avril de Current Opinion in Immunology est consacré aux signaux régulant le développement des lymphocytes et leur différenciation.

L'an passé a été une année riche en développements dans ce domaine. De nombreux facteurs régulant des étapes critiques de la détermination du sort cellulaire comme la différenciation entre cellules B et T, entre les cellules T ab conventionnelles et cellules T NK (NKT pour Natural Killer) ont été déterminés. On a éclairci la régulation de la commutation isotypique, de l'hypermutation somatique et du développement des plasmocytes sécrétant les anticorps.

On savait depuis plusieurs années, à la suite d'analyses génétiques, que la voie Notch joue un rôle essentiel dans la promotion de la lignée T par rapport à la lignée B. Mais le mécanisme exact de cette détermination restait obscur. WS Pear et al.; Current Opinion in Immunology 16 (APR04) 167-173 analysent le choix entre T et NKT dans le thymus. Des souris transgéniques exprimant des marqueurs connus dans les cellules progénitrices multipotentes a permis de suivre ces rares cellules dans la moelle osseuse , le thymus et le foie..

F Radtke et al.; p. 174-179 s'intéressent à la voie Notch au cours du développement des cellules T et B. Les auteurs discutent des avancées récentes sur les ligands de Notch chez les mammifères, et notamment le partenaire de NotchIC (IntraCellular ou Notch activé probablement clivé à partir du récepteur membranaire) RBP-J. Notch intervient, découvre-t-on, à deux moments, en bloquant d'abord le développement des cellules B parmi les progénitrices communes des cellules B et T puis, plus tard, dans la détermination des cellules B folliculaires versus cellules de la zone marginale.

J Kang et al.; p. 180-190 s'intéressent aux fonctions des cytokines au cours du développement des lymphocytes. On connaît depuis longtemps le rôle essentiel d'IL-7, mais beaucoup moins ceux des autres cytokines, et leurs interactions. On connaît encore moins les gènes cibles de ces cytokines dans le développement des lymphocytes B et T. Les études récentes ont porté sur les signaux en aval du récepteur d'IL-7, ceux assurés par SCF (via c-kit), IL-15, TSLP et Flt-3L. La voie Wnt semble jouer un rôle important comme activateur potentiel de l'expression du même c-kit.

Lors du début du développement, dans le thymus, des progénitrices des cellules T déjà déterminées, les signaux en aval du récepteur TCR (T Cell Receptor) semblent avoir un impact plus important dans la destinée de ces cellules que les cytokines, en particulier dans la décision survie/destruction.

On sait depuis 20 ans que les étapes du développement des cellules Tab sont définies par l'expression des gènes des récepteurs CD4 et CD8 qui correspond à deux étapes clés. Le signal pré-TCR gouverne la b-sélection, tandis que les récepteurs ab assurent la sélection positive.

Les réarrangements au niveau du locus b chez les précurseurs des cellules T précèdent ceux du locus a. Les pré-TCRs sont composés d'une chaîne b associée à une pré-chaine a. Cette étape va permettre la conversion des CD4-CD8- (doubles négatives) en doubles positives (CD4+CD8+).selon un processus qui diffère, d'ailleurs, un peu entre souris et homme. R Zamoyska et al.; p.191-196 analysent l'intégration des deux types de signaux chez les lymphocytes T. C'est la découverte du rôle des facteur de transcription Ikaros et de la sous-unité Brg du complexe BAF (un complexe de remodelage de la chromatine) qui a fait avancer nos connaissances dans la régulation de la transcription des locus CD4 et CD8.

La tolérance immunitaire attire toujours autant l'attention, et on ne la comprend toujours pas bien. ES Venanzi et al.; p. 197-202 analysent la délétion clonale des cellules et son rôle dans l'évitement de l'auto-immunité. La découverte du gène Aire, d'une part, et celle du rôle des cellules épithéliales médullaires du thymus dans la sélection négative a permis d'avancer. On a également pu préciser le rôle des cellules T régulatrices (Tregs) dans cette régulation. Z Fehérvari et al.; p.203-208: discutent des Tregs CD25+CD4+. Enfin l'anergie des cellules T induite par les cellules dendritiques immatures., fait l'objet de la revue de F Macian et al.; p.209-216.

Un autre domaine où la curiosité n'est pas satisfaite, est la question de la mémoire immunitaire. Les descriptions cellulaires et moléculaires en sont peu satisfaisantes. Pour D Masopust et al.; p.:217-225, le fait de pouvoir, maintenant, pister les cellules T antigène-spécifiques in vivo, déterminer leur réactions et y examiner les gènes exprimés ont un peu fait avancer les connaissances. Ces études confirment que les cellules T mémoire dérivent des cellules effectrices, mais soulignent leur hétérogénéité, et la forte influence du milieu dans lequel elles évoluent.

Dans le cas des cellules B, leur différenciation a finalement été peu étudiée au-delà de leur détermination, M Shapiro-Shelef et al.; p.:226-234 s'appuyent sur l'étude de myélomes pour souligner le rôle des facteurs de transcription Blimp-1 et XBP-1 dans cette différenciation.

Blimp-1 est un répresseur nécessaire et suffisant pour obliger une cellule B à se différencier en plasmocyte sécrétant des anticorps. Il réprime directement un certain nombre de gènes importants, induit des inhibiteurs de cdk et des gènes impliqués dans la sécrétion des immunoglobulines. Son expression bloque tout autre différenciation possible des cellules B. en réprimant l'expression de gènes nécessaires aux cellules B activées et celles des centres germinaux.

Un autre problème évoqué par D Chowdhury et al.; p.235-240, est celui de l'exclusion allélique qui sous-tend l'hypothèse maintenant largement confirmée de Burnet selon laquelle un lymphocyte n'exprime qu'une seule immunoglobuline.

Ils analysent cette exclusion allélique dans le cas des chaînes lourdes. Celle-ci serait régulée par l'expression membranaire des immunoglobulines (Igs) chez les cellules pré-B. D'après les auteurs ces Igs asssurent la régulation via IL-7 qui est également nécessaire pour l'exclusion. Chez les cellules pro-B le signal IL-7 rend les gènes VH accessibles aux recombinases RAG par hyperacétylation des histones.

L'hypermutation somatique (SHM) et la commutation isotypique (switch recombination ou CSR) modifient les gènes chez les cellules B matures. La revue de E Besmer et al.; p.241-245 traite de l'hypermutation somatique. La commutation isotypique maintient la partie variable et, changeant la chaîne lourde, modifie la fonction effectrice. Ce qui est étonnant, c'est que la même enzyme, l'AID (Activation Induced cytidine Deaminase), assure à la fois des mutations ponctuelles et permet des recombinaisons intragéniques. Le clonage d'AID a beaucoup fait avancer les choses. Mais un des problèmes non résolus est que AID est surtout cytoplasmique, or sa cible est de l'ADN monobrin nucléaire accessible au cours de sa transcription.

Les anticorps ont des rôles régulateurs divers. H Wang et al.; p.246-250, discutent de la régulation du développement et, plus particulièrement de la détermination des cellules B par la spécificité des anticorps. Ils affirment que ceci intervient, en particulier, pour les cellules B périphériques, celles de la zone marginale et les cellules B1 et que les cellules entrant dans ces deux compartiments sont apparemment sélectionnées pour leur spécificité, ce qui serait également valable pour les cellules folliculaires.

A Patke et al.; p.251-255 analysent les mécanismes de survie des cellules B d'origine folliculaire. Ils discutent les interactions potentielles entre les signaux de la voie BAFF (voir le Bulletin de Septembre 2003 §42) et celle en aval des récepteurs des cellules B. Les deux voies utilisent NF-kB (Nuclear Factor kB), mais de deux façons différentes. Les signaux de survie sont assurés par une modification de la chromatine au niveau des promoteurs des cibles de NFkB.

70. La position et la structure de la chromatine du locus IgH de la chaîne lourde des immunoglobulines sont impliquées dans la régulation de la recombinaison V(D)J. M Fuxa et al.; Genes & Development 18 (15FEB04) 411-422.

La recombinaison V(D)J est responsable de la constitution du répertoire des récepteurs des antigènes. Elle rassemble les régions variables des immunoglobulines (Ig) et de récepteurs des cellules T (TCR) à partir de séquences disjointes des segments géniques des gènes variable (V), diversité (D) et de jonction (J). Cette recombinaison est possible grâce à la présence de séquences flanquantes conservées appelées RSSs (Recombination Signal Sequences) reconnues par les recombinases RAG1 et RAG2. Le complexe de ces deux protéines se lie à deux RSS compatibles, effectue une coupure double-brins entre les RSSs et les séquences adjacente. Après quoi les protéines RAG et des facteurs de réparation intervenant usuellement dans le processus de raboutage non homologue relient les extrémités.

Cette recombinaison n'a lieu que dans les lymphocytes, où elle est étroitement régulée. Dans la lignée lymphoïde B le locus IgH est réarrangé dans les cellules pro-B, avant la recombinaison des gènes des chaînes légères Igk et Igl  qui a lieu dans les cellules pré-B, alors que les gènes TCRb et TCRa des cellules T sont respectivement réarrangés dans les cellules pro-T et pré-T.

Pourtant les gènes RAG1 et RAG2 sont exprimés dans toutes les cellules progénitrices des cellules lymphoïdes et dans les cellules immatures T et B. On ne peut donc réguler ce système que par l'accès au substrat.

La recombinaison V(D)J du gène IgH a lieu avec une succession temporelle bien définie. Les réarrangements DH–JH précèdent la recombinaison VH–DJH. Les premières progénitrices des lymphocytes (ELP) et, plus tard, les progénitrices lymphoïdes communes (CLP) amorcent les réarrangements DH–JH, achevé lors des stades précoces des cellules pro-B. Les ELP et CLP donnent naissance aux cellules T, NK et dendritiques. Il n'est donc pas étonnant que ces cellules puissent présenter des allèles d'IgH réarrangés de DH–JH à faible fréquence. On ne peut jamais détecter de réarrangements VH–DJH dans les thymocytes ou les cellules dendritiques. Puisque la deuxième étape des réarrangements d'IgH n'a lieu que dans des cellules pro-B déterminées.

La recombinaison VH–DJH complète permet l'expression de la protéine Igµ pour donner le récepteur des cellules pré-B (pre-BCR), ce qui constitue un point de contrôle dans la conversion des cellules pro-B en pré-B.

Le locus IgH contient 150–200 gènes VH sur ~3 Mb, ce qui complique la formation de synapses classiques entre IgH distants. Les deux allèles intervenant ont une chromatine distendue à la périphérie des noyaux des cellules lymphoïdes non-B, tandis qu'ils redeviennent centraux et leur chromatine se contracte dans les cellules pro-B déterminées. Si l'on en croit la levure Saccharomyces cerevisiae, la périphérie du noyau s'oppose au "silencing" transcriptionnel.

La différenciation des CLP en pro-B dépend de trois facteurs de transcription: E2A, EBF, et Pax5 qui sont également indispensables à la recombinaison V(D)J des gènes IgH au début de la différenciation des cellules B. L'absence de E2A ou EBF bloque le développement des cellules B au stade où le gène IgH est encore dans sa configuration germinale. Ces facteurs de transcription activent le réarrangement initial DH–JH en activant l'expression de RAG1 et RAG2 et en favorisant l'accès à leur substrat.

L'absence de Pax5 n'empêche pas la progression de la différenciation dans la moelle osseuse jusqu'au stade pro-B, qui permet encore une différenciation lympho-myéloïde très large. La restauration de cette fonction dans des cellules Pax5-/- pro-B déclenche une différenciation plus spécifique en cellules B matures. Pax5 est donc le facteur décisif dans la détermination de la lignée B, en bloquant les autres options.

Par ailleurs, Pax5 régule la seconde étape, réservée aux cellules B de la recombinaison VH–DJH. Ce facteur facilite l'inclusion des gènes VH de l'extrémité 5' du locus. Dans les cellules pro-B Pax5-/-, les réarrangements sont 50 fois moins fréquents alors que la recombinaison DH–JH est normale. Et pourtant ces gènes VH sont inclus dans une chromatine où ils sont accessibles. Cette baisse de l'efficacité diminue pour les gènes VH quand la distance avec la région DH–JH diminue. Pax5 intervient donc dans les réarrangements des gènes VH distaux., mais plus pour ceux qui sont proximaux (plus proches de la région DH–JH).

Pax5 déprime la transcription du gène Notch1 de spécification des cellules T, et active celle du gène CD19 de la lignée lymphoïde B dans les thymocytes (A Souabni et al.; Immunity 17 (DEC02) 781-793).

Les auteurs montrent, enfin, que l'expression ectopique (hors du site normal) de Pax5 suffit pour accroître la recombinaison DH–JH et initier les réarrangements VH–DJH dans des cellules T immatures.Tout ceci indique que le locus IgH est d'abord replacé au centre du noyau probablement sous l'action d'EBF, facilitant, ainsi, la recombinaison VH–DJH dans le domaine proximal du locus. Ensuite Pax5 active une contraction à grande échelle du locus et facilite alors les réarrangements VH–DJH distaux. En collaboration avec des facteurs propres eu cellules B et absents dans les cellules T.

71. Trois articles récents de D Zhang et al.; Science 303 (05MAR04) 1522-1526, F Heil et al., p.1526-1529 et SS Diebold et al.; p.1529-1531, complètent le schéma qu'on se fait de l'intervention des récepteurs transmembranaires Toll-like (TLRs) dans les défenses de l'organisme. Les deux dernières publications montrent que les récepteurs déjà connus, TLR7 chez la souris, et TLR8 (humain qui en est très voisin) reconnaissent les ARNs simple brins (ssRNAs) de nombreux virus dans l'endosome, tandis que la première décrit une nouveau récepteur, TLR11, qui détecte les bactéries dans la vésicule biliaire et dans le tractus urinaire. Les similitudes entre TLR11 et TLR5 suggèrent que c'est une protéine de type flagelline (comme celle présente dans les pilis d'adhésion des bactéries des infections urinaires) est reconnue par ce récepteur. Comme l'homme ne dispose que d'une version tronquée du récepteur, la fréquence des infections urinaires pourrait ainsi être expliquée.

TLR7 détecte les ssRNAs riches en U (notamment l'ARN de l'influenza) ce qui explique ce soit par lui qu'une substance active, l'imiquimod, stimule les défenses via l'interféron a.

M Komai-Koma et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (02MAR04) 3029-3034 montrent, par ailleurs, que les pathogènes participent au développement des cellules T.

La plupart des études sur les récepteurs TLRs ont été centrées sur leur rôle dans le système immun inné. Des cellules T naïves expriment fortement TLR2 après avoir été activées par interaction avec un anticorps anti-T et l'interféron a (IFN-a). De telles cellules produisent des cytokines en réponse au ligand de ce récepteur des lipopeptides bactériens. Les cellules T "mémoires" CD4+CD45RO+ périphériques, qui expriment en permanence ce récepteur, produisent de l'IFN-g en réponse à ces lipopeptides.

TLR2 joue le rôle de récepteur costimulateur dans le développement antigène-spécifique de cellules T et contribue au développement des cellules T "mémoires". Ce qui revient à dire, dans ces conditions, que les pathogènes contribuent, par leurs motifs particuliers, mais non spécifiques, au développement de la mémoire immunitaire. TLR2 est donc aussi un récepteur co-stimulateur.

72. La maîtrise de la flore intestinale est assez étonnante. Il existe plus de 400 espèces différentes dans des proportions, variables selon les individus, mais stables. Elle représente environ un kilogramme et présentent toutes les patrons moléculaires reconnus par le système de l'immunité innée.

Elle présente, comme je l'ai souvent évoqué, une homéostasie qui joue contre les bactéries pathogènes, ou même l'invasion par d'autres bactéries. Cette homéostasie n'est pas le fait que des bactéries elles-mêmes mais d'un jeu entre ces populations et le système immunitaire intestinal.

De nombreuses interactions bidirectionnelles sont découvertes. Les bactéries commensales influencent la prolifération épithéliale en injectant dans cet épithélium des facteurs qui bloquent la dégradation de la b-caténine. Elles stimulent l'exportation du noyau du fameux facteur NF-kB qui régule la production des chimiokines pro-inflammatoires, par les cellules épithéliales. AJ Macpherson et al.; Science 303 (12MAR04) 1660-1665 révèlent que la muqueuse intestinale avec son épithélium, la couche conjonctive sous-jacente (lamina propria)et les tissus lymphoïdes associés (GALT) se liguent pour empêcher le franchissement de la barrière intestinale par des commensaux grâce à la défense par les immunoglobulines IgA.

Cette réponse caractéristique est permise par la présentation aux GALT de ces bactéries associées aux cellules dendritiques.

Les commensaux sont, en fait rapidement tués par les macrophages s'ils s'aventurent au delà de la barrière intestinale. Mais les cellules dendritiques sont capables d'en entretenir pendant plusieurs jours pour les présenter au système immun. Ces cellules dendritiques sont confinées au domaine intestinal par les ganglions lymphatiques mésentériques. Ceci assure que ces intrusions se limite localement aux besoins des défenses, et évite le déclenchement des mécanismes de l'inflammation avec infiltrations de neutrophiles et la production des chimiokines caractéristiques.

Ces IgA ne sont pas anodines car elles représentent environ 70% des immunoglobulines sécrétées dans le corps.

Voir également le commentaire de JPKraehenbuhl et al.; Science 303 (12MAR04) 1624-1625.

Les Vaccins

73. On pense actuellement que les cellules dendritiques sont les seules cellules capables d'activer les cellules T. M Gerloni et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (16MAR04) 3892-3897 montrent que les lymphocytes B naïfs peuvent être modifiés en utilisant des ADNs non viraux codant des antigènes pour devenir de très efficaces cellules présentatrices de ces antigènes avec, donc, une double capacité de synthèse et de présentation d'antigènes.

Une injection unique d'une centaine de ces lymphocytes transgéniques dans des adultes histocompatibles active de façon durable et spécifique les cellules T. Cet amorçage des cellules T se fait sans intervention des cellules dendritiques et permet, de plus, la constitution d'une mémoire immunitaire. Ce sont donc des vaccins potentiels intéressants.

74. Les chercheurs de l'AFSSA à Maisons-Alfort ont construit un vecteur phagique basé sur un phage filamenteux pour exhiber un épitope immunodominant (la boucle GH) de la protéine VP1 capsidale du virus de la fièvre aphteuse. Celui-ci est exprimé au début de la protéine de capside majeure du phage via un espaceur. Les 20 premiers acides aminés de cette protéine présente à 2700 exemplaires dans un virion, sont extracellulaires et on peut en supprimer 5 sans perturber l'encapsidation. On peut aller au delà en permettant l'assemblage d'une capside mosaïque.

Ce vecteur est effectivement antigénique mais la production d'anticorps est encore faible. YJ Kim et al.; Archives of Virology 149 (FEB04) 365-377.

Les Pathogènes

75. L'utilisation des radeaux lipidiques par les bactéries infectieuses fait l'objet d'une revue de chercheurs genevois (F Lafont et al.; Current Opinion in Microbiology 7 (FEB04) 4-10). L'adhésion bactérienne aux cellules de l'hôte est souvent un prérequis pour une infection, même quand la bactérie se contente de délivrer une toxine.

L'existence même des radeaux est encore mal établie. Ils sont probablement très petits et ne peuvent contenir qu'une dizaine de protéines, mais devraient pouvoir coalescer, notamment quand la fixation de ligands des protéines des radeaux entraîne leur regroupement. Il est, par ailleurs vraisemblable qu'il puisse exister plusieurs sortes de radeaux, comme le montrent la membrane "avant" et "arrière" des lymphocytes T en migration.

Ces radeaux sont probablement des sites de concentration. Les radeaux permettent, par exemple, des regroupements de lipides particuliers qui peuvent être utilisés par des toxines bactériennes. Ainsi les toxines de type A-B5 (enzyme A et récepteur B pentavalent de lipides membranaires) comme la toxine cholérique, la shigatoxine et les entérotoxines LTI et LTII d'Escherichia coli, se lient respectivement aux glycosphingolipides GM1, Gb3, GM1 et GD1. Le caractère pentavalent, de la protéine B fait qu'elle a une préférence pour des radeaux regroupés et, alors, avec une très forte affinité.

Plusieurs autres toxines, notamment les toxines formant des pores, ont besoin de "récepteurs" concentrés car elles sont produites sous une forme soluble. Ces pores sont des oligomères qui peuvent être constitués de six (leucotoxines des staphylocoques), sept (aérolysine ou a-toxine staphylococcale), et jusqu'à 50 monomères comme dans le cas des toxines dépendant du cholestérol (CDT, c'est-à-dire les SLO ou streptolysine O et PFO ou perfringolysine O). L'assemblage de ces monomères nécessite la présence de molécules dont on sait qu'elles sont logées dans des radeaux. C'est le cas de protéines ancrées à la membrane par le glycosylphosphatidyl inositol (GPI), comme les récepteurs de l'aérolysine, l'a-toxine de Clostridium septicum, probablement la toxine vacuolisante VacA d'Helicobacter, ou le cholestérol comme les récepteurs de SLO, PFO, et enfin à la fois le cholestérol et la sphingomyéline, comme la cytolysine de Vibrio cholerae. Il est vraisemblable que l'antigène protecteur de B.anthracis fonctionne de la même façon. Il forme des heptamères dans la membrane d'une façon reminiscente de l'aérolysine.

Un certain nombre d'observations, notamment celle que les pathogènes intracellulaires ne sont pas dirigés vers les lysosomes indiquent que ces pathogènes ne rentrent pas par la voie classique de l'endocytose assurée par la clathrine, mais par des domaines différents, peut être les radeaux. Mais une telle voie ne garantit nullement un échappement à la voie endolytique.

L'injection dans le cytoplasme de la cellule-hôte, de protéines effectrices par des systèmes de sécrétion de type III, facilite l'entrée de la bactérie. C'est le cas de la formation du macropinosome de Legionella pneumophila qui est enrichi en gangliosides et protéines ancrées par le GPI, ce qui suggère une implication de radeaux dans la formation du macropinosome.

Par ailleurs, des protéines comme cdc42, qui sont impliquées dans les réarrangements du cytosquelette, sont affectées par plusieurs bactéries. ErbB2 qui intervient dans les infections par Neisseria gonorrhoeae, ainsi que les protéines impliquées dans les signaux phosphoinositides utilisés par Chlamydia pneumoniae, S.typhimurium et S.flexneri, qui sont des protéines de la cellule entraînant un remodelage de la membrane plasmique. Ces protéines ont été décrites comme particulièrement concentrées dans les radeaux lipidiques.

76. Les défenses dans les voies respiratoires sont mises à rude épreuve, et, en contrepartie déploient de nombreuses armes contre les infections. On vient de montrer qu'elles sont capables de supprimer le "quorum sensing" de Pseudomonas aeruginosa un pathogène opportuniste. Cette bactérie dispose, pourtant de deux systèmes concurrents de cette détection de la densité cellulaire, celle de la N-(3-oxododécanoyl)-L-homosérine lactone (3OC12-HSL) et de la Nbutanoyl-L-homosérine lactone (C4-HSL), qui régulent la production des facteurs de virulence et la formation, notamment, des biofilms. L'épithélium respiratoire humain détruit la 3OC12-HSL. CH Chun et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (09MAR04) 3587-3590.

77. Le virus de la bursite infectieuse du poulet (IBDV, ou maladie de Gumboro d'après le nom d'un trou américain) se multiplie rapidement dans les lymphocytes B en développement dans la bourse de Fabricius, entraînant une immunosuppression et donc une sensibilité accrue aux maladies. Seul l'un des sérotypes, le sérotype I est pathogène pour le poulet.

Il comporte deux segments d'ARN doubles brins emballés dans une capside constituée des deux protéines VP2 et VP3, avec de multiples exemplaires de l'ARN polymérase, VP1. Les deux segments A et B de deux souches hypervirulentes ont été comparée avec 25 autres souches du virus. LL Kong et al.; Archives of Microbiology 149 (FEB04) 425-434 (des chercheurs malais). Ils ont détecté 28 différences d'acides aminés entre les souches hypervirulentes et les autres. Il reste quand même à vérifier leur importance dans la virulence.

78. On a réussi à déterminer la structure de l'hémagglutinine H1 du fossile viral de la grippe espagnole de 1918 à 3 Å. J Stevens et al.; Science 303 (19MAR04) 1866-1872. Elle ressemble beaucoup à celle des virus aviaires.

On a pu récupérer des fragments de ce génome dans des victimes de l'épidémie enterrés dans le permafrost de l'Alaska, ainsi que dans des échantillons pulmonaires conservés dans le formol de deux soldats américains morts lors de cette épidémie.

79. On avait bien séquencé complètement les gènes des NS, HA, NA et M du virus de la "grippe espagnole" de 1918, mais sans y trouver quoi que soit de significatif justifiant sa très haute virulence

Des chercheurs américains (dont certains de l'US Army) ont, alors, construit des virus de la grippe A comportant de deux à cinq gènes de la souche H1N1 de 1918 pour essayer de d'établir des synergies entre les différents segments génomiques pour comprendre son extrême virulence. Les virus comportant l'hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA), la protéine de matrice (M), ou la protéine non structurale (NS) ou la nucléoprotéine (NP) ou tout virus associant HA et NA de 1918 sont fortement létaux pour la souris BALB/c.

Le virus le plus proche encore existant est la souche H1N1A/Swine/Iowa/30 (Sw/ Iowa/30) de 1930. Des souris vaccinées contre ce virus sont résistantes à la souche "espagnole". Des vaccins contre d'autres virus H1N1, A/PortoRico/8/34, A/Texas/36/91 ou A/New Caledonia/20/99, ne confèrent qu'une protection relative, et le virus prolifère dans les poumons. Cette protection partielle peut constituer un pis-aller en première urgence en cas d'épidémie du type "espagnol", mais c'est surtout un moyen de cribler des substances antivirales contre ce virus.

L'expression du segment M du génome (il y en a huit codant dix protéines) est bloquée par les inhibiteurs anti-viraux amantadine et rimantadine. Un virus recombinant portant les deux glycoprotéines d'enveloppe, HA et NA de 1918, avec les autres gènes d'une autre souche plus récente (A/WSN/33) est sensible in vivo et in vitro à d'autres inhibiteurs viraux de la NA, zanamivir et oseltamivir. Cette souche recombinante (1918 HA/NA:WSN) reste hypervirulente pour la souris par voie intranasale sans aucune préadaptation à l'espèce. Des recombinants utilisant HA et NA des souches A/New Caledonia/20/99 (New CalHA/NA:WSN) sont très atténués par rapport à la souche réarrangée HA/NA 1918:WSN ou la souche parentale WSN.

80. On sait que l'évasion immunitaire ne nécessite parfois qu'une seule substitution d'acide aminé en des sites critiques qui modifient l'affinité pour l'anticorps sans altérer sensiblement la structure globale de la protéine, et donc la reconnaissance du récepteur sialylo-oligosaccharidique, et donc le cycle viral. C'est une des caractéristiques des différences entre souches "aviaires " et "humaines". Des chercheurs russes utilisent les mutants échappant à des anticorps monoclonaux donnés pour analyser la structure de l'hémagglutinine qui est la principale cible de ces anticorps et surtout les stratégies qu'on peut en déduire dans l'évitement des anticorps. NA Ilyushina et al.; Virus Research 100 (15MAR04) 237–241.

Ils ont travaillé sur la souche de canard A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) typique des souches aviaires qui nous menacent en permanence. Ils ont utilisé des récepteurs artificiels ayant en commun la séquence Neu5Aca2–3Gal terminale, mais différant dans le/les saccharide(s) suivant(s). Leurs résultats montrent que des mutations au voisinage du site reconnaissant le récepteur de l'hémagglutinine (HA) change le patron de la reconnaissance du troisième saccharide.

L'une des astuces de l'évasion consiste à ajouter des sucres supplémentaires. C'est le cas de souches H2N2 avec des glycosylations supplémentaires en positions 131, 160 ou 187. Mais ils ont moins d'affinité pour le récepteur. Si on utilise des anticorps monoclonaux (Mabs) à faible affinité, on récolte des mutants qui conservent la propriété de se lier à l'anticorps. Le substitutions dans ce cas ont porté sur des acides aminés au voisinage du site de HA reconnaissant le récepteur. Dans certain cas, le fait de mieux (et donc plus vite) reconnaître les cellules cibles permet d'échapper aux anticorps.

81. Une seule substitution Glut627>Lysine dans la protéine PB2 (une des composantes de la polymérase de l'ARN viral) convertit une souche de grippe A H5N1 (du même type que celle de HongKong 1997) non létale en une souche létale pour la souris.Ces deux formes ont été isolées à partir des 18 personnes infectées par la volaille à HongKong en 1997 (dont 6 sont mortes). La forme non létale ne se réplique que dans les poumons. La souche létale entraîne une infection généralisée (systémique).

La substitution accélère la réplication du virus dans les tissus de la souris sans en changer les tropismes. K Shinya et al.; Virology 320 (15MAR04) 258-266. On a retrouvé la même mutation chez un virus H7N7 isolé d'une personne morte au cours de l'épidémie européenne de 2003 qui a surtout causé des cas de conjonctivite. (RA Fouchier et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (03FEB04) 1356-1361 analysé dans le Bulletin de Mars §110).

82. Un article de MA De Marco et al.; Veterinary Microbiology 98 (05MAR04) 197-208, analyse la circulation des virus de la grippe dans les marais italiens, particulièrement entre canards et foulques cohabitant dans les mêmes lieux. Ce sont les résultats d'une enquête ayant duré six ans. Ils observent que 17% des canards et 33% des foulques ont des anticorps contre au moins un sous-type de HA. Les canards sont séropositifs pour tous les sous-types sauf H3, H4, H7 et H12 (curieux pour H7). Les foulques sont séropositifs pour les seules H3 et H10. Les virus du sous-type H1N1 sont de loin les plus fréquents dans les prélèvements. Les autres souches isolées sont des H10N8, H5N2 et H3N8.

84. Les virus de type Norwalk (Norovirus) sont une cause très fréquente de gastroentérites humaines aigues et circulent chez les veaux. Une étude de leur distribution dans des veaux du Michigan et du Wisconsin est publiée dans AG Wise et al.; Virus Research 100 (15MAR04) 165-177.

Elle montre que ces virus sont relativement fréquents dans les élevages étudiés, mais que ce sont des souches différentes des souches humaines qui sont présents dans les élevages. Deux sous-groupes sont présents, “Jena-like” et “Newbury agent-2-like” sur les trois reconnus.

85. Le coronavirus responsable du SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) fait partie d'une famille de virus dont la réplication n'est vraiment pas bien connue. Des chercheurs de Marseille associés à des chercheurs de Leiden décrivent la structure cristalline à 2,7Å d'une des sous unités du virus, la nsp9. C'est une protéine qui se lie aux ARNs simple brin, avec un repliement particulier faisant penser à un repli oligosaccharide/oligonucléotide. MP Egloff et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (16MAR04) 3792-3796.

86.. La coiffe amont (5'-cap) et la queue poly(A) aval des messagers sont reconnus, respectivement, par le facteur d'initiation de la traduction, eIF4E, et la protéine PABP (Poly(A)-Binding Protein). Ces deux facteurs, à leur tour interagissent avec eIF4G. Ceci entraîne, apparemment, la circularisation des messagers.

La transcription des onze segments monocistroniques d'ARN double brin du génome d'un rotavirus a lieu au sein du virion et les messagers sont sécrétés à travers des canaux de la double capside du virus. Les protéines virales sont traduites à partir de messagers non polyadénylés. Les onze messagers des rotavirus portent une coiffe amont et se terminent la plupart du temps par une séquence consensus activant la traduction qui n'est pas polyadénylée et se substitue probablement au poly(A). Cette activation générale fait intervenir la protéine non structurale NS3 du virus. En fait, la partie aval non traduite du messager du gène 6 stimule l'expression de la protéine majeure de capside VP6.. Il faut se rappeler qu'il faut 780 molécules de VP6 par virion. AD Yang et al.; Archives of Virology 149 (FEB04) 303–321.

87. Les prions peuvent avoir des fonctions cellulaires variées, comme l'incompatibilité nucléaire observée chez Podospora anserina, avec [Het-s], ou la protéase vacuolaire B de Saccharomyces qui n'est active que sous la forme [b]. [URE3], et probablement [PSI] correspondent à des anomalies pathologiques. [PIN+] parait être une modification neutre. Une revue de RB Wickner et al.; Genes & Development 18 (01MAR04) 470-485 discutent de ces fonctions "géniques" et infectieuses.

Il souligne que la plupart des amyloïdoses ne sont en fait pas infectieuses et ne peuvent, en l'état, correspondre à la définition des prions. La modification est autoentretenue, mais pas transmissible ce qui pose la question de savoir pourquoi.

Dans le cas de la BSE et des autres encéphalites transmissibles (TSEs), la protéine modifiée devient toxique, cas de PrP. Pour d'autres il peut juste rendre la protéine inactive, cas d'[URE3] et [PSI] de la levure. Enfin il peut, au contraire, rendre une protéine active, cas de [Het-s] de Podospora anserina et [b] de la levure.

Ce qui distingue les prions des virus et des plasmides, ce sont trois caractéristiques. La première est une élimination réversible. Quand un acide nucléique autonome est délété, il ne peut être rétabli que par une réinfection. Un prion provient d'une protéine cellulaire qui est convertie et l'élimination des formes "prions" ne garantit pas que la protéine normale ne peut redonner le prion, car son gène est maintenu et c'est la protéine mal conformée qui est éliminée.

La seconde est que la surproduction de la protéine accroît la fréquence de la conversion en prion. C'est un problème de probabilité.

La dernière caractéristique est l'exigence du gène codant la protéine normale, pour qu'elle puisse être modifiée en prion, et que la propagation ait lieu.

Il est évident que des mutations inactivant la protéine vont donner un phénotype analogue à une mutation dans le gène. Mais ceci est n'est valable que quand la protéine est la forme active. [URE3] et [PSI] satisfont à ce critère, étant les prions respectifs d'Ure2p et de Sup35p. l'identification de[Het-s] et [PIN] comme prions relève d'une variante de ces critères.

[URE3] est une mutation non chromosomique isolée par Lacroûte en 1971 au cours du même criblage qui a permis de définir ure2. A l'époque la pression du dogme de l'hérédité nucléique était telle qu'on pouvait difficilement avancer une origine protéique. Elle satisfait tous les critères évoqués plus haut.

Le caractère non mendélien n'est cependant pas suffisant pour établir la nature de prion. Inversement une protéine automodifiable à une vocation à donner un prion et elles sont nombreuses, ne serait-ce que les zymogènes autoactivés en protéases comme l'est [b]. Les auteurs font le tour des prions de levure en évoquant, notamment le rôle des chaperones, comme Hsp104. Ils discutent également de la possibilité que l'hérédité corticale des Paramécies pourraient bien être un autre exemple de prions, car transmissible sans modifications génomiques. Ce phénomène peut être considéré comme une hérédité d'organites, mais il en faudrait un support nucléique. On constate que le cortex maternel organise celui des cellules filles avec des modifications possibles.

Enfin le code des histones base des phénomènes épigénétiques est, finalement, également une hérédité de type protéique. Les enzymes modifient les histones se fixent spécifiquement sur des histones déjà modifiées, fournissant ainsi la base d'un mécanisme auto-entretenu.

Ils s'intéressent également à la barrière d'espèce, particulièrement visible pour la tremblante entre souris et hamster, mais également pour les prions de levure. Ils discutent également la question des "souches" de prions.

88. Il semble que plus d'une forme de prion puissent être responsable de la BSE. On le soupçonnait dans le cas des Creutzfeldt-Jakob sporadiques et de la scrapie avec des manifestations du prion légèrement différentes.

Plusieurs équipes ont découvert des cas de BSE atypiques. Les cas italiens seraient moléculairement proches de celui de certains cas de Creutzfeldt-Jakob sporadiques. lié à l'accumulation de prions. C Casalone et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (02MAR04) 3065-3070.

On ne sait pas encore si ces nouvelles formes sont transmissibles. Mais on peut penser que cela ne va pas simplifier la situation. Les auteurs italiens l'appellent donc "bovine amyloidotic spongiform encephalopathy (BASE).

La répartition des prions dans le cerveau est différente de la distribution classique et c'est sur ce point que les similitudes avec le Creutzfeldt-Jakob sporadique sont les plus frappantes, mais aussi celles qui peuvent soulever des doutes.

D'autres publications décrivent des anomalies dans des cas récemment analysés. C'est le cas des trois cas décrits par l'AFSSA-Lyon dans AG Biacabe et al.; EMBO Reports 5 (JAN04) 110-115, avec une protéine PrPres non glycosylée de taille supérieure à la normale et un marquage très fort par un anticorps spécial.

Des chercheurs japonais signalent, eux, la présence d'une PrPres chez un bovin de seulement 23 mois apparemment asymptomatique. Y Yamakawa et al.; Japanese Journal of Infectious Diseases (OCT-DEC03) 221-222. Voir le commentaire de D Normile; Science 303 (27FEB04) 1285.

89. La plupart des anticorps anti-PrP ne reconnaissent que des épitopes linéaires ou discontinus de la protéine, et on les utilise pour immunodétecter le prion. Ces anticorps ne savent plus reconnaître les deux isoformes de la protéine quand elles sont dénaturées, il faut éliminer la forme normale PrPC par protéolyse avant immunomarquage. Un anticorps monoclonal appelé 15B3, engendré par immunisation de souris dépourvue de PrP murine et exprimant la PrP bovine recombinante reconnaîtrait un épitope conformationnel de PrPSc comportant un assemblage de deux molécules de PrP. Mais on n'en sait pas plus. Il faut donc raffiner les anticorps monoclonaux utilisés, si on veut pouvoir distinguer l'isoforme associée à la pathogénicité. Il faudrait augmenter leur réactivité et leur spécificité. Des chercheurs japonais ont établi un nouveau jeu d'anticorps permettant d'identifier les isoformes pathologique des prions en utilisant la méthode classique d'immunisation de souris dont le gène PrP a été délété avec l'isoforme pathogène issue de cerveaux de souris atteintes ou une PrP recombinante. Sept épitopes linéaires (non conformationnels) correspondant aux acides aminés (aa) 56–90, 119–127, 137–143, 143–149, 147–151, 163–169 et 219–229, peuvent être définis par sept groupes d'anticorps monoclonaux. Les auteurs ont, ensuite, essayé d'établir si l'un de ces épitopes est situé sur une surface accessible du prion PrPSc,et sans succès. Il faut complètement dénaturer PrPSc pour que ces épitopes soient accessibles aux anticorps choisis. Cl Kim et al.; Virology 320 (01MAR04) 40-51.

90. La mort neuronale est une marque des maladies animales à prions. PrPSc, ne semble pas toxique par elle-même. On vient de montrer que le pontage de PrPC, c'est à dire la protéine normale, avec des anticorps déclenche une apoptose rapide et étendue des neurones de l'hippocampe et dans le cervelet. PrPC semble donc réguler la survie des neurones. Il se pourrait donc que le pontage de PrPC par des PrPSc oligomériques pourrait jouer le même rôle que les anticorps. L Solforosi et al.; Science 303 (05MAR04) 1514-1516.

91. Le mouton peut être infecté par le prion de l'encéphalopathie spongiforme bovine (BSE). La comparaison des prions des souches atypiques de tremblante du mouton avec ceux de mouton infectés par la BSE; permettrait de distinguer ces formes par Western blotting (PrPres) ou par immunohistochimie (PrPd) chez des moutons atteint naturellement par la tremblante ou artificiellement infectés par la forme bovine, ce que l'on ne peut faire par les signes cliniques. S Lezmi et al.; Journal of Virology 78, n°7 (APR04) 3654-3662.

92. Les aptamères sont des séquences ARNs qui se replient selon des structures originales permettant de reconnaître n'importe quelle cible moléculaire.

La construction d'aptamères avec des substitutions de 2'-fluoropyrimidine liant sélectivement les feuillets b de la protéine PrP. Ces aptamères inhibent l'accumulation de PrPSc en un essai in vitro. NM Sayer et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (26MAR04) 13102-13109, viennent de préciser les parties minimales de deux de ces aptamères conservant la capacité de reconnaissance. Ils ont également établi la structure secondaire de ces aptamères. Un site interne de biotinylation de l'aptamère a été déterminé.

93. Les cellules de Paneth sécrètent les a-défensines intestinales qui sont des peptides microbicides. La cryptdine-4 (Crp4) est la plus efficace sur les bactéries des a-défensines. On vient de montrer que des substitutions Arg en Asp dans Crp4 atténuent ou éliminent carrément son activité quelle que soit l'Arg affectée, ce qui est quand même curieux. H Tanabe et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (19MAR04) 11976-11983.

Les Productions Microbiennes

94. KA Borkovich et al.; Microbiology & Molecular Biology Reviews 68 (MAR04) 1-108. tirent quelques leçons du génome maintenant séquencé du champignon filamenteux modèle Neurospora crassa. Ils ajoutent les annotations de 100 de ces gènes, soit environ 10% du nombre estimé. Une des surprises est qu'un grand nombre de gènes n'ont pas d'homologues facilement détectables chez Saccharomyces cerevisiae. On l'explique par la multicellularité de cet organisme. Parmi les particularités on peut citer un plus grand nombre de transporteurs de sucres, de capteurs de l'environnement et une machinerie métabolique apparemment plus diversifiée.

On y détecte, de plus, un certain nombre de mécanismes de "silencing"dont le plus connu est le RIP (Repeat-Induced Point mutation), une défense contre les séquences dupliquées, comme celles issues de la multiplication des transposons. On constate, cependant, que RIP impose des contraintes au cours de l'évolution des gènes comme des génomes, en limitant la diversification génétique par duplication et divergence. Un des intérêts de ce génome réside dans la comparaison avec les autres champignons filamenteux entre ce généraliste et les pathogènes, par exemple.

95. L'apomixie consiste à éviter la complétion de la première ou de la seconde division méiotique. Le fait que les souches apomictiques de levures œnologiques (et également d'autres levures industrielles) soient particulièrement fréquentes suggère que l'apomixie confère, dans ce milieu, un avantage sélectif, probablement en permettant la formation et, surtout, en favorisant le maintien des combinaisons géniques favorables.

La majorité des levures industrielle est, de plus, aneuploïde, et Saccharomyces cerevisiae est particulièrement tolérante vis à vis des pertes ou des gains de chromosomes. Mais cette situation ne peut se perpétuer que si la méiose n'intervient pas, avec ses vérifications. Enfin les levures utilisées en vinification accumulent les réarrangements chromosomiques.

Des chercheurs de Sevilla ont analysé une souche apomictique œnologique d'une Saccharomyces cerevisiae. Les asques ne contiennent que deux spores qui ne peuvent pas donner lieu à conjugaison, mais les descendantes renouvellent le processus.

On peut, par contre, accroître un peu la formation de tétrades en jouant sur la concentration de glucose et de zinc dans le milieu de sporulation (une technique connue depuis longtemps). Mais cette formation est, en réalité liée à une endomitose qui donne alors deux dyades. Il s'agit d'une série de mutations récessives toutes localisées sur le chromosome VIII. F Castrejon et al.; Current Genetics 45 (APR04) 187-196.

On sait que l'éthanol induit des cassures chromosomiques (et des pertes chromosomiques) et c'est probablement la réparation des cassures qui provoque les réarrangements. Ceux-ci sont particulièrement fréquents dans les chromosomes VIII et XII. L'idée que ces réarrangements interviennent dans l'adaptation à ce milieu difficile est alimentée par le fait que la résistance aux sulfites, par exemple, est due à une recombinaison grâce à une microhomologie entre les chromosomes VIII et XVI.

Mais de telles modifications doivent être stabilisées et les souches isolées sur le plan reproductif. Les aneuploïdies et translocations empêchant la méiose sont d'une grande aide dans ce domaine.

Les gènes SPO12 et SPO13 du chromosome VIII, interviennent dans la prophase de la première division méiotique et sont responsables de la non disjonction observée chez les souches apomictiques. La protéine SPO12 interagit avec les protéines Dbf2 et Dbf20 impliquées dans la disjonction mitotique des chromatides.

Un chromosome VIII supplémentaire porteur du locus SPO12 supprime les mutations dbf2 qui, par elles-mêmes, entraînent des anomalies de distribution des chromosomes.

SPO13 freine la progression des divisions mitotiques et méiotiques, permettant la mise en place de l'appareil de la seconde division méiotique pendant la première.

96. La fermentation ammoniacale (réduction du nitrate en ammonium couplée à l'oxydation d'un substrat carboné comme l'éthanol avec phosphorylation directe du substrat) des champignons est une nouvelle voie à la fois dissimilatrice et assimilatrice de l'azote. Elle permet de récupérer de l'énergie en anoxie et d'adapter le champignon à la baisse de la tension d'oxygène.

Fusarium oxysporum réduit le nitrate en ammonium et oxyde simultanément l'éthanol en acétate pour recharger l'ATP. Les gènes d'Aspergillus nidulans impliqués dans la fermentation de l'ammoniaque ont été caractérisés avec des mutants. Les nitrate et nitrite réductases assimilatrices (produits des gènes niaD et niiA) sont indispensables à la réduction du nitrate et à la croissance en anaérobiose par fermentation de l'ammoniaque. L'oxydation de l'éthanol est couplée à la réduction du nitrate et catalysée par l'alcool déshydrogénase, la CoA-aldéhyde déshydrogénase acylante et l'acétyl-CoA synthétase (Acs codée par le gène facA). Ce mécanisme est semblable à celui de F.oxysporum sauf qu'A.nidulans utilise Acs pour recharger l'ATP au lieu de l'acétate kinase ADP-dépendante de F.oxysporum.

Le champignon acétyle spécifiquement FacA, qui est requise pour l'utilisation de l'éthanol et de l'acétate, sur une ou des lysines pour rendre l'enzyme fonctionnelle lors de la fermentation de l'ammoniaque. K Takazaki et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (26MAR04) 12414-12420.

97. Les polycétides (PK) et les peptides non ribosomaux (NRP) sont deux familles de produits synthétisés grâce à des enzymes multimodulaires agencés comme une chaîne de montage. Les monomères sont respectivement des acides organiques ou des acides aminés. La configuration active des produits nécessite une cyclisation, qui instaure des contraintes et qui est assurée par des enzymes dites "de finition". Leurs gènes sont groupés au voisinage de ceux d'élongation de la chaîne.

L'hétérocyclisation des NRP en thiazoles et oxazoles peut avoir lieu dès l'étape de synthèse, tandis que la formation cyclique en tandem des polyéther de furanes et pyranes est initiée par des époxydases après la synthèse. La macrocyclisation des NRP, PK et des hybrides NRP-PK à lieu dans les dernières étapes de l'assemblage. On peut, de la même façon, voir se réaliser des pontages et des structures cycliques supplémentaires par ces oxydations. C'est ce qui se passe pour les antibiotiques naturels mais peut être exploité pour des molécules artificielles.

Une revue sur ce qui est possible dans ce domaine est parue dans CT Walsh; Science 303 (19MAR04) 1805-1810. On y trouvera de nombreuses planches des monuments chimiques élaborés par ces systèmes enzymatiques particuliers.

Le génome du producteur bien connu de l'avermectine, Streptomyces avermitilis indique la présence de 24 PKS additionnelles ou de peptide synthase non ribosomales, en sus de celle que l'on connaît, sans qu'on en connaisse les produits. Ceci souligne le formidable potentiel que cela représente.

On s'est déjà servi de tels modèles pour synthétiser des molécules actives comme les nouveaux analogues de l'antagoniste des récepteurs d'œstrogène R1128.

Le rôle des domaines et des sous-unités permettant l'élongation de la chaîne et sa finition après largage a été plus ou moins inventorié.

On a également reconstitué les chaînes d'assemblage in vitro dans le cas du for déoxyerythronolide B (DEB), la pyochéline (un sidérophore NRP) et la yersiniabactine qui est un chélateur du fer hybride PK-NRP (Ybt). Les gènes de PKS et de PKS-NRPS codant respectivement DEB et Ybt ont été exprimés dans Escherichia coli. La détection des linkers entre sous-unités et le fait qu'ils sont fonctionnels aussi bien entre PKS que NRPS permet d'imaginer beaucoup de choses. Une revue spectaculaire.

98. SK Chaudhuri et al.; Nature Biotechnology 21 (OCT03) 1229–1231 ont monté une cellule biologique produisant de l'électricité (une pile biologique à combustible en quelque sorte) convertissant directement le glucose en électricité sans aucun médiateur pour transférer les électrons à l'anode, utilisant Rhodoferax ferrireducens. L'efficacité est de 83%.

On a décrit d'autres systèmes dès 1962. On en trouvera un autre exemple dans BH Kim et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (FEB04) 672–681 qui utilise un consortium microbien est des eaux usées comme combustible, et un commentaire sur le sujet dans GTR Palmore et al.; Trends in Biotechnology 22 (MAR04) 99-100. Le microorganisme utilise l'anode elle-même pour se débarrasser de ses électrons.

Dans la plupart des cas des cellules microbiennes intactes contenant des protéines redox sont électrochimiquement inactives à cause des problèmes de transfert d'électrons vers l'extérieur.

Une cellule à combustible microbienne est à deux compartiments séparés par une membrane spécifique de cations. Les électrons sont transférés vers l'anode suivent le circuit et reviennent vers la cathode où elle réduisent l'oxydant, consommant les protons disponibles à travers la membrane de l'anode.

Il existe au moins deux types de cellules microbiennes. L'un utilise les sulfures produits par certaines bactéries réduisant le soufre. L'autre impose l'utilisation de médiateurs comme les acides humiques ou leur analogue anthraquinone-2,6-disulfonate, des teintures organiques, des complexes inorganiques ou des organométalliques, mais beaucoup d'entre eux sont instables, toxiques à hautes concentrations.

On s'est beaucoup intéressé aux bactéries réduisant le Fe3+ comme accepteur terminal des électrons. Il pourrait exister un intermédiaire soluble dans la transmission des électrons au fer qui est un accepteur foncièrement insoluble, mais un contact direct est indispensable pour la réduction dissimilatrice du Fe3+. Shewanella putrefaciens et Geobacter sulfurreducens font partie des réducteurs du Fe3+. Elles localisent dans leur membrane externe la majorité des cytochromes et Shewanella est, de ce fait, électrochimiquement active. S.putrefaciens pousse sur lactate en l'absence d'accepteurs d'électrons, mais est inactive si on coupe le circuit entre anode et cathode.

L'intérêt de la technique de SK Chaudhuri et al.; c'est que la pile oxyde complètement le glucose et libère les 24 électrons du glucose, contre 2 pour l'hydrogène des piles conventionnelles ou les 6 du méthanol. Si on raisonne en joules par kg la densité en énergie est plus favorable pour l'hydrogène mais c'est usuellement un gaz, même comprimé à 1000 bars comme dans les cellules conventionnelles. Si on raisonne en joules par litre le glucose est plus intéressant.

Les auteurs indiquent que c'est sous forme de biofilm adhérent que la bactérie est efficace, et peut se passer de médiateur.

99. Le squelette des sphinganes contient une répétition tétrasaccharidique, [1->4)-a-L-rhamnose-(1->3)-b-D-glucose-(1->4)-b-D-glucuronate-(1->4)-b-D-glucose. Chez certains, (I-885 ou S-7), le 2-désoxyglucuronate remplace le glucuronate. Chez d'autres, le L-rhamnose peut être remplacé partiellement (S-88) ou complètement (NW-11) par du L-mannose. Plusieurs de ces polysaccharides contiennent des acides organiques avec une liaison ester, ainsi que des ramifications mono-ou dimériques de D-glucose, L-mannose ou L-rhamnose. Tout ceci confère des propriétés physicochimiques caractéristiques qui ont permis une commercialisation pour quatre d'entre eux, gellane, welane, rhamsane et diutane (par Kelco). Des formes déacylées par traitement alcalin du gellane formes un gel cassant en présence de cations. Elle sont utilisées sous le nom de Gelrite™ pour les milieux de cultures et comme modificateur de texture en alimentaire sous le nom de Kelcogel™.

Sphingomonas elodea ATCC 31461 (alias Pseudomonas elodea ou Sphingomonas paucimobilis) produit du gellane (S-60). C'est un polysaccharide capsulaire utilisé en alimentaire et dans les milieux de culture. L'organisation des gènes de biosynthèse vient d'être établie par les chercheurs de CP Kelco qui les commercialisent. NE Harding et al.; Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 31 (FEB04) 57-62.

 C'est un groupe de 18 gènes étalés sur 21 kb. Ils sont homologues de ceux de la synthèse du sphingane S-88 du Sphingomonas sp. ATCC 31554. Les deux polysaccharides possèdent des répétitions du même motif . Le polysaccharide S-88, cependant, possède un mannose ou un rhamnose en quatrième position et possède une ramification rhamnosyle, tandis que le gellane ne possède pas de ramification saccharidique, mais des substitutions glycéryle et acétyle. Les gènes les moins conservés dans cette batterie de gènes codent des glycosyle transférases III et IV et un gène de fonction inconnue gelF. Trois des gènes (gelI, gelM et gelN) sont ceux qui affectent la quantité de polysaccharide et les qualités rhéologiques du produit.

Dans le cas du sphingane S-88, quatre gènes n'ont pas d'homologues dans ceux de synthèse du gellane.

100. L'utilisation du xylose des xylanes dans les hydrolysats lignocellulosiques est un substrat potentiellement intéressant dans la production de bioéthanol mais, d'une part, les conditions de milieu sont dures, et il faudrait que tous les sucres disponibles puissent être utilisés simultanément, or les phénomènes de répression cataboliques établissent des priorités: Le glucose empêche l'utilisation des autres sucres tant qu'il n'est pas épuisé, cela complique les choses. Cette répression est liée à l'activité du gène creA.

W Prathumpai et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (FEB04) 748-753, ont analysé cette répression dans des souches normales d'Aspergillus nidulans Le xylose agît comme un répresseur catabolique carboné en présence du seul xylose, alors que les enzymes de son utilisation sont réprimées en présence de glucose (la répression catabolique classique). La délétion de creA permet un catabolisme simultané des deux sucres. Le xylose est, simultanément, un répresseur et un inducteur des xylanases.

101. La production mondiale d'éthanol était, en 2001, de 31,4 millions de m3 dont 80% sont produits de façon fermentaire par Saccharomyces cerevisiae. On considère que le substrat correspond à 40% des coûts de production. D'où la recherche des moins coûteux possibles. Mais on a, dans ce cas de nombreux composants secondaires qui affligent la levure. De ce point de vue, toutes les souches de Saccharomyces cerevisiae ne se ressemblent pas, comme, selon l'histoire bien connue, les françaises de Calais pour un visiteur anglais.

Trois souches de laboratoire (CEN.PK, LR88 et RS58) et cinq souches industrielles (IND1101, SuperStart, LO24, LO41 et Azteca) ont été analysées pour leurs réponses à des stress divers. La plupart des souches industrielles supportent mieux les chocs thermiques et oxydatifs que les souches de laboratoire qu'on cajole trop. A l'exception de CEN.PK, on observe des productions d'éthanol similaires pour toutes les souches en présence de fortes concentrations de glucose (180 g/l).

Toutes les souches sont, cependant, gênées par les composés secondaires présents dans les hydrolysats de bagasse comme l'acétate ou le furfural qui résultent de l'hydrolyse des hémicelluloses.

 CEN.PK et SuperStart sont les plus sensibles au furfural sur le plan de la croissance. CEN.PK et LO24 sont les souches les plus résistantes à l'acétate. La production d'éthanol n'est pas sensible au furfural, mais elle décroît en présence d'acétate dans toutes les souches industrielles, sauf LO24 où elle est accrue (comme dans toutes les souches de laboratoire).

102 Le champignon thermophile Sporotrichum thermophile produit des fructooligosaccharides (FOS) sur des milieux très concentrés en saccharose. C'est un moyen pour lui de se débarrasser des fructoses en excès quand il utilise le glucose. Les fructooligosaccharides sont, en effet, constitués d'un à trois fructoses greffés sur un saccharose. Ils sont actuellement utilisés dans les aliments pour animaux et comme prébiotiques car ils stimulent la croissance des Bifidobactéries. Ils peuvent être considérés comme des aliments ne dégageant aucune calorie, car aucune enzyme digestive ne peut les attaquer. Leur production commerciale est enzymatique et réalisée grâce à des transférases d'Aspergillus niger ou d'Aureobasidium pullulans.

Un tout petit nombre de microorganismes les produisent. C'est le cas d'A pullulans, Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium oxysporum, Zymomonas mobilis et le mutant Saccharomyces cerevisiae ATCC 36858. Des cultures submergées en présence de 250 g/l de saccharose donnent 12,5 g FOS/l. C'est un mélange de 1-kestose, 6-kestose et de néokestose. Mais il leur faut résister à cette pression osmotique non négligeable. L'adaptation osmotique de S.thermophile est assurée par les sucres et les acides aminés (glutamate, arginine, alanine, leucine et lysine). P Katapodis et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (JAN04) 378-382.

103. Une revue de chercheurs allemands (dont un de la firme berlinoise Organobalance) analyse les données sur la production de lipides et surtout de stérols ou acides gras polyinsaturés chez Saccharomyces cerevisiae, en utilisant cette levure comme modèle. M Veen et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (FEB04) 635-646. La plupart, mais pas tous les gènes codant les enzymes de la synthèse des acides gras des phospholipides, des stérols et des sphingolipides ont été clonés, et plusieurs caractérisés fonctionnellement. On connaît moins bien les gènes impliqués dans les transports des lipides entre organites et dans les membranes ainsi que le renouvellement des lipides complexes, ainsi que, d'une façon générale, les régulations de tout ceci.

Le but est de détecter les gènes présents et ceux qu'il faudrait y introduire. Le travail est déjà largement avancé dans la mesure ou plusieurs publications et revues ont caractérisés les différents gènes existants (voir, par exemple, la revue de G Daum et al.; Yeast 14 (DEC98) 1471-1510).

 Les points plus particulièrement évoqués sont la production de stérols, la reconstitution des voies de production des hormones stéroïdes et des acides gras polyinsaturés, en vue de produire différents acides gras w-3 et w-6 qui ne sont, normalement, pas produits par la levure.

104. L'avermectine et ses analogues, produite par Streptomyces avermitilis, sont des antiparasitaires (nématodes et arthropodes) commercialisés dans le domaine de la santé animale et humaine ainsi qu'en agriculture. Ce sont des lactones pentacycliques complexes dérivant de polycétides liés à un disaccharide du désoxysaccharide méthylé L-oléandrose. On a pu identifier le gros de la voie de biosynthèse.

 Le génome de S.avermitilis a été récemment séquencé (H Ikeda et al.; Nature Biotechnology 21 (MAY03) 526-531) ce qui devrait aider à caractériser les étapes avec précision, ainsi que les régulations de la production. Une revue de YJ Yoon et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (FEB04) 626–634 fait le point sur nos connaissances dans ce domaine. De nombreux tableaux et de schéma des structures et des voies de synthèse figurent dans cette revue.

On devrait pouvoir faire synthétiser des analogues d'avermectine par le système combinatoire permis par la synthèse non ribosomique.

On a pu, par semisynthèse, obtenir des analogues comme la C22,C23 dihydroavermectine B1. L'ivermectine, est utilisée en agriculture depuis 1985 et on envisage son utilisation contre l'onchocercose et la strongyloïdose humaines.

Les avermectines A possèdent un méthoxy en C5, tandis que la série B possède un groupe hydroxy en même position. Dans les deux séries, certains ont une double liaison en C22=C23 (série 1) tandis que d'autres on un hydroxy sur un C23 saturé (série 2).

La sous-série a utilise un 2-méthylpropanoyle comme point de départ donnant un groupement éthyle en C26, tandis que la sous-série b utilise un 2-méthylbutanoyle donnant un groupe méthyle en C26.

Le groupement acyle de départ de l'avermectine dérive du 2-méthylbutyrate ou isobutyrate ce qui correspond à la différences entre les séries a et b. Ces acides carboxyliques sont issus du catabolisme de la L-isoleucine et de la L-valine via leur céto-acides correspondants.

L'alimentation des souches avec des acides carboxyliques alternatifs permet d'élargir considérablement le spectre des analogues produits. On a pu produire de la doramectine (25-cyclohexyl-5-O-déméthyle-25-dé(1-méthylpropyl)avermectine A1a) en fournissant de l'acide cyclohexanecarboxylique à un mutant de S.avermitilis où la production de la sous-unité de départ est bloquée.

Les aglycones (le squelette non encore orné de glucides) sont élaborés par additions de sept acétates et cinq propionates. Les gènes de polycétide synthase de l'avermectine ont été caractérisés. Ils sont organisés en deux blocs d'ORFs aveA1–aveA2 et aveA3–aveA4, transcrits de façon convergente et codent 12 jeux de domaines enzymatiques permettant chacun un cycle d'élongation. On compte 55 sites actifs ayant une activité de synthases d'acides gras, donnant une enzyme géante multifonctionnelle.

L'étape suivante est la modification du polycétide. Deux ORFs, aveC et aveE, localisés entre les deux groupes de gènes de polycétide synthase interviennent dans ces modifications mais on a du mal à établir leur rôle et leurs régulations.

Trois autres ORFs en amont de aveA1 ont également un rôle, deux d'entre elles codent des enzymes modifiant l'aglycone initial. AveF ressemble à une déshydrogénase d'acides gras à courtes chaînes.

Neuf ORFs sont impliquées dans la production du L-oléandrose. Chez S.avermitilis, la méthylation du déméthyloléandrose (L-olivose) a lieu avant son greffage sur l'aglycone. Chez S.antibioticus, le L-olivose est transféré sur l'aglycone puis converti en L-oléandrose par une méthyltransférase. Le gène aveBI code une glycosyltransférase qui assure l'incorporation, par étape, de l'oléandrose sur l'aglycone.

105. Des chercheurs chinois décrivent la production de copolymères de poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)) avec une proportion modifiable de 3-hydroxyhexanoate chez un Aeromonas hydrophila d'origine lacustre. XY Lu et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 64 (MAR04) 41-45.

106. On utilise le 3-hydroxypropionaldéhyde (3-HPA) associé à un dimère de HPA ainsi qu'à de l'hydrate de HPA en conserve alimentaire, ainsi que comme précurseur de l'acroléine, d'acide acrylique ou 1,3-propanediol (1,3-PDO), ainsi que pour la production de polymères.

Jusqu'à présent la production de 1,3-PDO de 3-HPA est d'origine pétrolière. Je rappelle que DuPont et Genencor et d'autres misent sur la bioproduction (voir le Bulletin de Décembre 2003 §107, celui de Novembre 2003 §65 ou de Juin 2003 §102). On peut, en effet, l'obtenir à partir du glycérol en une seule étape enzymatique. Lactobacillus reuteri, utilisé comme probiotique animal et humain sait produire le 3-HPA. L'utilisation alimentaire serait facilitée si on pouvait en obtenir d'origine biologique de façon sûre et à coût raisonnable. Il faut en produire assez et pouvoir le récupérer à un coût économique. S Vollenweider et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 64 (MAR04) 16-27 analysent les possibilités de production par cette bactérie.

On trouvera, dans l'introduction de l'article, une intéressante rétrospective historique de la découverte du glycérol, au XVIII°siècle, des découvertes sur le sujet de Chevreul aux débuts du XIX° siècle, et des applications à la production de bougies plus efficaces, celle de l'acroléine qui résulte de la combustion et qui est responsable de l'odeur désagréable de cette combustion, puis de Berzelius et du laboratoire de Liebig, avec Redtenbacher qui identifia la production biologique d'acide propionique à partir du glycérol, et enfin avec Pasteur qui détecta la production de glycérol au cours de la fermentation alcoolique,mais surtout la cause bactérienne des maladies de l'amertume des vins". Voisenet découvrit en 1910 le rôle de l'acroléine dans cette amertume.

Les Protéines et les Enzymes

107. D Georlette et al.; FEMS Microbiology Reviews 28 (FEB04) 25-42, traitent de la biocatalyse à basse température. Ces chercheurs liégeois se préoccupent depuis longtemps des organismes psychrophiles. Ces derniers se débrouillent pour avoir des flux métaboliques pas très différents des organismes mésophiles à des températures nettement plus basses.

Cette compensation thermique est due à une haute efficacité catalytique des enzymes dans la plupart des cas, mais souvent associée à une grande thermolabilité. Ces enzymes présentent une très grande flexibilité des éléments de la séquence participant à la catalyse, alors que d'autres régions de l'enzyme sont, parfois et au contraire, plus rigide que chez leurs contreparties mésophiles (probablement pour assurer un minimum de stabilité à l'ensemble).

On avait déjà remarqué en 1887 que les microorganismes issus de poissons pouvaient pousser à 0°. Mais les basses températures peuvent faciliter la dénaturation des protéines (ce que l'on ignore à l'ère des réfrigérateurs). Cette dénaturation est liée à l'affaiblissement des liaisons hydrophobes, à une hydration des groupes polaires et apolaires favorisée à basse température. C'est une propriété très générale des protéines, surtout des protéines multimériques (comme les ATPases, les synthases d'acides gras) et les protéines très hydrophobes. Curieusement les enzymes psychrophiles sont encore plus sensibles à cette dénaturation au froid que les enzymes mésophiles (dès 10°). On détecte, cependant des activités enzymatiques à –20° dans les fissures de saumure des glaces marines.

Lutter contre cette dénaturation peut être menée dans la cellule par divers procédés que l'on imagine, mais il ne peut en être de même pour les enzymes extra-cellulaires. On n'a détecté, dans ce cas, aucune substance pouvant être impliquée dans cette tolérance.

Il y a quelque chose contre laquelle la vie ne peut rien, c'est la loi d'Arrhenius avec la constante d'Arrhenius k = Ae-Ea/RT où T est la température absolue. Une décroissance de la température de 10° diminue par 2 ou 3 la cadence de la réaction, la valeur exacte dépendant de l'énergie d'activation. Ainsi une enzyme mésophile voit son activité diminuée de 16 à 80 fois en passant de 37° (mésophile) à 0°.

La revue examine les différents mécanismes d'adaptation des psychrophiles, avec la fluidité membranaire, les protéines dites "cold shock" Csp, les cryoprotecteurs et antigels, la régulation de la perméabilité membranaire aux ions, la polymérisation des microtubules, les dormances saisonnières et, surtout, la modification des cinétiques enzymatiques.

Le cycle catalytique comporte trois phases principales la reconnaissance et la fixation du substrat, puis un changement de conformation entraîné par sa fixation permettant la catalyse, puis la libération du produit. Chacune de ces phases dépend de la température, car assurée par des interactions faibles.

L'efficacité catalytique kcat/Km est ce qui importe. Les liaisons faibles sont, soit accrues à température modérément élevée comme les liaisons hydrophobes, soit diminuées, comme les liaisons hydrogène, électrostatiques ou de van der Waals.

Le fonctionnement au froid peut être assuré en augmentant les concentrations d'enzyme pour compenser leur vitesse plus faible. Mais cela a un coût énergétique tel qu'il y a peu de cas où cette technique a été utilisée par la nature. Il existe plutôt une utilisation d'isoenzymes adaptées aux différentes conditions que peut rencontrer l'organisme. Le coût est alors génétique, car il faut multiplier les gènes. On trouve cette situation chez les poissons et les nématodes.

Une stratégie plus élaborée est celle où le fonctionnement des enzymes est indépendant de la température. La vitesse est alors uniquement régulée par la diffusion. Mais elle est rarement observée. C'est le cas pour l'anhydrase carbonique des globules rouges (une enzyme extravagante sur bien des points), les catalases de plusieurs espèces ou la triosephosphate isomérase de Vibrio marinus.

En principe les enzymes psychrophiles peuvent jouer sur l'efficacité catalytique kcat/Km, en accroissant kcat (rotation catalytique), en abaissant Km (en gros, en diminuant l'affinité), ou en modifiant les deux. En réalité, on a deux tendances parmi les enzymes qui ont pu être étudiées, avec un accroissement de kcat et Km ou avec un accroissement de kcat et une décroissance de Km. On retrouve ces deux types chez toutes les enzymes, qu'elles présentent ou non des mutations adaptatives au niveau du site catalytique.

Les psychrophiles augmentent le potentiel catalytique de leurs enzymes avec une activité spécifique dix fois plus forte à basse température. Elles présentent, par ailleurs, une température optimale décalée vers les basses températures. Enfin l'adaptation n'est jamais complète kcat n'égale jamais, chez les psychrophiles, celui des mésophiles à 37°, laissant probablement une marge aux fluctuation de la température du milieu.

108. Les molécules de caroténoïdes asymétriques (monocycliques) sont difficiles à synthétiser chimiquement. On trouvera dans L Tao et al.; Molecular Genetics & Genomics 271 (MAR04) 180-188, un article de chercheurs de Du Pont sur les lycopènes b cyclases asymétriques.

Il faudrait pouvoir disposer d'enzymes capables de ne cycliser qu'une seule des extrémités des caroténoïdes linéaires comme le lycopène ou le neurosporène. Les gènes crtLm codant une telle lycopène b-cyclase ont été isolés de deux bactéries non photosynthétiques produisant des caroténoïdes monocycliques, Rhodococcus erythropolis AN12 et Deinococcus radiodurans R1. La co-expression de ces gènes crtLm avec les gènes permettant la synthèse du lycopène crtEIB de Pantoea stewartii permet effectivement d'obtenir du g-carotène (un carotène monocyclique) chez Escherichia coli.

La plupart des lycopène b-cyclases sont bicycliques. Il existe deux catégories de lycopène cyclases (b-cyclases et e-cyclases). Les lycopène b-cyclases, observées chez les plantes et les microorganismes permettent la formation d'un cycle b-ionone. Les lycopène e-cyclases des plantes permettent la formation d'un cycle e-ionone. La plupart des lycopène e-cyclases sont des monocyclases permettant la formation d'un carotène asymétrique monocyclique, le d-carotène (y,e-carotène). Il existe cependant au moins une lycopène e-cyclase permettant la synthèse d'un carotène bicyclique, l'e-carotène (e,e-carotène), chez la laitue.

On subdivise les lycopène b-cyclases en quatre groupes: les CrtY-type monomériques communes chez les bactéries, les CrtL-type ou Lcy-b type monomérique des plantes, les CrtYc- et CrtYd-type hétérodimériques et les CrtYB-type bifonctionnelles fongiques. Une analyse phylogénique indique que les enzymes bactériennes CrtL-type sont un lien évolutif entre les lycopène b-cyclases CrtY-type bactériennes et les lycopène b- et e-cyclases des plantes.

Une nouvelle lycopène b-monocyclase (CrtYm) avait été isolée d'une bactérie marine donnant du g-carotène monocyclique, mais ces organismes sont rares. C'est le cas de certains Rhodococcus, de bactéries photosynthétiques comme Chlorobium et certains champignons, comme Rhizophlyctis. On ne connaissait cependant pas les enzymes responsables de la monocyclisation.

109. Les organismes dégradant les parois végétales ont besoin d'une large batterie d'enzymes pour hydrolyser en molécules solubles les nombreuses et diverses macromolécules de ces parois. Beaucoup de ces enzymes ne sont pas produites en permanence (ce serait du gâchis) et sont induites par des facteurs du substrat lui-même indiquant son contenu. Mais les macromolécules de nature différentes sont souvent pontées entre elles pour assurer la cohésion de la paroi.

Les champignons produisent souvent des enzymes à multiples domaines avec des modules reconnaissant spécifiquement des carbohydrates. Enfin la production d'enzymes extra-cellulaires permet d'atteindre des parties distantes du substrat.

 Le maillage de la paroi peut être assuré par des groupes phénoliques comme les acides férulique (un acide hydroxycinnamique) et p-coumarique. Le p-coumarate s'observe surtout dans la paille des graminées, tandis que le férulate présente des liaisons ester avec l'arabinose des xylanes, pectines et xyloglucanes chez les céréales, le galactose des pectines chez la betterave, l'épinard et constitue le domaine polyaromatique de la subérine du liège. L'intervention de l'acide férulique dans les pontages est assurée grâce à une oxydation par des peroxydases.

On a pu caractériser les enzymes responsables du clivage de la liaison ester entre polysaccharides des xylanes et pectines d'une part et les férulates mono- ou dimériques de l'autre. On l'a fait chez des champignons des bactéries des plantes ou des cellules mammaliennes. Ces feruloyle estérases sont réparties en deux classes, les Type-A et Type-B. Les Type-A agissent sur les dimères d'acide férulique et contre les méthyl-sinapates, mais pas contre les méthyl-caféates. Les Type-B ont le profil inverse. Seul Aspergillus niger produit, jusqu'à nouvel ordre, les deux types. On s'intéresse à ces enzymes dans l'industrie alimentaire comme le montre un examen des brevets sur le sujet (voir par exemple l'US Patent 6 602 700 (05AUG03) de l'University of Georgia Research Foundation ou 6 368 833 (09APR02) de Genencor International. Cependant la spécificité de substrat des enzymes AnFaeA et AnFaeB d'A.niger laisse à désirer.

Talaromyces emersonii semble produire plusieurs enzymes de ces types. C'est pourquoi on a cherché d'autres enzymes chez un autre Talaromyces, T.stipitatus MT Garcia-Conesa et al.; Journal of Biotechnology 108 (18MAR04) 227-241.

110. La 1,4-b-D-glucane glucohydrolase A de Thermotoga neapolitana hydrolyse préférentiellement les cello-oligomères, comme le cellotétraose, grignotant les glucoses à partir de l'extrémité réductrice de la molécule. JK McCarthy et al.; The Journal of Biological Chemistry 279 (19MAR04) 11495-11502, ont obtenu, par PCR laxiste et criblage des mutants à 85°, une variante améliorée (Vmax augmentée sans altération du kcat) de cette enzyme hydrolysant le disaccharide cellobiose. La structure de l'enzyme est modifiée avec repositionnement de l'acide aminé catalytique Asn163 et reconfiguration du canal vers le site catalytique.

111. Le prétraitement des copeaux de bois par les champignons des pourritures blanches abaisse la consommation d'énergie dans la production de pâte à papier par voie mécanique ou chimique. La croissance fongique entraîne une modification de la structure chimique qui facilite la séparation des fibres dans les procédés mécaniques de pulpage. Des chercheurs finlandais décrivent l'utilisation de polypores ou cortinaires dans ce but. TK Hakala et al.; Enzyme & Microbial Technology 34 (01MAR04) 255-263.

Leur point de repère, pour l'efficacité, est Ceriporiopsis subvermispora (voir le §112) un champignon bien connu dans ces procédés et Phlebia gigantea,. Les auteurs ont utilisé le bois de l'épicéa Picea abies qui est très utilisé dans les pays nordiques. Physisporinus rivulosus T241i (alias Ceriporiopsis rivulosa, Poria albipellucida, Poria rivulosa) est une souche supérieure dans ce domaine du fait de sa large gamme de température d'activité et sa sélectivité pour la lignine (plutôt que pour la cellulose, ce qui serait contre-productif).

112. Ceriporiopsis subvermispora est souvent utilisé en bio-pulpage du bois. Les enzymes produites durant le déroulement de ce procédé, et non pas dans des expériences de laboratoire, ont été caractérisées par PB de Souza-Cruz et al.; Enzyme & Microbial Technology 34 (01MAR04) 228-234.

Les peroxydases manganèse-dépendantes (MnP) prédominent par rapport aux laccases. On trouve beaucoup de xylanases, avec peu de b-xylosidases, mais peu de cellulases (ce qui est recherché) et pas du tout de cellobiohydrolase.

113. Un certain nombre d'animaux synthétisent de la cellulose, ne serait ce que les délicieux urochordés et lointains parents que sont les "bijus" (ascidies) languedociens.

Le gène de la sous-unité catalytique du complexe multienzymatique d'une cellulose synthase de Ciona intestinalis vient d'être caractérisé. K Nakashima et al.; Development, genes & evolution 214 (FEB04) 81-88.

Ci-CesA (pour Ciona intestinalis) est une protéine de fusion atypique entre un domaine cellulose synthase et une cellulase. Elle combine, en effet; une synthase et une hydrolase du produit. Aucun de ces domaines n'a d'homologue dans les banques de données génétiques animales. Cette fusion semble être le résultat d'un transfert horizontal d'un gène bactérien il y a 530 millions d'années.

L'Agroalimentaire

114. On trouvera dans M Carbonaro; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 209-216, une revue sur l'utilisation de la protéomique dans l'évaluation de la qualité des aliments.

115. Oenococcus oeni, est utilisé pour la fermentation malolactique qui suit la fermentation alcoolique en vinification, et sert à abaisser l'acidité du vin en convertissant l'acide L-malique en L-lactique. Mais cette bactérie présente plusieurs autres activités intéressantes, mais qui ont l'inconvénient majeur de ne pas être suffisamment connues

Les souches d'Oenococcus oeni peuvent présenter une grande variabilité de leurs activités b-glucosidasiques. Ces enzymes libèrent des aglycone aromatiques du glucose auquel ils sont liés. Des chercheurs italiens les ont analysées dans le vignoble de Valpolicella. Dans deux d'entre elles la b-glucosidase est activée par l'éthanol. Ces activités sont maintenues en conditions œnologiques et les souches présentent de bonnes performances pour la fermentation malolactique pour laquelle elles sont utilisées. Aucune ne présentent d'activité anthocyanase, ce qui serait fâcheux. RN Barbagallo et al.; Enzyme & Microbial Technology 34 (01MAR04) 292-296.

Des Saccharomyces, possède de telles activités mais les enzymes sont rarement libérées dans le milieu, ce que font plusieurs champignons filamenteux. Mais ces enzymes fongiques sont instables en conditions œnologiques. L'utilisation d'enzymes glycosidasiques (en particulier de b-D-glucopyranosidases) pour modifier l'arôme du vin a été essayée. Mais elles n'ont guère d'avenir commercial, selon un des producteurs d'enzymes avec qui j'ai pu discuter,car elles ne sont utiles que pour des vins médiocres, ce qui n'est, heureusement, pas un marché considérable. Ce pourquoi certaines firmes ont abandonné leur production.

116. Les Clps (Caseinolytic protein) constituent une grande famille de protéines ayant des activités à la fois de chaperone et de protéases, et très conservées entre pro- et eucaryotes. Ce sont souvent des ATPases et elles doivent réguler la survie de protéines régulatrices. Chez Escherichia coli, le complexe Clp ressemble, en effet, au protéasome 26S des eucaryotes, avec des sous-unités protéolytiques appelées ClpP associées avec des sous-unités subunits of de l'une ou l'autre des Hsp-100/Clp ATPases, ClpA ou ClpX. En l'absence d'ATPases associées, ClpP dégrade des peptides de moins de sept acides aminés. En présence de ClpA ou ClpX, ClpP agit spécifiquement sur des substrats déterminés par la sous-unité ATPase.

La protéine est organisée en deux cercles heptamériques avec 14 sites protéasiques dépendant de l'ATP. Cette fonction protéasique est probablement nécessaire à l'élimination des protéines dénaturée par les stress".

Des chercheurs de l'INRA à Dijon ont étudié la réponse du locus clpP-clpL de résistance aux stress d'Oenococcus oeni. Suivant les circonstances, ces deux gènes peuvent être transcrits indépendamment ou co-transcrits.

Le promoteur clpP dépend du régulateur CtsR, alors que ce n'est pas le cas pour clpL. La quantité de transcrits de clpL codant une ATPase dépend de la stabilité du messager, ce qui fait qu'elle est régulée, au moins en partie, au stade post-transcriptionnel.

117.. Les hongrois ont longtemps été à la pointe de la recherche sur les cyclodextrines et s'ils ont maintenant perdu du terrain sur le plan commercial, ils n'en continuent pas moins de travailler le sujet. Une revue de la firme CYCLOLAB sur l'utilisation de ces oligosaccharides cycliques comme ingrédients alimentaire est parue avec L Szente et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 137-142.

Les cyclodextrines sont des molécules constituées de cycles de 6, 7 ou 8 molécules de glucose que l'on appelle respectivement des a, ß et g cyclodextrines. Ces molécules sont connues depuis longtemps (leur nature cyclique a été démontrée en 1903), mais ce n'est que récemment que leur utilisation a été envisagée.

Le volume de la cavité est de 262Å3 pour la b-cyclodextrine la plus commune, car la plus facile à obtenir et la moins chère (5-6 US$/kg actuellement). Le volume de cavité des a-cyclodextrine est de 174Å3 seulement (trop petit pour extraire, par exemple, la caféine d'un café) et 427Å3 pour les g-cyclodextrines.

Les cyclodextrines ont un intérêt industriel car elles peuvent être des vecteurs d'arômes ou de petites molécules bioactives qu'elles rendent plus solubles et plus facilement libérables grâce à la cavité hydrophobe présente au centre de la molécule où les molécules transportées sont insérées. Cette cavité est tapissée par les OH du glucopyranose, les CH2OH étant disposés à l'extérieur. On sait que l'encapsulation dans ces "boîtes" moléculaires permet d'améliorer la stabilité des flaveurs, des vitamines, de colorants ou des lipides insaturés. Des exemples de ces utilisations sont analysés.

La revue insiste sur les aspects pratiques de l'utilisation des cyclodextrines dans l'industrie alimentaire. Les b-cyclodextrines sont acceptées (statut GRAS) depuis 1998 dans ce domaine . Elles peuvent facilement remplacer les techniques plus anciennes d'adsorption, sur amidon ou sel, des d'extraits végétaux séchés ou les oléorésines à base d'huiles essentielles concentrées ou la microencapsulation dans la gomme arabique, les éthers de cellulose ou les amidons modifiés.

La protection conférée contre les oxydations, les réactions photoinduites, la dénaturation thermique ou la perte, par sublimation, des substances volatiles peut être intéressante. Inversement on peut se servir de la b-cyclodextrine pour éliminer des mauvais goût ou odeurs, des substances considérées comme nocives comme le cholestérol, et ainsi améliorer le produit ou prolonger la durée de vie de certains produits. Elles peuvent également stabiliser les émulsions d'eau dans les huiles, empêcher le brunissement au cours de la cuisson de certains aliments et améliorer la gélatinisation. Une utilisation plus récente est l'encapsulement d'agents antimicrobiens et leur insertion dans des films protecteurs. L'efficacité de la technique a été démontrée dans le cas d'emballages de fromages ou de produits de la mer congelés

118. La flaveur des aliments est difficile à stabiliser. Des chercheurs de Wageningen essaye de développer de nouveaux aliments protéiques à base de pois, en essayant d'éliminer le goût pas très fameux de ces protéines et en leur "collant" des flaveurs volatiles agréables, en jouant sur les interactions protéines-flaveurs. L Heng et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 217-224.

La présence de saponines (non volatiles, elles) confèrent une amertume a été explorée. Elles contribuent à l'amertume des protéines du pois. Légumines (11S) et viciline (7S), qui représentent 80% des protéines dela graine, ont été utilisées. Leurs interactions avec aldéhydes et cétones ont été analysées à divers pH et températures.

Les vicilines se lient aux aldéhydes et cétones à pH 7.6, et ceci d'autant mieux que leur chaîne est plus longue. Les légumines ne lient que des aldéhydes à ce pH. La chaleur diminue les affinités.

119. Les agrumes ont la particularité d'avoir des parties consommables réduites par rapport aux enveloppes. Les produits résiduels (écorces pépins, etc…) de leur exploitation, notamment la production de jus de fruits, constituent une montagne de produits végétaux encombrants, mais aussi éventuellement utilisables. On peut les incorporer dans les aliments pour animaux (j'ai vu, dans le Negev, de magnifiques Salers nourries à partir de ces reliquats). Une autre utilisation actuelle est celle d'engrais organiques, mais on peut quand même faire mieux. C'est le cas des poudres de fibres issues de l'écorce, des essences, le D-limonène et plus généralement des produits bioactifs comme l'acide ascorbique ou les flavonoïdes. La teneur en ces substances dépend de la technique d'extraction. Les polyphénols sont surtout présents dans les écorces de citrons. Les flavonoïdes sont surtout de l'hespéridine, narirutine, naringine et eriocitrine. Dans les écorces de citron se sont surtout de l'hespéridine et de l'ériocitrine, alors que naringine et eriocitrine sont présentes dans les résidus liquides.

Le problème des sous-produits de l'industrie des agrumes est leur forte teneur en eau (80%) ce qui les rend difficilement utilisables sur le plan industriel. Il a donc fallu inventer des procédés de déshydratation. Les poudres ainsi obtenues ont une teneur en eau de 7% et la manière de les fabriquer tient compte de la nécessité de préserver les composants bioactifs.

La revue de J Fernandez-Lopez et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 176-185, traite de l'utilisation de ces produits dans les produits carnés, essentiellement les saucisses en leur conférant une texture durable.

Les Pré-, Probiotiques et Autres

120. Les caroténoïdes sont des pigments terpenoïdes très répandus. De plus on les couvre de superlatifs sur le plan de la santé animale.

Un certain nombre de microorganismes accumulent, sous stress, plusieurs types d'entre eux. Chez les microalgues, ils constituent une photoprotection. On a, très tôt, produit ces pigments biologiquement, mais on n'arrive pas à entrer en compétition, sur le plan économique, avec la synthèse chimique.

Mais on a eu récemment plusieurs essais plus ou moins réussis de productions biologiques, dont le succès relatifs est lié à l'aversion irraisonnée des consommateurs pour les synthèses chimiques.

Il faudrait quand même améliorer l'efficacité des synthèses biologiques. On a réussi à transplanter les chaînes de synthèse dans des organismes qui ne produisent pas ces pigments, comme Candida utilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae et Zymomonas mobilis. On se heurte le plus souvent à une insuffisance de production des précurseurs, ainsi qu'à des capacités de stockage limitées.

On dispose de quelques pistes pour améliorer la production. Ces stimulateurs ont été étudiés notamment chez Blakeslea trispora et Phycomyces blakesleeanus cultivés en conditions normales. Une revue sur cette stimulation par des conditions environnementales ou de culture est parue avec P Bhosale; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (JAN04) 344-350. On observe, en effet, une stimulation par une illumination ou des fluctuations de la température l'addition d'ions métalliques, des sels ou des solvants organiques qui , tous, doivent, engendrer des réponses aux stress.

121. L'utilisation de xylooligosaccharides (XO) comme ingrédients dans des nourritures dites "fonctionnelles" est abordée dans une revue de JC Parajo et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 115-120. Leur utilité affichée est de créer du bien-être pour les bifidobactéries, une production accrue d'acides gras volatiles. Les auteurs analysent la production de ces sucres par autolyse à partir de bois d'Eucalyptus globulus, d'épis de maïs, les enveloppes du riz ou de l'orge. La plus haute production (de l'ordre de 25%) s'observe dans les enveloppes de l'orge et dans les épis de maïs. les auteurs s'intéressent, notamment aux xylooligosaccharides substitués dérivant de xylanes eux-mêmes substitués par des arabinose, acétyles et acides uroniques. Ces substitutions dépendent, naturellement, de la matière première de départ.

122.. Le champignon thermophile Sporotrichum thermophile produit des fructo-oligosaccharides (FOS) sur des milieux très concentrés en saccharose. C'est un moyen pour lui de se débarrasser des fructoses en excès quand il utilise le glucose. Les fructo-oligosaccharides sont, en effet, constitués de un à trois fructoses greffés sur un saccharose. Ils sont actuellement utilisés dans les aliments pour animaux et comme prébiotiques car ils stimulent la croissance des Bifidobactéries. Ils peuvent être considérés comme des aliments ne dégageant aucune calorie, car aucune enzyme digestive ne peut les attaquer. Leur production commerciale est enzymatique et réalisée grâce à des transférases d'Aspergillus niger ou d'Aureobasidium pullulans.

Un tout petit nombre de microorganismes les produisent. C'est le cas d'A pullulans, Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium oxysporum, Zymomonas mobilis et le mutant Saccharomyces cerevisiae ATCC 36858. Des cultures submergées en présence de 250 g/l de saccharose donnent 12,5 g FOS/l. C'est un mélange de 1-kestose, 6-kestose et de néokestose. Mais il leur faut résister à cette pression osmotique non négligeable. L'adaptation osmotique de S.thermophile est assurée par les sucres et les acides aminés (glutamate, arginine, alanine, leucine et lysine). P Katapodis et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (JAN04) 378-382.

123. L'activité prébiotique des fructo-oligosaccharides (FOS) et de l'inuline est plus ou moins bien étayée scientifiquement. Je rappelle que les prébiotiques sont, au sens strict, des substrats non digestibles par l'homme qui facilitent le développement des probiotiques, comme les bifidobactéries, c'est-à-dire des microorganismes supposés bénéfiques. Ce sont, en quelque sorte des "engrais" pour probiotiques. L'article de E Biedrzycka et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 170-175 confirme l'effet positif de ces polymères à base de fructose dans des expériences sur rats Wistar classiques dans ces études. Les auteurs ont examiné l'influence du degré de polymérisation sur les effets prébiotiques.

Il reste cependant, à confirmer ceci dans le tube digestif humain, avant de préconiser officiellement cette utilisation. Il faut, en effet utiliser une panoplie de bifidobactéries plus représentative de la flore humaine. Celles ci représentent 90% de l a flore intestinale totale chez les enfants nourris au sein, puis tombe plus tard à 5-10% voir moins chez les vieillards.

Les fructo-oligosaccharides (FOS) sont des b-D-fructanes contenant entre 2 et 4 b(2-1) fructosyles avec un a-D-glucose terminal (1-kestose (GF2), 1-nystose (GF3) et 1F-fructosylnystose (GF4). De petites quantités de glucose et de fructose restent après la polymérisation. L'inuline est un fructane hautement polymérisé (10 à 60 fructosyles sont enchaînés) dans les racines de chicorée, tandis que les oligofructoses ont des degrés de polymérisation de l'ordre de 2 à 9, obtenus par hydrolyse partielle par des endoglucosidases. De ce fait, seules certaines molécules du mélange ont un glucose terminal.

Les FOS sont utilisés par les Bifidobacterium spp. (sauf B.bifidum), Bacteroides fragilis, Peptostreptococcus spp. et Klebsiella pneumoniae, tandis que des bactéries "douteuses" comme Escherichia coli, et Clostridium perfringens, ainsi que les lactobacilles, Eubacterium spp. et Fusobacterium spp. en sont incapables. Quelques espèces comme Clostridium butyricum et Cl.ramosum utilisent bien les FOS, alors que des Bacteroides et quelques souches de Lactobacillus, Peptostreptococcus, Klebsiella et Enterococcus utilisent de façon limitée les FOS. L'utilisation des FOS par les Bifidobacterium résulte du fait qu'elles possèdent des inulinases attaquant les FOS à partir de l'extrémité non réductrice. On peut réduire aux bifidobactéries en utilisant des FOs à faible degré de polymérisation.

124.La production de butyrate par les bactéries anaérobies peut emprunter deux voies à partir du butyryl-CoA, celle de la butyrate kinase et de la phosphotransbutyrylase ou celle du butyryl-coenzyme A (CoA):acétate CoA-transférase. P Luis et al.; Journal of Bacteriology 186, n°7 (APR04) 2099-2106, ont étudié cette synthèse dans les bactéries du colon humain.

Jusqu'à présent, ces bactéries anaérobies strictes comme les clostridiales, étaient très difficiles à cultiver et donc à étudier. On peut, maintenant; examiner directement leur génome. Ces bactéries fermentatives produisent butyrate; lactate et formate, tandis que l'acétate est, soit produit, soit consommé. On considère que le butyrate exerce un effet favorable sur le colon., en étant le principal substrat énergétique de l'épithélium intestinal de cette zone du tube digestif. On y ajoute, en prime, des effets anti-inflammatoire et anticancéreux.

La formation du butyrate n'a été étudiée que chez la clostridie solvantogénique Clostridium acetobutylicum. Deux acétyl-coenzyme A (acétyl-CoA) sont condensés, puis réduits en butyryl-CoA selon un processus inverse de la -oxydation des acides gras.

On savait déjà que, chez la bactérie ruminale Butyrivibrio fibrisolvens, on a soit une activité butyrate kinase, soit une activité butyryl-CoA:acétate CoA-transférase, mais jamais les deux.

Dans les souches humaines des genres Roseburia et Faecalibacterium on ne trouve que l'activité butyryl-CoA:acétate CoA-transférase, tandis que chez la souche L2-50, vague cousine des Coprococcus sp. ou d'Eubacterium ruminantium, on trouve les deux types d'activité.

Les auteurs montrent que sur toutes les 38 souches bactériennes anaérobies du colon qu'ils ont pu étudier seule quatre présentent une activité butyrate kinase. Une activité butyryl-CoA:acétate CoA-transférase est, par contre, détectée chez toues les 38 souches.

125. Des chercheurs de Nestlé montrent que le facteur d'élongation EF-Tu associé à la surface cellulaire de Lactobacillus johnsonii NCC533 (La1) facilite l'adhésion aux mucines et aux entérocytes humains. Les auteurs ont bien vérifié que ce n'est pas un artefact de préparation. D Granato et al.; Infection and Immunity 72 (APR04) 2160-2169. Il fonctionnerait comme un facteur d'adhésion pH dépendant.

De plus la protéine EF-Tu est pro-inflammatoire en présence de CD14 soluble., et pourrait jouer un rôle dans l'homéostasie intestinale.

126. Des chercheurs associés à Yakult montrent que des bifidobactéries probiotiques (une souche du groupe B.breve de Yakult résistant naturellement à la streptomycine) protègent les souris contre la shigatoxine de la souche Escherichia coli O157:H7. Mais, oh horreur, il faut fournir en permanence de la streptomycine aux souris pour obtenir cet effet. T Asahara et al.; Infection and Immunity 72 (APR04) 2240-2247.

La sécurité alimentaire

127. La lutte contre Listeria monocytogenes repose sur une activation rapide des récepteurs de l'immunité innée TLRs (Toll-Like Receptors). On l'a montré avec des souris ne possédant pas l'adaptateur commun MyD88 (Myeloid Differentiation factor 88), qui succombent à une infection par Listeria. Il semble que TLR2 soit impliqué dans cette défense, associé à d'autres facteurs. D Torres et al.; Infection and Immunity 72 (APR04) 2131-2139.

128. Vibrio harveyi, la bactérie marine bioluminescente bien connue, est ubiquitaire en milieu marin et constitue la principale espèce de la flore normale des crevettes en bonne santé que nous consommons.

On sait, cependant, qu'il existe des souches pathogènes létales pour les crevettes, qui affectent la "crevetticulture" sur le plan mondial. Les souches Z2 et Z3 y causent 100% de mortalité notamment chez Litopenaeus vannamei (la crevette blanche du Pacifique). Il faudrait disposer de"tests" spécifiques, aisés et fiables distinguant les souches pathogènes et non pathogènes. Des chercheurs mexicains (la maladie y cause des ravages) décrivent une technique faisant appel à des oligonucléotides correspondant aux gènes txR, vhh-1, vhhB, luxL, luxM, luxN et une technique PCR, ainsi qu'une technique RAPD permettant de différencier les diverses souches. G Hernandez et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (FEB04) 722–727.

129. Une adaptation aux pHs acides accroît l'infectivité de Vibrio cholerae, au moins chez le souriceau. Ce n'est pas le passage de la barrière gastrique qui est en cause, mais une plus grande rapidité de multiplication dans l'intestin. MJ Angelichio et al.; Infection and Immunity 72 (APR04) 1405-2407.

130. Les fruits et légumes frais prêts à utiliser prennent une place grandissante sur les rayons des supermarchés. Ces produits ne sont pas traités pour assurer leur conservation, sauf par des atmosphères contrôlées. Mais Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Shigella spp., Aeromonas hydrophila, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, et certaines souches d'Escherichia coli peuvent être présentes sur les fruits frais. Il est, de toute façon, difficile de les éradiquer sans cuisson. On peut détecter 103–106 cfu/g (colonies par gramme) sur des légumes juste après l'emballage. Des fruits peu acides comme le melon et certains fruits tropicaux sont particulièrement sensibles aux contaminations par Salmonella spp. ou E.coli. Voir le Bulletin de Novembre 2003 §73. Par ailleurs, les blessures inévitables entraînent une rencontre entre enzymes et substrats, jusque là séparés, et donc des altérations du contenu du fruit. La durée de vie à l'étalage (qui était l'objet du Bulletin de Novembre) peut être allongée par la réfrigération, mais celle-ci est surtout destinée à couvrir les trajets entre lieu de production et de vente. La durée de vie des fruits frais en tranches ne peut dépasser 5–7 jours et 15–20 jours pour les légumes.

Des produits végétaux peuvent constituer une alternative dans ce domaine finalement très peu avancé. Une revue de chercheurs de Bologna (R Lanciotti et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 201-208) traitent de ces possibilités. On peut, de plus, utiliser ces produits pour renforcer les flaveurs des produits. En effet certains composants volatiles des plantes sont précisément utilisés par ces plantes pour se défendre contre les agressions microbiennes. Certains de ces composants sont issus de la voie des lipoxygénases à partir d'une oxydation d'acides gras insaturés donnant des hydroperoxydes.

Aldéhydes et les alcools correspondants sont produits par des hydroperoxyde lyases, isomérases et déshydrogénases. Bien des arômes naturels responsables de la note "verte" de ces produits comme hexanal, hexanol, 2-(E)-hexenal et 3-(Z)-hexenol, sont des produits en C6 issus de cette voie. Ce sont des composants aromatiques de la tomate, des fraises, du raisin, des pommes et des poires, de l'huile d'olive et du thé.

Certaines huiles essentielles, constituées surtout de terpenoïdes, sont des antimicrobiens. On connaît les huiles de Labiées (romarin, thym etc…) et des agrumes dont l'utilisation a été explorée. Mais il reste beaucoup de confirmations à obtenir avant un usage généralisé.

La revue insiste surtout sur les effets de l'hexanal, du 2-(E)-hexenal, de l'hexyle acétate et des huiles essentielles des agrumes.

131. Consommée en masse par l'homme et les animaux, la pomme de terre contient des glycoalcaloïdes (GAs)s stéroïdaux toxiques qui causent des empoisonnements mortels sporadiques. Ils sont tératogènes, cancérigènes, génotoxiques, embryotoxiques et neurotoxiques par leur action sur la cholinestérase et la butyrylcholinestérase (ce qui induit une résistance à l'anesthésie). Parmentier n'aurait, actuellement, aucune chance d'imposer ce bienfait de l'humanité, le principe de précaution n'ayant, alors, pas été invoqué).

Parmi les nombreux GAs des Solanum, certains ont une action pharmacologique intéressante. C'est le cas de la chaconine et de la solamargine sur certains virus herpétiques. Mais a-solanine et a-chaconine, qui sont des dérivés triglycosylés (galactose pour la solanine et glucose pour la chaconine) de la solanidine, sont extrêmement toxiques pour les animaux et l'homme, l'aglycone étant moins toxique que le dérivé glycosylé. Les tolérances actuelles sont de 200 mg/kg. Mais ce seuil n'est valable que pour des effets toxiques aigues ou sub-aigus, et aucune donnée ne concerne les effets d'une intoxication à long terme, or la pomme de terre est consommée à longueur d'année. Une revue de YL Korpan et al.; Trends in Biotechnology 22 (MAR04) 147-151, est consacrée à ces toxines, à leur détection et à leur élimination par les outils modernes et contestés des biotechnologies. Pour l'instant on se limite, dans l'amélioration génétique de la pomme de terre, à certains génomes de Solanum acceptables pour éviter les risques.

La première chose à faire est de monter des capteurs indiquant leur présence au dessus du seuil de toxicité. Les auteurs se limitent aux capteurs qu'ils on mis au point. Pour l'instant c'est un verdissement à la lumière de la peau du tubercule qui est le capteur le plus simple. Mais ces capteurs pourraient être utilisés dans la sélection. Il ne faut, cependant, pas oublier que ces métabolites secondaires font partie des mécanismes de défense de la plante, et que les supprimer crée d'autres risques. C'est donc un problème d'équilibre à trouver entre absence de toxine et utilisation de pesticides (ou une transgenèse de toxines insecticides).

Les croisements entre Solanum tuberosum et S.commersonii permettent, chez certains de ces hybrides interspécifiques, de réduire un peu la teneur en GAs sans toucher aux qualités de la pomme de terre. Des hybrides somatiques, notamment avec S.brevidens, ont également été utilisés dans le même but.

La transformation génétique est relativement simple. On peut penser qu'elle peut entraîner une expression intempestive de la biosynthèse des GAs. Ceci n'a encore jamais été observé mais reste possible.

Le gène de la solanidine-UDP-glucose glucosyltransférase a été cloné, breveté et utilisé pour réduire la teneur en GA par une approche antisens (US Patent 5 959 180 (28SEP99) de l'USDA.

Des pommes de terre (cv. Désirée) surexprimant une stérol méthyltransférase de soja (GmSMT) ont été utilisées pour analyser les synthèses de stérols en liaison avec la production des GAs. Elles montrent qu'on peut déprimer la production de GAs dans les feuilles et les tubercules en diminuant la synthèse des stérols non alkylés libres (type cholestérol).

132. Certaines personnes sont allergiques au gluten avec, entre autres manifestations, la maladie coeliaque (dont on ne sait trop bien si elle est en augmentation ou si on la détecte plus facilement dans les populations humaines). Cette maladie serait liée à une intolérance aux gliadines du blé, prolamines du seigle (sécalines) et probablement de l'avoine (avidines). Les mécanismes sont encore peu clairs, mais le résultat est une altération de la muqueuse intestinale et, donc, une mauvaise absorption de nombreux élément essentiels de notre alimentation.

Le remplacement du gluten n'est pas une mince affaire sur le plan technologique, car il joue une grand rôle dans la structure des produits du blé, ne serait-ce que du pain. La suppression du gluten entraîne de mauvaises qualités organoleptiques de très nombreux mets (il ne faut pas oublier que le gluten est utilisé dans des nombreux ingrédients de notre alimentation autres que les produits directs du blé). Une revue sur cette maladie et sur les techniques de substitution du gluten est parue avec E Gallaghera et al.; Trends in Food Science & Technology 15 (MAR-APR04) 143-152.

Le remplacement du gluten par des amidons modifiés ou non, des hydrocolloïdes, diverses gommes, etc… du fait de leur activité structurante et leur hydrophilie, est un pis-aller utilisé pour l'instant. On envisage l'utilisation de fibres alimentaires comme l'inuline, le quinoa et l'amarante ainsi que celle protéines alternatives comme le caséinate de sodium du lait et certaines autres fractions du lait. Mais la situation n'est pas fameuse.

L'Environnement

133. Bien que la bactérie soit considérée comme sans danger et largement utilisée pour des productions microbiennes, des souches fongicides de Bacillus amyloliquefaciens isolées de bâtiments rongés par l'humidité produisent de la surfactine et une substance, non protéique thermostable et soluble dans le méthanol, toxique pour l'homme. R Mikkola et al.; Archives of Microbiology 181 (APR04) 314-323.

Des Bacillus subtilis et B.licheniformis ont été sporadiquement associés à des empoisonnements mortels. B. amyloliquefaciens peut produire des lipopeptides cycliques bioactifs et la toxine protéique barnase). Il faut se rappeler l'incident survenu au début des années 90 avec un lot de L-tryptophane produit par une souche recombinante de B. amyloliquefaciens IAM 1521. On ne connaît toujours pas avec certitude la raison de cette toxicité malgré de nombreuses publications dont ce Bulletin a fait état à l'époque.

134. Les composés fortement chlorés comme le perchloréthylène (PCE) ou le trichloréthylène (TCE) sont difficiles à biodégrader en aérobiose, même si on a pu décrire des cas, notamment pour une anaérobie facultative comme Enterobacter agglomerans qui peut transformer du PCE en cis-1,2-dichloroéthylène (DCE, ce qui n'est pas parfait quand même). En effet, les déchlorations sont souvent imparfaites et des produits intermédiaires, encore chlorés, sont libérés. Ainsi le PCE peut être converti en chlorure de vinyle qui est encore plus toxique que le PCE. Il existe, heureusement, des déhalogénations complètes procédant par élimination successive de tous les atomes d'halogènes.

La biodéhalogénation réductive (remplacement de l'halogène par un hydrogène, élimination du chlore sous forme de HCl, dichloroélimination sous forme de Cl2) anaérobie des éthylènes chlorés est possible quand la concentration en hydrogène (l'hydrogène sert de donneur d'électrons) est suffisamment basse pour que les méthanogènes ne puissent pas en tirer pleinement parti. Ce ne sont d'ailleurs pas les seuls compétiteurs, car les réductrices du Fe3+, du Mn2+, des nitrates ou du soufre, sont également sur les rangs. Mais usuellement et dans les sites à déhalogéner ces bactéries ne sont, en général, pas gênantes. Le seuil de concentration d'hydrogène utilisable par les bactéries déhalogénantes est de 2.2 nM alors que pour les méthanogènes il est 10.9 nM. C'est entre 2 nM et 11 nM que se situe la zone où les déhalogénantes sont les plus heureuses. Dans ces conditions les bactéries déhalogénantes peuvent entrer raisonnablement en compétition avec les consortia méthanogènes. Mais cet équilibre est fragile, et on a souvent des surprises avec production de méthane plutôt que déhalogénation. Ce n'est donc pas une recette infaillible de déhalogénation. G Chen; Applied Microbiology & Biotechnology 63 (JAN04) 373–377.

Les consortia méthanogènes ne peuvent utiliser qu'un spectre étroit de substrats, essentiellement réduction du CO2 et clivage de l'acétate. Dans un milieu assez bien chargé en substances organiques, le méthane provient aux deux tiers de la déméthylation de l'acétate et un tiers de la réduction du CO2.

Durant la fermentation des substrats organiques, beaucoup d'acétate est formé et cela favorise la méthanogenèse, mais comme la réaction n'est pas très favorable sur le plan énergétique, ce n'est qu'à partir d'un certain seuil que la méthanisation est possible. Mais, du coup, on peut observer une certaine méthanisation, même quand la concentration d'hydrogène est faible(d'où les surprises).

De plus les pools d'hydrogènes dépendent du substrat organique environnant, la pression partielle d'hydrogène doit être inférieure à 10-4,7 atm pour le propionate, 10-4.6 atm pour le butyrate et 10-3,8 atm pour l'éthanol.

135. L'élimination des effluents de teinture a toujours été un problème ardu du fait de la diversité structurale de ces molécules (azo, triphényl méthane et phthalocyanines par exemple). Les systèmes de traitement des eaux usées ou la microflore naturelle sont incapables de le faire efficacement..

La dégradation anaérobie bactérienne peut donner, de plus, des composés cancérigènes. Les bactéries doivent importer ces molécules pour les dégrader, alors que les champignons utilisent, le plus souvent, des enzymes extracellulaires. On pense, dans le cas des pourritures blanches (voir le §111), que ce sont les enzymes ligninolytiques qui sont utilisées. Des auteurs du Punjab décrivent leurs travaux sur Dichomitus squalens, Irpex flavus (un polypore), Phlebia spp., Polyporus sanguineus qui seraient plus efficaces que Phanerochaete chrysosporium. M Chander et al.; Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 31 (FEB04) 94-97.

On produit à peu près 1 million de tonnes de teintures diverses par an dans le monde, dont environ 70% sont des azos (comportant un R1– N=N–R2). Malgré des substitutions destinées à améliorer le pourcentage de teinture fixée sur les fibres (mordançage), on en perd 10 à 50% dans les effluents et cela est d'un mauvais effet sur le paysage. On recherche donc à les éliminer. Comme les effluents de teinture sont à haute température (40 à 70°), une élimination biologique devrait être assurée par des organismes thermophiles. Une anaérobiose maintient un potentiel redox bas (<50 mV) suffisant pour réduire les teintures. Mais le mécanisme exact est encore l'objet de controverses (il est vraisemblablement extracellulaire ou, au mieux, pariétal), comme l'est le rôle de médiateurs solubles comme les flavines, car celles-ci ne peuvent franchir les membranes et sont donc intracellulaires. On a cependant caractérisé, l'an passé une naphtoquinone réductase qui permet, chez Escherichia coli, une réduction de teintures. Les quinones qui sont la partie réductible des acides humiques peuvent, à la fois être un accepteur final d'électrons (donnant des hydroquinones) ou des intermédiaires transférant les électrons à un accepteur final comme les teintures azo.

La réduction de teintures Azo à 55°C par un consortium thermophile de boues activées (un consortium de microorganismes bâti pendant l'épuration d'eaux usées) a été analysée par des chercheurs de Wageningen. AB dos Santos et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 64 (MAR04) 62-69. C'est un processus qui se déroule suivant un schéma où on oxyde un substrat et on réduit la teinture avec les électrons ainsi libérés.On utilise souvent un médiateur redox comme l'anthraquinone-2,6-disulfonate (AQDS, un analogue des acides humiques voir le §98) comme intermédiaire dans les transferts d'électrons. L'effet de ce médiateur a été analysé. C'est bien un phénomène biologique et la nature thermophiles des organismes est marquée par le fait que la vitesse de décoloration est six fois plus forte à 55° qu'à 30°.

Mais si on met trop de médiateur on inhibe l'oxydation thermophile des acides organiques produits par le consortium des boues activées comme l'acétate et le propionate, ainsi que la méthanogenèse.

La sécurité génétique

136. Dès qu'un organisme a un avantage sélectif on doit se poser la question de savoir s'il n'y a pas un risque de le voir balayer les homologues normaux. C'est vrai pour les OGMs comme pour toute introduction. Le cas des poissons transgéniques pose le problème de l'avantage sélectif des mâles transgéniques sur les autres.

Un article intéressant analyse le comportement des mâles de medaka (Oryzias latipes) exprimant le gène de l'hormone de croissance du saumon exprimée sous la commande d'un promoteur d'un gène de métallothionéine. RD Howard et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (02MAR04) 2934-2938. C'est un cas intéressant, car si les mâles ont un avantage reproducteur très important, les descendants sont plutôt débiles. Le modèle utilisé par les auteurs montre que les poissons transgéniques ont une capacité à envahir les populations sauvages (à cause de leur "virilité"), mais peuvent entraîner une extinction de la population, OGMs comme normale (à cause de la débilité des descendants notamment une mortalité juvénile importante). C'est ce que les auteurs appelle un effet "troyen" par allusion au cheval de Troie.

Des essais d'accouplements montrent que les mâles sauvages cherchent des tactiques alternatives de séduction, et les auteurs ont utilisé des marqueurs génétiques pour vérifier le succès de ces stratégies alternatives. Elles peuvent ralentir la diffusion du transgène, mais ne la bloquent pas.

137. Les poissons cichlides (perciformes) comptent 2000 à 2500 espèces (et sont donc les Vertébrés au plus grand nombre d'espèces. Il en existe au moins !500 espèces dans les grands lacs africains (Malawi, Victoria et Tanganyika) où ils représentent un magnifique exemple de spéciation explosive, de radiation adaptative et de plasticité génétique au sein d'une seule famille de Vertébrés. La principale différence entre ces trois ensembles réside dans leur âge et leur complexité en termes de nombres d'espèces et leur degré de divergence éco-morphologique. (Voir les Bulletins de Mai 2003 §157 et Décembre 2003 §68) Les cichlides du lac Tanganyika sont probablement à l'origine des populations des deux autres lacs..

L'intérêt que je porte à ces poissons est lié aux espoirs que l'on peut avoir dans la souplesse des populations animales sur le plan génétique et la reconstitution d'une nouvelle diversité après un goulet d'étranglement génétique. On n'obtiendra pas un retour au paradis passé, mais une nouvelle diversité, ce qui a été vrai durant toute l'évolution. Toutes les espèces ne se prêtent pas à cette régénération de populations, mais celles qui le font méritent un détour.

Le lac Tanganyika est de loin le plus ancien de ces lacs installés dans le rift est-africain (9 à 12 millions d'années). C'est aussi le plus riche en espèces et en adaptations morphologiques et écologiques différentes. Ce lac a une riche histoire géologique avec des périodes d'assèchement partiel, notamment il y a seulement 1,1 million d'années (probablement la circulation automobile) et son niveau s'est abaissé d'au moins 600m. Son niveau s'est ensuite relevé jusqu'à il y a 550 000 ans et fluctue rapidement depuis.

Si les lacs Malawi et Victoria sont monophylétiques (colonisés une seule fois après leur formation) le lac Tanganyika est polyphylétique avec six lignées qui ont évolué au fur et à mesure des modifications du lac.

Ce succès évolutif des Cichlides est expliqué par deux caractéristiques. Le premier réside dans l'anatomie du pharynx qui constitue une deuxième mâchoire indépendante de la dentition. De petites modifications de cette structure permettent d'utiliser rapidement de nouvelles ressources alimentaires, et donc de coloniser de nouvelles niches. La seconde est celle du comportement reproducteur (accouplement comme incubation des œufs, très spécialisé.

Les Cichlides des lacs Victoria et Malawi sont exclusivement à incubation buccale alors qu'un tiers de ceux du lac Tanganyika présentent une incubation externe. Et les autres ont une incubation buccale à multiples facettes.

Les trois populations ont subi une spéciation particulière à chaque lac. Ceux du lac Tanganyika sont issus de six lignées qui ont évolué au fur et à mesure des modifications du lac. L'une des lignées s'est diversifiée en au moins six sous-lignées en un très courte période de temps. Les Ectodinés en font partie. Ce sont des colonisateurs spécialisés des fonds sableux et secondairement rocheux. On vient de montrer que cette lignée s'est très rapidement diversifiée en quatre clades. Le genre Grammatotria est probablement le plus ancien. L'apparition de trois clades additionnels est quasiment contemporaine. L'habitat benthique est originel. Les poissons colonisaient alors le sable. L'acquisition d'un habitat rocheux a été réalisée indépendamment par les Xenotilapia et les Ophthalmotilapia.

Les Xenotilapia présentent deux modes d'incubation buccale des œufs: soit maternel, soit biparental. Mais ce comportement semble très plastique.

Le mode biparental est apparu une seule fois dans le clade, et a réversé au moins trois fois ou bien il est apparu indépendamment au moins cinq fois à partir d'un ancêtre à incubation buccale. S Koblmüller et al.; Journal of Molecular Evolution 58 (JAN04) 79-96.

138. Les trois grands lacs est-africains ne sont pas les seuls sites locaux de diversification des Cichlides. Les petits lacs ainsi que les rivières qui les alimentent ont également été des sites de diversification. Mais les populations sont moins différenciées morphologiquement et leur collecte est plus difficile. La tribu des haplochromines vient d'être étudiée au niveau des SINES (Short INterspersed Elements) aussi bien chez ses espèces des eaux courantes et lacustres. Y Terai et al.; Journal of Molecular Evolution 58 (JAN04) 64–78. On retrouve la chronologie évoquée plus haut, le lac Tanganyika étant le plus anciennement peuplé, suivi par le lac Malawi avec ses affluents, les populations les plus récentes étant celle du lac Edward et des formes fluviales et, surtout, celles du lac Victoria.

Je rappelle que les SINES sont des rétroposons mobiles grâce à la réverse-transcriptase des SINES. Les séquences transposées sont, chez les poissons et beaucoup d'eucaryotes, issues de tARN. Ces SINEs sont particulièrement importants quand les espèces divergent beaucoup plus vite que le temps exigé pour la stabilisation d'un SINE. Il se trouve que les Cichlides africains, et pas ceux du Nouveau Monde ou d'ailleurs) possèdent une famille distincte de SINEs , AFC (pour African Cichlids) caractérisés par le même groupe en 1998.

Des bibliothèques d'ADN génomique de deux endémiques d'Haplochromines du lac Victoria ont été utilisées pour isoler les SINEs de ces poissons et d'en déduire les relations phylogéniques entre les diverses espèces est-africaines. La classification de ces poissons grâce à la variabilité des SINES divise ces poissons chronologiquement et par ordre de divergence en quatre groupes. Les plus anciens sont les endémiques du lac Tanganyika; puis viennent les Astatoreochromis, au contraire largement distribués, les endémiques du lac Malawi et, enfin des poissons dispersés dans toute l'Afrique de l'Est (lacs Victoria, Edward, George, Albert, et Rukwa, ainsi que de nombreuses rivières affluentes. Le quatrième groupe est caractérisé par un sous groupe polymorphique de SINEs, chacun étant présent dans certains individus et pas dans d'autres au même endroit géographique, ayant la même morphologie et le même ADN mitochondrial. Ce groupe comporte six des sept types mitochondriaux (haplogroupes). L'un des SINEs paraît déjà fixé chez les populations du lac Victoria. Il n'en est pas de même pour les cinq autres qui peuvent ou non présenter un polymorphisme. On peut donc reconstruite l'histoire des populations de ce lac.

Les Sociétés

 

139. RF Service; Science 303 (19MAR04) 1796-1799 discute des problèmes souvent invoqués ces temps-ci de l'obsolescence de la propriété industrielle sur des molécules actives hyperprofitables (blockbusters c'est à dire des médicaments dépassant un milliard de dollars de ventes annuelles). Voir également le Bulletin de Janvier §129.

Dans les cinq années à venir la valeur des médicaments tombant dans le domaine public sera de 30 milliards de dollars. L'apparition résultante des génériques va sérieusement entamer ce gâteau. Par ailleurs, plusieurs miracles attendus des pipe lines se révèle des mirages et sont abandonnés lors des essais terminaux, les plus coûteux. Ce n'est qu'un cinquième des médicaments potentiels atteignant de stade des essais chez l'homme qui seront commercialisés.

Les dépenses de R&D ont beau s'amplifier (budgets multipliés par trois depuis 1990, et par trente depuis 1977), le retour sur investissement peut être très maigre, et on trouve le milieu baigné dans une atmosphère de productivité de la recherche à tout prix. On essaye de compenser ces échecs en achetant un concurrent supposé mieux loti, ce qui explique, en partie les mouvements de concentrations actuels (avec parfois des déboires), et la seule année 1996 a vu plus cent fusions dans ce secteur. Une alternative est d'utiliser les compétences des petites firmes de biotechnologie (si elle échoue cela n'entachera pas la firme principale). Une firme comme Merck a 40 accords de licences avec de telles firmes.

Par ailleurs, les assurances (et les patients) renâclent devant l'accroissement de prix des nouveaux médicaments sans accroissement proportionnel des gains thérapeutiques (les coûts ont augmenté aux Etats-Unis de plus de 15% pour les assurances maladies en 2000, dont un tiers dû aux prix et le reste à une augmentation de la consommation). C'est en effet, un palliatif à court terme des firmes pour redorer leur bilan. En 1990 à peine 15% des médicaments entraient dans la catégorie des blockbusters), actuellement c'est 50%. Ceci traduit les efforts des compagnies pour se concentrer sur ces best-sellers (au détriment d'autres voies). Il faut réaliser que les ventes annuelles d'un géant comme Pfizer c'est un revenu d'environ 45 milliards de dollars, alors travailler sur un médicament qui ne rapportera que quelques misérables centaines de millions de dollars, ne redressera pas la barre financière, quand un autre médicament (aux ventes du milliard de dollars) devient un générique. Ceci a une conséquence immédiate : si un des tares médicaments ayant ce potentiel échoue pendant les essais terminaux avant la commercialisation, cela devient un désastre financier, psychologique et donc boursier. Pfizer a donc avalé Pharmacia, qui avait elle-même avalé la pharmacie de Monsanto (Searle). Mais ces absorptions sèment le chaos dans les firmes, contrairement à ce qui est affirmé aux actionnaires, plus particulièrement au niveau de la recherche. Or s'il n'y a pas si longtemps un médicament avait environ 5 ans devant lui pour se tailler un marché, les compétiteurs sur ce marché (supposé juteux) ne restent pas inactifs et sortent de nouvelles molécules et l'avance du premier entrant se réduit à un ou deux ans, tout au plus. La recherche est donc critique, mais le coût d'un nouveau médicament (en tenant compte des échecs inévitables) est maintenant de 897 millions de dollars. Ceci explique en grande partie l'abandon des recherches dans des domaines peu rémunérateurs comme les antibiotiques (que j'ai plusieurs fois évoqués), ou les problèmes gastro-intestinaux, pour se concentrer sur des maladies chroniques qui garantissent des clients perpétuels (on pourrait finalement dire que moins cela guérit vite, mieux cela vaut). Mais comme de tels médications de longues durées accumulent les risques (chroniquement aussi) cela ajoute des essais sur plus de patients et sur plus de temps, d'où des coûts croissants avec des surprises après des délais plus longs.

La R&D a également connu des déboires intrinsèques. Les techniques de criblage à haut débit promis, ne sont pas révélées plus juteuses que les essais systématiques antérieurs. Il fut un temps ou u criblage de cent fois plus de molécules au hasard était un objectif dont on espérait plus de succès. Les techniques à haut débit n'ont fait qu'encourager une telle approche. Le nombre de composés à essayer, même rationnellement, est illimité. La chimie combinatoire a essayé de le faire. Les résultats issus les premières études de génomique ont été volumineux, mais pas très impressionnants, pas plus. Maintenant, on essaye de mieux cibler sur des familles dont on pense qu'elles sont plus efficaces et mieux tolérées et des cibles moléculaires, dont on pense qu'elles sont cruciales. En réalité, ce qui se passe, c'est que la simple détection d'une molécule active devient de plus en complexe, car la science a permis d'ajouter une foule de paramètres. Ainsi, il n'y a pas très longtemps, on essayait des molécules potentiellement actives sur une cinquantaine de cibles moléculaires différentes. Maintenant c'est beaucoup plus et la validation des résultats prend beaucoup plus de temps que prévu.

La recherche de blockbusters a des conséquences dans ce domaine, car la technique, encore actuelle, d'étaler ses paris sur un spectre relativement large en y mettant le moins de billes possibles, jusqu'à ce que l'un des paris se révèle gagnant, ne tient plus. En effet, c'est tout simplement trop coûteux pour la grande majorité des compagnies.

De nouvelles idées comme la pharmacogénomique adaptant la médication à un profil physiologique ou génétique ont du mal à faire surface. Cette fois parce que les financiers ont du mal à comprendre qu'on restreigne une médication à un marché correspondant à un lot étroit de patients.

Les échecs actuels ont amené les compagnies à repenser, puis à restructurer, leur recherche. GlaxoSmithKline a abandonné sa gestion centralisée de la R&D et l'a éclatée en six opérations décentralisées se chargeant chacune d'un secteur avec une assez large autonomie de gestion scientifique.

D'autres, comme Novartis, AstraZeneca, Pfizer et Abbott cherche tirer le plus grand parti de localisations prestigieuses comme San Diego ou Boston.

140. On a admiré la facilité avec laquelle les universités américaines ont engendré des start-ups de biotechnologies (ou d'une façon plus générale de haute technologie, les fameuses spin-offs), jusqu'à ce que la bulle boursière éclate. On vient de constater un phénomène inverse de "spin-in" où une firme se replie sur l'université de départ. C'est le cas de RheoGene originaire de l'University of Pittsburgh Medical Center (UPMC) qui réintègre l'alma mater où elle va fournir des cadres pour la recherche universitaire.

L'UPMC a déjà participé à l'achat d'une division de PPL Therapeutics avec l'idée d'acquérir des outils de recherche et, ensuite et éventuellement, en tirer des profits.

On peut considérer cette situation comme une autre facette de l'intégration de la recherche publique dans les industries innovantes. Le transfert de brevets est une des étapes. RheoGene avait mis au point des techniques de régulations précises de multiples gènes. La société avait été acquise par Rohm & Haas, qui avait décidé de s'en séparer sans trouver d'acquéreurs. Or le McGowan Institute for Regenerative Medicine utilisaient plusieurs de ces techniques dans des procédés de thérapie cellulaire ou ingéniérie des tissus. Le directeur de l'institut a réussi à convaincre Rohm & Haas de lui offrir la totalité de la firme (y compris les brevets dont la firme n'avait manifestement pas l'usage, car elle affirmait que ceci n'entrait plus dans son core business comme on dit). L'état de Pennsylvanie a fourni 1,5 million de dollars pour faciliter la prise de contrôle. Rohm & Haas y trouve un intérêt car elle peut imputer 30 millions de dollars de pertes à sa balance fiscale.

Boston University avait, dans le même esprit, acheté Seragen en 1987, qui a coûté à l'université plus de $45 millions de dollars, et entraîné un désengagement désastreux en 1998. Y Bhattacharjee; Science 303 (05MAR04) 1449.

141. Les compagnies de biotechnologie doivent assurer la difficile transition entre une R&D dans ses phases initiales et la stade où elles ont, enfin, un pipeline à peu près rempli de nouveaux produits mais où elles doivent assurer un développement coûteux avec des moyens financiers le plus souvent inadéquat. Elles ne peuvent, en effet, pas encore s'appuyer sur des revenus opérationnels. Elles doivent utiliser des sources extérieures additionnelles.

Le développement de la Ceredase ® (glucocérébrosidase) de Genzyme, par exemple, n'a été possible que de cette façon, car la compagnie venait juste d'entrer en bourse, ce qui faisait qu'y revenir aussitôt après étaient impossible, et l'enzyme n'était encore qu'un médicament orphelin (sans marché suffisamment important pour attirer les grandes compagnies pharmaceutiques).

Une des innovations financières dans ce domaine, et qui a accompagné le développement d'Amgen, Genentech et Genzyme dont le succès est bien connu, est ce que l'on appelle dans le jargon financier la special purpose entity (SPE dont je n'ai trouvé nulle part une traduction), mais qui consiste à individualiser un projet de recherche dans une filiale indépendante qui peut attirer un financement privé ciblé sans engager le financier dans les autres activités. Cette solution a été utilisé dans les années 80s, puis est tombé en désuétude ensuite, de sorte que la communauté actuelle des start-ups est peu familière avec ce que cela signifiait. Un très bon article de deux chercheurs du MIT Sloan School of Management sur le sujet est paru dans L Schiff et al.; Nature Biotechnology 22 (MAR04) 271-277.

En 1982, Genentech, devant le manque d'enthousiasme des grandes firmes pharmaceutiques pour des alliances, a mis au point la technique avec PaineWebber (maintenant USB Financial Services). Elle a créé une R&D limited partnership, appelée Genentech Clinical Partners, pour financer le développement de l'hormone de croissance humaine recombinante. La société imitait, en cela, les pratiques de l'immobilier qui mise sur un ensemble immobilier et de l'industrie pétrolière qui mise sur un gisement. Dans la réalité la mise au point financière est compliquée car la structure doit être légalement indépendante.

Elle peut prendre deux formes alternatives: la R&D limited partnerships (LPs, sociétés en commandite), cas de Genentech, ou d'une special purpose corporation (SPCs). Les SPCs sont plus connues sous les noms, finalement plus explicites de SPARCs (Special Purpose Accelerated Research Corporations) et de SWORDs (Stock and Warrant Off-Balance-sheet R&D corporations, le nom dépendant des banques d'investissement). La gestion des deux types de sociétés est un peu différente. Elle dépend évidemment des législations et l'article traite de l'américaine.

R&D LPs et SPCs (les SPEs pour Special Purpose Entities) transfèrent les droits de projets de R&D à un groupe d'investisseurs extérieurs. Ceux-ci achètent des parts souvent garanties par la société de biotechnologie (donnant le droit aux investisseurs à acheter, à l'avenir, des actions de la firme dans des délais donnés). La SPE va alors utiliser ces fonds sur un projet précis. Après un certain délai, la firme de biotechnologie pourra racheter le projet à la SPE.

La gestion d'une SPE dépend de la nature R&D LP ou SPC de l'objet. Dans une R&D LP, ce sont les dirigeants de la firme de biotechnologie qui gèrent les affaires alors que dans une SPC c'est un board indépendant, avec une minorité de directeurs de la firme de biotechnologie

Les SPEs offrent des incitations substantielles aux deux type de partenaires (firme et investisseurs). Pour les investisseurs l'avantage est un retour sur investissement plus fort que les actions. Il existe quelques différences entre R&D LPs et SPCs.

Dans les R&D LPs, l'investisseur type était un riche individu, souvent enthousiaste des biotechnologies. Jusqu'en 1985, il existait un avantage fiscal avec le transfert possible des pertes dans le bilan fiscal, qui a disparu avec le Tax Reform Act de 1986. On a alors joué sur d'autres composants du contrat (royalties et garanties basées sur actions de la compagnie de biotechnologie pour assurer l'attractivité de l'investissement). Pour les SPCs, les investisseurs étaient surtout des "institutionnels". Ils étaient surtout attirés par le haut retour sur investissement des parts de la SPC, et surtout par la plus grande liquidité de l'investissement du fait que les SPCs étaient cotés en bourse et les parts pouvaient être échangés librement. Par ailleurs, il existait une convention tacite selon laquelle la compagnie de biotechnologie rachèterait les parts, indépendamment du succès.

Les compagnies trouvaient un avantage en diversifiant les risques liés à la R&D en gardant l'option de racheter les produits à une date ultérieure, quand on y verra plus clair. `

De plus, et pour les compagnies qui approchaient l'équilibre, la possibilité de balancer les profits et pertes, permettait de compenser, par un revenu contractuel dépassant les dépenses de R&D sur le projet couvert. De plus, lors du rachat les droits du projet maintenant nettement plus avancé ou achevé, on voyait apparaître dans les livres de compte des gains que les analystes boursiers ne pouvaient prévoir, et qui étaient du plus bel effet. Enfin la compagnie ne cédait alors qu'une part nettement plus faible des revenus du produit final que si elle avait assuré le développement dans le cadre d'une alliance avec une tierce partie. Elle pouvait, alors consacrer une part plus grande de leur revenu aux développements amont de nouveaux produits.

Les auteurs ont analysé 21 firmes ayant pratiqué les SPEs. Ils constatent que 19 ont dépassé le seuil du milliard de dollars en capitalisation (en gros la somme du prix des actions). Ce sont elles qui ont eu l'impact le plus grand sur le secteur durant les 20 dernières années et ont été les drapeaux des biotechnologies. Il reste à établir si les SPEs ont réellement contribué au succès des compagnies qui les ont utilisées. En effet, c'étaient déjà des compagnies considérées comme les phares de biotechnologies, et leur capacité à lever des fonds dans les SPEs en était accrue.

Ces compagnies ont ainsi pu lever plus de $1,4 milliards, et, en moyenne, c'était 1,5 fois plus que lors de leur introduction en bourse.

Des 36 SPEs analysées dans l'article, 14 ont abouti à des produits commercialisés. Trois de ces SPEs (Genentech Clinical Partners, Genzyme Development Partners et Neozyme) ont abouti à plus d'un produit commercial. Au total 15 médicaments et 4 outils de diagnostic ont ainsi atteint le marché. Inversement, 8 des 36 SPEs ont vu tous leurs projets avorter, et on peut se poser des questions sur les 14 autres encore en développement.

Parmi les produits les plus connus de ces SPEs ont peut citer Neupogen (le granulocyte colony stimulating factor), d'Amgen qui a rapporté plus de $10 milliards, les produits des SPEs de Genentech (qui lui ont rapporté $6,6 milliards avec notamment l'hormone de croissance humaine ou Protropin/Neutropin), ceux de Genzyme avec $3,4 milliards (avec la Ceredase) et Enbrel, qui a rapporté $1,8 milliard à Immunex avant son acquisition par Amgen.

Il est difficile de dégager les raisons de la désaffection pour ces techniques financières. Il est probable que le succès des compagnies utilisatrices, leur permet maintenant de trouver plus facilement des fonds. Il y a également des raisons autres. Dès 1989, plusieurs investisseurs ont renégocié les termes des options de rachat, soit du fait d'un succès relatif de l'investissement (voir plus loin) ou de celui de l'incapacité de la compagnie de biotechnologie a exercé son option de rachat quel que soit le succès. En effet, une opération de ce genre de Centocor a conduit les partenaires devant les tribunaux en 1993 (puis s'est réglée dans les coulisses) alertant la communauté financière sur le caractère quand même risqué de ces opérations. Par chance, les autres sources de financements étaient, alors, très variées et efficaces (c'était en 1995) car c'étaient des sources moins onéreuses. En particulier les firmes pharmaceutiques ont, alors, compris que c'était leur intérêt de nouer des liens plus étroit avec les start-ups. Puis la situation s'est nettement gâchée sur tous les plans.

Les auteurs se demandent si ces SPEs sont des reliques intéressantes de l'histoire des biotechnologies, où si elles peuvent réémerger, peut être sous d'autres formes.

142. Le Gene information service d'Incyte ferme ses portes. En 2001, Incyte Genomics avait déposé plus de 7000 brevets sur des séquences supposées complètes de gènes, mais se trompait assez lourdement sur le nombre des gènes humains (si je me souviens bien la société indiquait la présence de 150 000 gènes). Mais les séquences elles-mêmes étaient de moins en moins rentables dès 2000, du fait de leur divulgation croissante dans le domaine public. La création de valeur ajoutée passait alors par des données complémentaires. La mise en place, en 2002, de souscriptions pour accéder aux données de la "Proteome BioKnowledge Library" d'Incyte Genomics a alors fortement irrité les scientifiques. Ces données étaient gratuites, jusqu'alors, pour des chercheurs publics (un abonnement de 2 000 dollars par laboratoire avait été mis en place) car elles provenaient de la société Proteome qui avaient mis en place cette politique et avait été rachetée par Incyte Genomics en fin 2000. Après des querelles assez dures sur la propriété industrielle des réseaux de détection ADN avec Affymetrix, la société avaient abandonné, en 2001, leur production pour se centrer sur les données utilisées dans ces réseaux, et arrêtait également les services d'analyse de profils d'expression, alors qu'elle était engagée avec de nombreux laboratoires. La situation financière était suffisamment difficile pour que la capitalisation boursière soit, en 2003, inférieure à celle de ses actifs, comme c'était le cas de le cas de Human Genome Sciences où Celera Genomics. Les revenus, à leur apogée en 2001, étaient de $219 millions. Ils n'étaient plus que de $47 millions en 2003. Le passage au statut de firme pharmaceutique avait alors été envisagé par plusieurs sociétés de génomique, mais c'est une autre paire de manches du fait du coût de la R&D (voir le §139). En 2001, Celera Genomics avait acquis le chimiste Axys Pharmaceuticals, et fin 2002 transmettait ses données de génomique à Applied Biosystems. Incyte a beaucoup tardé à le faire, avec l'acquisition du chimiste Maxia Pharmaceuticals en fin 2002 et tente de regagner le terrain perdu grâce aux $294 millions en caisse. LF; Nature Biotechnology 22 (MAR04) 260.

143. Human Genome Sciences (HGS), si célèbre pour ses réussites en génomique est également en involution. Elle va licencier 200 de ses 1 000 employés et W Haseltine, qui a créé la compagnie en 1992, en abandonne la direction. M Wadman; Nature 428 (01APR04) 456.

Il quitte la compagnie car sa formation ne correspond plus, dit-il à la conversion en une firme pharmaceutique. En effet celle-ci se concentre sur cinq médicaments potentiels dont un en est au stade II des essais cliniques.

HGS a encore $1,3 milliard en caisse mais est, quand même, assez loin de la commercialisation de son premier produit. Les actions de la compagnie sont tombées à 12 dollars contre un sommet incroyable de $232 en Mars 2000.

Comme Craig Venter qui a quitté Celera Genomics en Janvier 2002, W Haseltine fait partie de ces scientifiques agressifs qui ont séduit des financiers, mais sans pouvoir réussir les paris financiers, même si leurs succès scientifiques sont indéniables. Ils se baggarrait d'ailleurs avec délices lors de la collaboration entre HGS et The Institute for Genomic Research (TIGR), qui s'est dénouée en 1997.

144. La compagnie néo-zélandaise Trees & Technology va planter 3 millions de Pinus radiata (pin de Monterey) clonés à partir de seulement 12 arbres aux phénotype intéressants. KG; Nature Biotechnology 22 (MAR04) 261.

Voilà un beau désastre en perspective sur le plan pathologique. et peut être sur celui de la qualité, si on s'est trompé ou si le clonage n'est pas si clonal que cela.

La Politique

 

145. Pénicilline, vancomycine et érythromycine ont été mises sur le marché il y a une cinquantaine d'années par Eli Lilly. En 2002 tout investissement de la compagnie dans le secteur a été arrêté pour s'intéresser à des secteurs plus lucratifs que la thérapie d'infections aigues. La société va se consacrer à la lutte contre les virus et au renforcement des défenses immunitaires. Abbott Laboratories et Aventis, comme d'autres en font autant. .

Il y a peu de temps l'analogue de pénicilline qu'était la méthicilline a été mis sur le marché et déjà les Staphylococcus aureus devenaient résistants (ils le sont, actuellement, dans 54 à 88% des cas selon le staphylocoque).

L'U.S. Food and Drug Administration (FDA) avait approuvé 16 nouveaux antibactériens de 1983 à 1987, neuf l'étaient de 98 à 2003 (ce qui signifie que les projets en avaient été lancés dix ans avant). Seuls deux nouveaux composés originaux et utilisant des voies d'attaques d'un nouveau type ont été "sortis" dans les 5 dernières années. Un article de RF Service; Science 303 (19MAR04) 1798, attire une nouvelle fois l'attention sur ce problème majeur de l'incompatibilité des stratégies des firmes pharmaceutiques et les besoins de santé, sur lequel on n'insiste jamais assez.

Parmi les 400 produits en développement dans 11 des plus grandes compagnies pharmaceutiques, seulement 5 sont des antimicrobiens. Les raisons de cet état de fait sont connues il n'y a, encore, que trop peu de microbes résistants pour que les financiers s'y intéressent. Même les médecins ont tendance à ne pas vouloir utiliser ces nouveaux antibiotiques en les considérant comme des instruments de dernier recours, ce qui se comprend, mais rend les perspectives commerciales très décevantes. Quand ce sera trop tard, il y aura des financiers enclins à regarder de ce côté, mais il faudra attendre une dizaine d'années avant de percevoir une solution. Il y a des incompatibilités entre les priorités et les calendriers des uns et des autres. L'article donne un tableau intéressant sur le pourcentage des infections résistantes pour un couple antibiotique/bactérie

La FDA essaye de simplifier le processus d'autorisation pour les antibiotiques pour les rendre attractifs et surtout pour que l'industrie puisse plus rapidement les mettre sur le marché, cela ne rendra pas ces médicaments essentiels plus attractifs sur le plan financier.

Je me pose la question si cela ne devrait pas conduire la recherche publique, avec une aide délibérée des états, à renforcer son action dans ce domaine délaissé pour des préoccupation financières à court terme, et préparer dans ce cas comme dans d'autres, où les objectifs à plus long terme sont clairement perceptibles, quitte à passer le flambeau au privé le moment venu. Une idée originale allant dans ce sens a été émise par les spécialistes des maladies infectieuses. La FDA pourrait proposer une liste d'antimicrobiens prioritaires pour lesquels on garantirait une prolongation de la propriété industrielle, selon un schéma un peu semblable à celui utilisé pour les médicaments orphelins.

146. Une conséquence inattendue de la décision du président Bush de limiter aux lignées de cellules souches humaines actuellement existantes le financement public des recherches est que les universités créent des compagnies "privées" pour financer ce type de recherches. C'est le cas de Harvard University qui va mobiliser 100 millions de dollars dans ce but. Les chercheurs de l'université ont créé 17 nouvelles lignées pour permettre leurs recherches. Que ce soit au New Jersey, au Wisconsin ou en Californie, scientifiques et politiciens tournent ainsi la décision présidentielle dont ils estiment que c'est un frein au développement des sciences médicales. A Lawler; Science 303 (05MAR04) 1453.

147. On trouvera dans JL Lusk; Effects of cheap talk on consumer willingness-to-pay for golden rice. American Journal of Agricultural Economy 85 (NOV03) 840–856 ou http://news.uns.purdue.edu/html4ever/031024.Lusk.rice.html, une étude sur l'acceptabilité du riz doré de Potrykus, enrichi en vitamine A. L'argument central avancé par cet auteur est que si on explique bien les bénéfices pour le consommateur d'une telle plante transgénique, il l'acceptera mieux, mais que cela ne suffit probablement pas. Le vocable "cheap talk" correspond à un terme d'enquête de marketing.

148. Les études développées en Grande Bretagne au UK Ministry of Defence bioweapons laboratory at Porton Down dans le cadre des défenses contre le bioterrorisme ont permis de mettre au point un essai rapide d'identification de bactéries en aérosol. Une compagnie du site militaire britannique, Acolyte Biomedica, a acquis la licence de production du kit correspondant. Il concerne les Staphylococcus aureus méthicilline-résistants qui causent, rien qu'en Grande Bretagne, £1 milliard au National Health Service tous les ans. Ces bactéries sont des commensaux de la peau mais, si une infection se déclare, on ne dispose que de très peu de défenses alternatives (voir le §145). Le principe du procédé est de déposer des anticorps contre ces bactéries sur des billes magnétiques ce qui permet de les capter et de les concentrer. Les bactéries ainsi récoltées sont placées sur un milieu contenant l'antibiotique. La détection des bactéries survivantes (donc résistantes) se fait avec une luciférase qui a besoin d'ATP pour luminescer, ATP qui ne peut être fourni que par une cellule vivante. Tout ceci est connu et utilisé depuis longtemps, mais l'addition d'ADP (qui est rechargé par les cellules vivantes) au milieu, multiplie par 100 la sensibilité du kit. Celui-ci sera commercialisé dès le début de l'année prochaine.

149. Même si les biotechnologies n'ont pas un traitement spécial dans le prochain budget de l'administration Bush, elles bénéficient des mesures anti-terroristes. Le seul budget où les biotechnologies sont expressément mentionnées est celui de la National Science Foundation

Les recherches au sein du NIH liées au bioterrorisme consistent en un développement de nouveaux moyens de détection, les thérapeutiques et les vaccins.

La demande de budget 2005 comporte $400 millions pour la Strategic National Stockpile, qui serait transférée du Department of Homeland Security (DHS) au Health and Human Services (HHS). Ces stocks comportent des antimicrobiens, des vaccins et autres fournitures pouvant être distribués rapidement dans le pays en cas d'attaque. L'administration demande, également, $2,5 milliards (contre $0,9 milliard l'an passé) pour le Project BioShield, qui autorise le gouvernement à acheter de façon préventive, des vaccins et autres médicaments contre le bioterrorisme, ce qu'il fait en France, notamment.

Les CDCs (Centers for Disease Control and Prevention) d'Atlanta vont développer, en coordination avec la Food and Drug Administration (FDA) et le DHS et l'USDA (Department of Agriculture), les techniques de détection précoce des pathogènes. Le budget 2005 du CDC comprend $130 millions dans ce but, dont l'investissement essentiel est le projet de surveillance en santé humaine "BioSense" de $100 millions destiné à détecter automatiquement et de façon précoce toute anomalie dans les pathologies observées.

Les demandes pour la recherche à l'USDA sont de $2,4 milliards, dont $180 millions pour le National Research Initiative competitive grants program et $987,6 millions pour les recherches internes au sein de l'Agricultural Research Service (ARS). Un aspect intéressant est que le budget propose de doubler l'USDA Biotechnology Regulatory Services program à $12 millions pour plus d'inspections des cultures et élevages transgéniques, pour satisfaire les demandes formulées dans le rapport de l'US National Academy of Sciences de 2002.

Le budget propose de rendre permanente la déduction fiscale de 20% de la R&D, ainsi que plusieurs autres mesures provisoires destinées à favoriser les recherches des compagnies de recherche qui devaient disparaître cette année.

Par ailleurs, le Department of Commerce pourra conserver la totalité (1,5 milliards de dollars) des redevances de son bureau des brevets (l'US Patent and Trademark Office) pour embaucher des examinateurs supplémentaires. JL Fox; Nature Biotechnology 22 (MAR04) 256-257.

150. L'Inde dépense 350 millions de dollars de pesticides chimiques. Un consortium de sept compagnies semencières indiennes, Swarna Bharat Biotechnics Private Ltd (SBBPL), dont Nuziveedu Seeds de Hyderabad est la principale, voudrait briser le monopole de Monsanto sur les cotons transgéniques. Monsanto cherche, de son côté, à atténuer le sentiment hostile de certains, dans ce pays, lié à la domination de la joint venture Monsanto-Mahyco Biotech. Les membres du SBBPL couvrent 30% du marché des semences de coton indien. Les cotons Bt sont pour l'instant fournis par Monsanto-Mahyco Biotech. Ils couvrent actuellement environ 100 000 hectares contre 10 millions d'hectares en cotons conventionnels.

Le SBBPL compte vendre ses semences transgénique un tiers moins cher que celles de Monsanto. Mais surtout 70% des redevances à Monsanto sont transférés aux Etats-Unis alors que celles du SBBPL restent en Inde. Thème connu.

Le consortium veut développer toutes les opportunités, d'où qu'elles viennent pour éviter que toutes les recherches faites dans le pays ne soit sur les gènes brevetés par Monsanto. Le consortium est en train d'examiner les brevets des multinationales qui tombent dans le domaine public. Par ailleurs un examen des brevets indiens est également en cours

C'est le cas du gène d'une lectine (LecGNA 2) du Center for Plant Molecular Biology (CPMB) de l'Osmania University de Hyderabad. Le CPMB a déjà développé un riz résistant aux insectes.

Le consortium a également développé deux gènes de Bacillus thuringiensis (Bt) isolés sur place protégeant le coton contre le ver de la capsule (Helicoverpa armigera) et Spodoptera litura caractérisés par le National Botanical Research Institute de Lucknow.

Monsanto affirme, cependant, être serein. La firme se base sur la solidité de ses techniques que le consortium ne peut encore revendiquer. Neuf autres semenciers indiens ont acquis les licences d'évènements Monsanto chez le coton. Cependant, Monsanto a récemment eu des ennuis avec son dernier hybride pour les régions du nord du pays (Pundjab), car cet hybride est sensible au curl leaf virus.

151. L'US Department of Agriculture (USDA) a annoncé au début de l'année que les règles gouvernant les cultures transgéniques (qui datent de 1986) vont être réexaminées et probablement modifiées à la suite de deux rapports extérieurs au département sur le sujet. Le "coordinated framework" de l'époque considérait qu'il n'y avait pas lieu de créer d'instance spéciale pour ces cultures. Les Biotechnology Regulatory Services de l'APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) de l'USDA ont maintenant une bonne expertise, ayant approuvé 61 variétés transgéniques, et effectué plus de 10 000 vérifications sur le terrain..

Cette expérience leur permet de conclure qu'on doit focaliser l'attention sur les nouvelles cultures transgéniques produisant des substances actives ou des matières premières chimiques. L'exemption de contrôle des cultures qui sont maintenant familières comme le maïs ou le soja permettrait de libérer du personnel pour l'examen des cultures non encore familières.

Des experts externes émettent cependant quelques doutes sur des aspects juridiques à propos de ces réglementations, comme dans le domaine environnemental à propos des insectes transgéniques. Par ailleurs, ils soulignent que le confinement des OGMs pendant la période d'évaluation n'est peut être pas aussi sûr que cela et qu'il faudrait réévaluer sérieusement cet aspect, avant de le généraliser (voir le rapport "Biological Confinement of Genetically Engineered Organisms" de l'US National Academy of Sciences). Ce rapport a examiné différentes méthodes de confinement comme les barrières physiques ou les techniques de stérilisation destinées à éviter une dissémination non intentionnelle. L'efficacité dépende de l'organisme et on doit raisonner cas par cas. Là encore on doit jouer sur la multiplication des probabilité individuelles en combinant plusieurs types de barrières.

Le rapport de la Pew Initiative for Food and Biotechnology , intitulé "Bugs in the System? Issues in the Science and Regulation of Genetically Modified Insects" va plus loin en mettant en cause les façons disparates d'aborder le même problème au sein des diverses agences fédérales.

 

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