Concepts et Techniques

 

1. On trouve chez la levure trois gènes codant des sous-unités de la protéine catalytique de la télomérase

La télomérase comprend une protéine catalytique qui est une réverse transcriptase associée à un ARN. Chez la levure et chez les Ciliés, la télomérase fonctionne en permanence, tandis que chez l'homme, par exemple, son activité est régulée et limitée aux tissus en fort renouvellement.

Chez Euplotes, deux sous-unités ont été identifiées. Deux des trois protéines caractérisées dans l'activité de la télomérase, Est1 et Est3 (Ever shorter telomers) sont des éléments régulateurs. La question est de savoir si ces protéines régulatrices se retrouvent chez les autres eucaryotes. V Lundblad; Current Biology 13 (13MAY03) R439-441 analyse un certain nombre d'articles traitant de ce sujet. La régulation positive d'Est1 se retrouve partout. Il y en a même trois versions chez l'homme dont deux, hEST1A et hEST1B (h pour human) sont effectivement associées à la régulation de la télomérase. Curieusement une surexpression de hEST1A entraîne une réduction des télomères et des fusions chromosomiques létales, mais cet effet est inversé en co-exprimant la sous-unité catalytique de la télomérase.

L'une de ces protéines EST1 humaines, non seulement participe à l'allongement des télomères, mais encore les protège ensuite. Ceci est également vrai pour Schizosaccharomyces cerevisiae.

Est1 de la levure sert probablement d'adaptateur entre la sous-unité catalytique et la protéine Cdc13 fixée sur le chromosome. Curieusement la télomérase est présente dans la chromatine télomérique, même quand elle est inactive, ce qui suggère qu'elle y est séquestrée dans la partie subtélomérique et rendue active uniquement à la fin de la phase S par recrutement par Est& et Cdc13. Les trois Est1 humaines se partagent-elles les fonctions de l'Est1 de la levure?

On trouvera dans Z Karamysheva et al.; Cell 113 (30MAY03) 565-576, un article sur la reformation des télomères dans le macronucleus du Cilié Euplotes crassus. Un commentaire de G Cristofari et al.; p.552-554 complète cette analyse. Usuellement tout chromosome rompu donne lieu à une délétion terminale (faute de centromère) avec reconstruction de télomères, mais la cellule évite usuellement cette situation. Les coupures doubles-brins peuvent, en effet, être réparées par fusion non homologue bout à bout, soit par recombinaison homologue. Les Ciliés ont choisi, pour leur macronucléus, une fragmentation chromosomique avec amplification, ce qui suppose une reconstitution de néo-télomères. Ils utilisent, pour ce faire, des isoformes de la réverse transcriptase de la télomérase, comme cela vient d'être montré. Euplotes possède trois gènes de cette TERT (TElomerase Reverse Transcriptase) avec des patrons d'expression différents. TERT-2 n'est exprimé que lors de la formation du macronucléus. L'activation de son gène est assurée par l'excision d'un ADN non codant qui interrompt la séquence dans la version micronucleus. Quand le macronucléus est complet le gène est éliminé.

2.On trouvera dans J Zhang; Trends in Ecology & Evolution 18 (JUN03) 292-298, une revue sur l'évolution des gènes dupliqués, basée sur les travaux de l'auteur, mais les plaçant dans un cadre général. Il ne s'agit pas des duplications de génomes, bien que ses réflexions s'appliquassent à ce cas. Ce n'est évidemment pas la première revue sur le sujet depuis la livre de S Ohno "Evolution by Gene Duplication, Springer (1970)", mais on y trouve des données intéressantes, car on dispose maintenant de nombreuses données de séquences génomiques plus ou moins complètes, qui permettent de donner un support aux cogitations théoriques.

 Ces duplications résultent de crossing-over inégaux qui engendrent des duplications plus ou moins complètes avec maintien des introns en tandem et de rétrotranspositions qui se traduisent par des insertions plus ou moins au hasard avec disparition des introns et des séquences régulatrices. Les duplications par rétrotransposition ne peuvent englober plusieurs gènes adjacents et, dépourvues de séquences régulatrices, ne peuvent être exprimées, sauf dans les cas où le hasard fait que l'insertion est placée en aval d'un promoteur. Elles donnent immédiatement un pseudogène (non exprimé et libre, de ce fait, d'évoluer sans contraintes). .

Ces duplications donnant ce que l'on appelle des gènes paralogues, ont une fréquence très variable, ce qui indique que leur prolifération est probablement sélectionnée. Car il faut réaliser que la multiplicité des gènes des immunoglobulines (avec des dizaines de gènes) ou des récepteurs olfactifs en constituent des exemples extrêmes.

Le millier de gènes de récepteurs olfactifs est un exemple intéressant, car si la souris possède le même nombre de gènes de ces récepteurs que l'homme (et probablement les autres mammifères), 60% d'entre eux ont dégénéré en pseudogènes chez l'homme, alors que ce n'est le cas que de 20% d'entre eux chez la souris, dont l'olfaction est un des sens primordiaux, contrairement à ce qui s'est passé chez l'homme.

Ceci permet d'aborder le sort de ces duplications au cours de l'évolution.

On a calculé qu'une duplication est stabilisée (on dit fixée) fonctionnellement tous les 100 millions d'années chez les eucaryotes, de la levure à l'homme. La stabilisation d'un gène dupliqué dépend de la sélection appliquée. Naissance et mort d'un tel gène sont, certes, un évènement fréquent, mais la survie dépend de la pression de sélection pour la fonction assurée. La plupart du temps il y a pseudogénisation, avec accumulation de mutations diverses amenant la séquence au stade de séquence toute faite de réserve, utilisée ou pas et, si elle ne l'est pas, devenant de plus en plus aléatoire et donc neutre sur le plan évolutif. Il existerait ainsi un pseudogène pour deux gènes fonctionnels dans le génome humain. Un gène dupliqué devient un pseudogène dans les quelques premiers millions d'années suivant la duplication.

 Il arrive, cependant, qu'un pseudogène puisse assurer une fonction. Il existe un seul gène fonctionnel de chaîne lourde variable d'immunoglobulines chez le poulet. La diversité des immunoglobulines est alors assurée par conversion génique à partir des pseudogènes situés en amont de ce gène. Les pseudogènes servent donc de réserve génétique, bien qu'ils ne soient plus fonctionnels. La variabilité utilisée est donc celle libérée par la pseudogénisation (qui n'est pas contrainte du fait que les gènes ne sont pas exprimés).

Le gène de la ribonucléase pancréatique des ruminants a subi une duplication qui a eu lieu avant la diversification des ruminants, il y a 35 millions d'années. Or, chez les bovins, le gène dupliqué est exprimé dans la semence et l'enzyme est fonctionnelle, alors que, chez les autres ruminants, elle est non fonctionnelle, ou le gène n'est plus exprimé. Ceci indique que la séquence a très longtemps été conservée sous la forme d'un pseudogène avant de récupérer sa fonction chez les bovins pour une raison inconnue.

La conservation des deux gènes issus de la duplication peut être sélectionnée dans le cas de produits géniques nécessaires en abondance. Ce sont souvent des duplications par conversion génique (il faut une conservation des séquences régulatrices et des introns) qui sont à l'origine de ces duplications. Ils sont alors soumis à une évolution concertée des séquences, et une purification par sélection évite, surtout, les divergences.

Une autre issue possible est la subfonctionnalisation. Pas mal de protéines ont une double fonction ou une double localisation de l'expression, l'une majeure, l'autre secondaire. Une divergence entre les deux copies permet d'amplifier cette différence car la redondance laisse de la marge aux variations des séquences. C'est le cas pour les gènes dupliqués engrailed-1 et engrailed-1b du poisson-zèbre. Il en existe un seul orthologue chez la souris avec engrailed-1. Le gène unique de la souris est exprimé dans les bourgeons des membres et dans le système nerveux central, alors que ces deux localisations sont distribuées entre les deux gènes des poissons osseux.

Un exemple de divergence dans la fonction (issu des travaux de l'auteur) est celui des singes colobidés. Ces singes se nourrissent de feuilles, alors que les autres singes sont consommateurs de fruits ou d'insectes. Ce sont des "ruminants", qui consomment en réalité les bactéries qui fermentent les feuilles. Ils possèdent, en effet, une sorte de panse antérieure. Comme chez les ruminants, ils produisent beaucoup de ribonucléase pancréatique (permettant de bien recycler l'azote des acides nucléiques). Le gène de la RNase1 est dupliqué en RNase1B chez le Colobe asiatique Pygathrix nemaeus. (voir J Zhang et al.; Nature Genetics 30 (APR02) 411–415. Le gène de la RNase1B a évolué beaucoup plus rapidement que celui de la RNase1, les substitutions non synonymes (donnant donner un acide aminé différent) sont, en effet, beaucoup plus nombreuses dans ce gène que dans sa copie originale persistante. Reste à expliquer la persistance d'une duplication fonctionnelle. Ce n'est pas une redondance parfaite qui a été sélectionnée, mais une adaptation au pH intestinal relativement acide (pH6,3) de ce colobe (alors que celui d'un singe Rhésus est de 7,4 à 8) ou la RNase1B est six fois plus active que la RNase1, alors que le pH opt est le même avec 7,4 pour les deux RNases. Par ailleurs, la RNase1 a une autre fonction, mineure, qui est celle d'une RNase double brin. Cette fonction est déprimée de 300 fois pour la RNase 1B. Il y a donc une adaptation et une spécialisation des deux gènes dupliqués.

On retrouve cette spécialisation dans les deux opsines rétiniennes des primates du Vieux Monde permettant la perception du rouge et du vert liée à deux substitutions. Mais ces "néofonctionnalisations" peuvent comporter de très nombreuses substitutions et l'on peut se demander quelle a été la fonction de la protéine entre temps, pour qu'elle ait été conservée.

L'auteur traite ensuite des forces qui sont derrière ces modifications géniques. La sélection est évidente quand on observe nettement plus de mutations non synonymes que de synonymes après la duplication. La divergence peut résulter de l'apparition d'une nouvelle fonction, faible mais utile, qui est alors l'objet d'une sélection positive. Elle peut résulter également de l'amélioration d'une fonction secondaire préexistante, qui devient primaire dans un des deux gènes.

3. Un article de chercheurs du TIGR (The Institute for Genomic Research) discute des apports respectifs de la "génomique " et des données de l'évolution: JA Eisen et al.; Science 300 (13JUN03) 1706-1707.

On commence, en effet, à réaliser comment similitudes et différences entre génomes ont pris naissance et quand elles sont apparues. Ces études sont très souvent rendues possibles uniquement quand la séquence complète du génome est connue et inversement certaines études génomiques sont facilitées par les données évolutives. L'intégration des deux approches est suggérée par les auteurs

C'est ainsi que l'on pu montrer que les bactéries hyperthermophiles sont probablement  apparues récemment, que les Microsporidies sont en réalité des champignons, et non des protistes très anciens.

Les études de génomes ont permis de disposer de marqueurs permettant d'analyser des populations au sein des espèces, comme celles des Bacillus anthracis ou de Mycobactéries en neutralisant le bruit de fond, ce qui permet l'émergence du signal phylogénétique.

Inversement, les ramifications de l'arbre évolutif peuvent être utilisées en génomique si l'arbre est solide. Cet arbre permet de sélectionner l'espèce qui est la mieux adaptée à une question donnée. Drosophila pseudoobscura a été choisie pour un séquençage total car elle est relativement éloignée de D.melanogaster, mais permet de repérer les régions régulatrices qui doivent être relativement conservées. L'arbre évolutif permet, par ailleurs, de sélectionner des espèces encadrant les grandes transitions évolutives majeures. Ainsi des génomes situé de part et d'autre de la transition Pro-Eucaryotes ont permis d'identifier des structures géniques absentes des procaryotes et conservés au sein des eucaryotes. Les auteurs pensent, ainsi, qu'il serait intéressant de séquencer un Monotrème (ces premiers Mammifères comme l'Echidné Echidna hystrix ou setosa, ou le Platypus Ornithorhynchus paradoxus)

Une connaissance détaillée de l'arbre et de l'origine de certains caractères évite de regrouper artificiellement des caractères apparus plusieurs fois et indépendamment, comme la pluricellularité.

Les transferts dits latéraux viennent parfois perturber la nature ramifiée des arbres phylogénétiques. Leur existence a bien été confirmée par les séquençages complets. C'est en particulier, le cas des îlots de pathogénicité chez les bactéries et surtout des transferts géniques entre organites (mitochondries et chloroplastes) et noyau de leurs cellules hôte (Plantes ou Plasmodium). Il faut cependant se méfier, car de nombreuses anomalies ont été expliquées un peu vite par ces transferts latéraux. C'est ainsi que l'on a crû déceler des centaines de gènes bactériens chez l'homme en 2001, ce qui a été réfuté par au moins trois publications subséquentes dès la même année. En réalité il est souvent difficile d'identifier de tels transferts dans les nombreuses anomalies de distribution, et ils sont probablement rares et ils n'ont probablement pas beaucoup modifié les arbres.

L'utilité de la phylogénie pour la prédiction de fonctions est notée. Les auteurs reprennent l'exemple des duplications totales ou segmentaires. Ils remarquent que les réarrangements importants chez les bactéries sont surtout des inversions de part et d'autre de l'origine de réplication. L'âge des duplications est également un indice, des duplications récentes sont souvent liées à un renforcement fonctionnel, tandis que des duplications anciennes donnent, le plus souvent, lieu à une divergence (voir §précédent).

4. Le protéasome 26 S comporte au moins 32 sous-unités différentes. Il est normalement constitué, chez les eucaryotes, d'un noyau 20S associé à deux complexes régulateurs. Le noyau 20S est constitué de quatre anneaux heptamériques superposés constitués de 14 sous-unités différentes mais plus ou moins homologues. Les deux anneaux supérieur et inférieur (constitués des sous-unités a) ont une fonction de cerbères à l'entrée du substrat et à la sortie des produits.

Seules trois des sept sous-unités b des anneaux médians participent à l'activité protéasique et forment les six sites thréonine actifs. Le complexe régulateur 19 S se fixe sur le noyau par le biais d'une "base" composée de six ATPases plus deux sous-unités non-ATPasiques. Les ATPases exercent une activité de chaperone permettant, apparemment, l'introduction du substrat dans le canal axial du complexe.

 On vient de montrer que les inhibiteurs de l'activité du complexe chez les mammifères entraînent une expression compensatoire des gènes codant ses sous-unités, ainsi que du facteur de maturation du protéasome POMP (Proteasome Maturation pProtein, Ump1 chez la levure). S Meiners et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (13JUN03) 21517-21525.

5. Les protéines destinées au noyau portent un signal de ciblage (NLS) correspondant. Elles se lient à un hétérodimère des importines (alias caryophérines) a et b. L'importine a reconnaît et lie la NLS dans une poche de la molécule constituée par un motif Armadillo, tandis que l'importine b transporte le complexe trimérique (avec la charge) à travers le pore nucléaire. La petite GTPase Ran, qui régule les interactions entre les récepteurs nucléaires et le fret introduit, assure la directionnalité du transport. La GTPase dissocie l'importine b du complexe. Le complexe est alors réduit à la charge fixée sur l'importine a par la NLS. Les transporteurs sont ensuite recyclés vers le cytoplasme.

Il existe, dans la partie N-terminale de l'importine a liant l'importine b (IBB), une séquence auto-inhibitrice conservée sur le plan évolutif qui régule la fixation de la protéine par la NLS dans la poche grâce à une obstruction intramoléculaire. L'analyse de cette interaction a été réalisée chez Saccharomyces cerevisiae et son importine a, Srp1p. Des mutations dans le domaine IBB diminuant l'affinité de la séquence auto-inhibitrice pour la poche réceptrice de l'importine a,  modifie les fonctions de cette protéine, la séquence auto-inhibitrice normale assurant le largage de la charge dans le noyau, IBB empêchant une refixation de la charge après sa libération.

La dissociation NLS-fret de l'importine est probablement réalisée grâce au récepteur d'exportation de l'importine Cse1p, à la nucléoporine Nup2p et au domaine auto-inhibiteur. On vient de montrer que le domaine N-terminal IBB de l'importine a et Cse1p participe de façon conjointe au largage du fret, tandis que Nup2p intervient à la fois dans la décharge et dans le recyclage de l'importine par un mécanisme distinct. MT Harreman et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (13JUN03) 21361-21369.

6. Des chercheurs du Memorial Sloan-Kettering Cancer Center montrent que les SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide–sensitive factor Attachment protein REceptors) qui ont été évoquée à propos de la fusion des membranes intracellulaires par interaction entre une protéine de la vésicule (v-SNARE) et de la cible (t-SNARE) permettent les fusions inter-cellulaires. C Hu et al.; Science 300 (13JUN03) 1745-1749.

 

Les Productions Végétales

Les gènes et les génomes

7. Des séquences de divers virus ont été découvertes au sein des génomes de plantes. Cette intégration n'a lieu que pour les quelques virus à ADN des plantes, ou qui ont une phase ADN comme les rétrovirus.

Trois para-rétrovirus, Banana streak virus (BSV), Tobacco vein clearing virus (TVCV) et Petunia vein clearing virus (PVCV), donnent lieu à des infections épisomales (avec libération de leur ADN) lors de stress dans certains génotypes de leurs hôtes, particulièrement chez les AAAB tétraploïdes produits par croisement de variétés AAB avec des AA. (Voir également le Bulletin de Février 2002 §22). Les pararétrovirus, dont le prototype est le virus bien connu de la mosaïque du chou-fleur, se répliquent via une réverse transcription du génome ARN redondant à ses extrémités.

Dans le cas des BSV et TVCV, l'un des parents doit porter la séquence sans pouvoir donner lieu à son activation sous forme épisomale, et ce n'est que dans des hybrides que cela peut se réaliser. Le nombre des insertions est faible pour le BSV et le PVCV, et élevé dans le cas du TVCV. On ne sait pas trop bien comment se fait la conversion épisomale, rétrotranscription ou recombinaison. On connait également de telles situations avec des géminivirus, mais, dans les deux cas, ces insertions ne sont pas associées à des symptômes pathologiques.

Une revue sur ces séquences intégrées qui comprennent également les rétrotransposons est parue avec G Harper et al.; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 119-136. Les rétrotransposons sont définis par leur intégration et leur structure comprenant un gène d'intégrase. Aucun n'est infectieux chez les plantes (d'ailleurs, seul Gypsy, parmi les rétrotransposons animaux, est infectieux). Les rétrotransposons des plantes peuvent coder une protéine d'enveloppe, mais elle n'intervient pas dans la transmission de cellule à cellule, et aucun d'entre eux ne code de protéine de mobilisation.

Le génome du Banana streak virus est présent dans tous les plants de bananes sains (ce qui exclurait la possibilité de l'éliminer, comme on l'envisageait, en 1999, des cultivars usuels sans les séquencer auparavant).On en trouve, en effet, deux classes. L'une est constituée de séquences partielles qui ne donnent pas lieu à infection et qui ne sont donc pas dangereuses a priori. C'est le cas pour les bananes desserts (par rapport aux bananes plantains). Elles sont d'ailleurs très divergentes par rapport aux BSV inductibles, et ressemblent plutôt au Cacao swollen shoot virus. Les autres sont complètes et sont probablement la source des infections induites par les stress en cultures de tissu (voir T Ndowora et al.; Virology 255 (15MAR99) 214-220) chez les hybrides M. acuminata x M. balbisiana. Ces séquences sont alignées en tandem. Une de ces séquences complètes a été clonée et elle est interrompue par des réarrangements multiples. Elles sont insérées à deux loci. Il est vraisemblable que ce sont des recombinaisons entre répétitions qui engendrent la forme épisomale dans ce cas.

Le Tobacco vein clearing virus est exclusivement transmis à 100% par la graine chez les Nicotiana edwardsoni (un hybride interspécifique allohexaploïde entre N. clevelandii et N. glutinosa). Symptômes et virions apparaissent uniquement dans certaines conditions. Il est donc intégré et activable sous forme d'épisomes. Des séquences TVCV-like ont été détectées chez N.tabacum, N.otophora, N.sylvestris et N.tomentosiformis, mais aussi chez des Datura et la tomate.

Une recherche systématique indique que ces séquences peuvent être exprimées, car on les trouve dans les banques d'ESTs (marqueurs de séquences exprimées) chez la pomme de terre, la tomate et Lycopersicum hirsutum.

Chez les Petunia hybrides probablement issus d'un croisement P.axillaris ssp. axillaris par P.integrifolia ssp. inflata, on trouve pratiquement toujours des séquences du Petunia vein clearing virus (PVCV), mais elles sont souvent incomplètes. Le cultivar Himmelsroschen en contient, cependant, une version complète. La distribution de ces séquences dans le génome indique qu'elles sont issues de P.axillaris.

Des phénomènes similaires ont lieu pour les Geminivirus, mais ils sont toujours incomplets chez N.tabacum, N.tomentosiformis, N.tomentosa et N.kawakamii. Mais il faut savoir que ces séquences interagissent avec le Cotton leaf curl geminivirus (CLCV) qui les encapside. Il en est de même pour le Rice tungro bacilliform pararetrovirus (RTBV).

Il est évident que ceci doit être pris en compte dans les études sur la sûreté des plantes, OGMs ou pas (pensez aux boutures de bananiers commercialisées). Les séquences existent et l'on ne peut les éliminer des plantes cultivées, mais on doit déterminer si elles sont activables ou non. Par ailleurs, le fait de détecter des séquences de pararétrovirus végétaux dans un génome ne signifie en aucune manière que la plante a été transformée avec le promoteur 35S classique du virus de la mosaïque du chou-fleur, dont on trouve des traces dans de nombreuses plantes transgéniques. On peut également se demander s'il n'y a pas interférence entre ces séquences et des transgènes qui pourraient les activer. On n'en a encore aucun exemple. Inversement des virus infectants peuvent interagir avec ces séquences naturelles, comme on l'a montré avec un CLCV. Le CaMV peut donner lieu à une recombinaison en laboratoire avec des séquences de transgènes intégrées au génome, donnant de nouveaux virus, mais on n'a jamais constaté de telles recombinaisons dans la nature et cela doit être très rare.

L'expression génique

8. Des ARNs doubles brins ou "short interfering RNAs" (siRNAs) et des microRNAs (miRNAs) simple brin participent à la régulation de l'expression génique chez les animaux. Les premiers interviennent en induisant la destruction des messagers strictement homologues, tandis que les seconds qui dérivent de courts précurseurs doubles brins imparfaitement homologues de leur cible, et transcrits à partir de séquences intergéniques endogènes, freinent la traduction de ces messagers. Chez les plantes, les deux provoquent le clivage des messagers homologues (Voir le Bulletin de Février §17). La protéine SGS2/SDE1, codant probablement une ARN polymérase ARN-dépendante, permet la production des siRNAs, tandis que DCL1 et HEN1 participent à la production des miRNAs..

Le groupe de Vaucheret montre comment, chez Arabidopsis, SGS2, SGS3 (une protéine de fonction inconnue), AGO1 (une ARN hélicase) et HEN1 (Hua ENhancer, une protéine à effets pleîotropes, intervenant dans la spécification de l'identité des étamines et des carpelles, mais probablement un homologue de la RNase Dicer et de Carpel Factory, voir le Bulletin de Décembre 02 §21) permettent la production des siRNA impliqués dans la répression post-transciptionnelle "sens" des messagers (S-PTGS) et que HEN1, mais pas SGS2, SGS3 ni AGO1, contribue à l'accumulation du miRNA endogène de miR171  et à l'hyperclivage du messager cible Scarecrow par miR171. 1. Enfin SGS2, SGS3, AGO1 et HEN1 contribuent à la résistance de la plante au virus de la mosaïque du concombre, ce qui n'est pas le cas des siRNA. On peut d'ailleurs découpler les deux types d'action de HEN1 par mutation. S Boutet et al.; Current Biology 13 (13MAY03) R843-848.

Le développement

9. On commence à voir paraître des données sur la formation des stomates. Une revue de JA Nadeau et al.; Trends in Plant Science 8 (JUN03) 294-299 porte sur ce sujet. Ce sont des produits de divisions asymétriques et d'une division symétrique dont le plan est orienté par des informations positionnelles entre cellules. Contrairement à ce qui se passe pour les stomates des monocotylédones qui sont disposés en rangées, ceux des dicotylédones se disposent au hasard dans l'espace et le temps durant la croissance mosaïque de la feuille. Arabidopsis a permis de dégager les règles du développement qui sont rigoureuses, et celles qui restent flexibles. Ces divisions assurent qu'il reste toujours une cellule non différenciée espaçant les stomates.

La caractérisation des mutations dans TMM (TOO MANY MOUTHS) et SDD1 (STOMATAL DENSITY AND DISTRIBUTION 1) ont permis d'aborder les mécanismes de distribution des stomates.

TMM permet la perception ou la transduction des signaux qui orientent les divisions ou les empêchent. Il code une protéine de type LRR-RLP (Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Protein). Comme d'autres récepteurs de ce type, CLAVATA2 par exemple, ce récepteur ne possède pas de domaine kinase pour transmettre des signaux, et doit donc être associé à des kinases.

SDD1 code une protéase de sérine de type subtilisine. Elle doit cliver ou modifier un signal protéique. On n'en sait guère plus pour l'instant.

11. On s'intéresse beaucoup au développement des tissus ligneux. Pinus taeda (Loblolly Pine ou Pin à encens) est un modèle utilisé. Le génome de Pinus taeda contient 20 000 Mpb contre 125 Mpb pour Arabidopsis et 430 Mbp pour le riz. Il n'y a pas de signes d'une polyploïdie récente chez les pins. L'idée d'utiliser Arabidopsis pour élucider ces mécanismes paraît saugrenue. Et pourtant un article de M Kirst et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 7383–7388 compare la formation des tissus du xylème dans ces deux systèmes et constate que sur 59 797 ESTs (Expressed Sequence Tags) des tissus ligneux du pin issus de six bibliothèques partielles obtenues à partir d'arbres d'âges différents, 90% ayant au moins 1000 pb de long ont des homologues dans le génome d'Arabidopsis. Des séquences assez longues sont nécessaires pour détecter les homologues dans deux plantes ayant divergé depuis 300 millions d'années, ce qui n'est pas inattendu.

12. Les vésicules de précurseurs de protéases à cystéine (PPVs), dérivées du réticulum endoplasmique, sont des compartiments spéciaux de la cellule végétale où sont stockées des hydrolases. Il existe deux de ces protéases: VPEg (Vacuolar Processing Enzyme-g) et RD21. Ces enzymes sont probablement engagées dans les processus de sénescence. Celle-ci entraîne l'expression de VPEg et de RD21,ainsi que la maturation de RD21 stockée sous une forme inactive dans ces vésicules.

VPEb participe à la cascade aboutissant à l'élimination de l'invertase vacuolaire Fruct4, par exemple, dans les tissus de réserve vieillissants à la germination. Une VPE intervient également dans la sénescence des pétales. VPEg a été exprimée chez la levure et les résultats indiquent que c'est une enzyme vacuolaire. Chez Arabidopsis, elle interviendrait, comme chez la levure, dans la maturation de la carboxypeptidase Y. E Rojo et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 7389-7394.

13. Deux articles des chercheurs du groupe de Caroline Dean au John Innes Centre décrivent un mécanisme nouveau, intervenant lors de la floraison saisonnière, mais d'une portée plus générale. GG Simpson et al.; Cell 113 (13JUN03) 777-787 et V Quesada et al.; The EMBO Journal 22 (16JUN03) 3142-3152.

Quatre signaux correspondant à des voies distinctes régulent la floraison d'Arabidopsis: la voie des gibbérellines qui est indépendante de la photopériode, la photopériode (normalement les jours longs) et la vernalisation (qui exige une période de froid pour vérifier que l'hiver est passé). La quatrième voie, dite autonome, correspond à un signal qui pousse continuellement la plante à fleurir. Elle est bloquée par un facteur de transcription codé par FLOWERING LOCUS C (FLC), qui réprime la transition florale via les deux dernières voies. Quand cette répression par FLC est débordée l'équilibre entre ces voies est déréglé et la floraison est accélérée. FLC est commandé par plusieurs gènes régulateurs dont FCA, une protéine liant les ARNs. FCA (il paraît que ce nom n'a aucune signification) régule la troncature des messagers au sein de l'intron 3 et la polyadénylation de son propre messager en association avec FY.

L'article dans Cell indique comment FCA régule son propre messager. Le messager de FCA existe sous quatre formes, a,b,g et d, dont la forme la plus courte, FCA-b, et la forme pleine taille, FCA-g, sont les plus abondantes. La forme FCAb résulte d'une troncature au niveau d'un site de polyadénylation situé dans l'intron 3 où un codon stop est présent et cette troncature donne une forme non fonctionnelle de la protéine. Le maintien de ces deux formes est indispensable à la floraison (article dans EMBO Journal).

La protéine FCA, outre ses deux sites de reconnaissance des ARNs, possède un domaine d'interaction entre protéines (domaine WW ressemblant aux domaines SH3 reconnaissant des motifs PXXP qui adoptent une conformation polyproline). FCA interagit, via le domaine WW, avec une autre protéine, FY. FY correspond à un mutant de floraison tardive épistatique par rapport à FCA, c'est-à-dire qu'il interfère avec le phénotype de FCA (un gène non allélique).

FY est un homologue très proche du facteur de polyadénylation de la levure, Pfs2p , qui appartient à la grande famille dont fait également partie CstF-50 qui est un facteur central de la polyadénylation chez les mammifères.

Mais ni FY, ni Pfs2p, ne sont des orthologues (homologues dans des organismes différents) de CstF-50. Ils sont beaucoup plus proches d'un facteur nucléaire fortement exprimé lors de la spermatogenèse, WDC146 (WD parce qu'il porte un domaine WD voisin donc de WW) et qui est probablement un facteur de polyadénylation spécifique du testicule.

Il est donc vraisemblable que FCAg recrute FY et tout le reste de la machine de polyadénylation au site faible de polyadénylation de l'intron 3 de son propre gène. Il provoque ainsi une inactivation par troncature en FCAb (non fonctionnelle), inactivation régulant la quantité de FCAg fonctionnelle.

Il existe des orthologues de membres de la famille CstF, dont CstF-50, chez Arabidopsis. FY ne joue donc probablement pas le rôle de CstF-50, mais peut intervenir dans les interactions entre le noyau du complexe et les composants auxiliaires de la polyadénylation comme FCA. On ne sait encore pas laquelle de ces deux protéines est le facteur direct de polyadénylation.

Une autopolyadénylation est également connue chez la Drosophile avec suppressor of forked (su(f)) et c'est aussi un facteur de polyadénylation,mais un facteur du noyau du complexe.

Cette auto-régulation de FCA est commandée par le stade de développement. Une surproduction de FCA permet de déborder la répression de la floraison normalement assurée par la stimulation de FLC par l'expression de FRI (FRIGIDA). Voir à ce propos la revue de CC Sheldon et al.; Current Opinion in Plant Biology 3 (OCT00) 418-422.

14. Le gène de l'acyl-CoA oxydase (ACX4) des acides gras à courtes chaînes fait partie de la famille ACX qui assure conjointement la première étape de la ß-oxydation des acides gras dans les peroxysomes, durant la phase précoce de la germination des plantes oléagineuses.

On vient de caractériser les fonctions de ce gène par insertion d'un T-DNA. Les graines des mutants acx4 voient l'activité de l'enzyme baisser de 98%, alors que le catabolisme des acides gras à chaînes moyennes n'est pas perturbé. La croissance des plantules n'en est pas autrement altérée, sauf qu'elles accumulent de grandes quantités d'acyl-Coa à courtes chaînes et présentent une résistance à l'acide 2,4-dichlorophénoxybutyrique, qui est normalement converti en un herbicide, analogue de l'auxine, l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique par b-oxydation. Les mutants acx3 donnent lieu au même phénomène pour les acyles à chaînes moyennes. Les doubles mutants acx3acx4 avortent durant les premiers stades de la germination, probablement à la suite du recouvrement des spectres de substrats des deux enzymes, entraînant une disparition totale de la b-oxydation des acides gras à courtes chaînes. EL Rylott et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (13JUN03) 21370-21377.

La Physiologie des Plantes

15. Une série de revues sur le métabolisme des plantes est parue dans Current Opinion in Plant Biology 6 (JUN03).Elles sont un peu disparates, mais basées sur les récents apports de la génomique dans ce domaine.

JE Lunn et al.; p.208–214 (voir §16) discutent de la synthèse du saccharose et de la complexité croissante des voies de synthèse de cet élément clé du métabolisme énergétique des plantes. On a récemment découvert trois nouvelles familles de gènes de sucrose phosphate synthase et plusieurs gènes de sucrose phosphate phosphatase. MG James et al.; p. 215–222 (voir le §17) montrent que l'on n'est pas trop sûr du nombre des différentes formes d'amidon-synthases et des enzymes ramifiantes (liaison 1,6). Les auteurs montrent que, dans l'albumen des céréales, l'ADP glucose, monomère de départ de la synthèse de l'amidon est produit dans cytoplasme puis importé dans l'amyloplaste, contrairement à ce qui se passe dans les organes de stockage des autres plantes. Dans l'albumen des céréales, T Ritsema et al.; p.223–230 essayent de dégager la complexité de la synthèse des fructanes, avec les multiples gènes impliqués (voir le §19). Enfin PJ Eastmond et al.; p.231–235 analysent les gènes de synthèse du tréhalose, dont la découverte récente éclaire l'importance de ce métabolite des plantes. Le tréhalose-6-phosphate, métabolite récemment caractérisé semble avoir un rôle décisif dans le métabolisme des sucres.

NJ Kruger et al.; p.236–246 s'intéressent à la voie oxydative des pentoses, et à la localisation cellulaire (plastidique ou cytosolique) de ses acteurs, tirées d'une analyse des séquences et des signaux de ciblage des produits.

P Geigenberger; p.247–256 s'intéresse à ce qui se passe dans le métabolisme en présence d'une faible tension d'oxygène, mais bien au-dessus du seuil permettant la respiration. Ces données peuvent être utiles, quand on travaille sur des organes isolés où ces conditions sont souvent remplies.

Les séquençages ont permis de caractériser de nombreux transporteurs des nutriments minéraux des plantes. On avait, depuis longtemps, des informations sur le pompage de ces éléments par les plantes. On peut maintenant les suivre à la trace dans les tissus et les cellules. JK Pittman et al.; p.257–262 font le point sur les mouvements du calcium à travers les membranes intracellulaires, tandis que RC Gardner; p.263–267 s'intéresse au transport du magnésium et s'étend sur les nouvelles techniques de mesure disponibles.

Moins banales sont les études sur le sélénium et la silice dans les plantes qui jouent un rôle dans le métabolisme et ont des conséquences pour les plantes alimentaires ou certains bois tropicaux. On affirme, en effet, que certains composés du sélénium sont anti-carcinogènes. DR Ellis et al.; p.273–279 s'intéressent au sélénium et KE Richmond et al.; p.268–272, s'intéressent à la biologie de la silice.

J López-Bucio et al. p.280–287 s'intéresse au développement de l'architecture du système racinaire en fonction de la disponibilité et les besoins en éléments minéraux.

La coordination entre ces éléments de transport des éléments minéraux et le métabolisme primaire est plus importante que l'on ne le pensait, comme le montre les analyses d'expression génique globale. Comme le montrent TJ Buckhout et al.; p.288–296. Ce couplage est relativement bien connu dans le cas de l'azote. Les auteurs reprennent les études du même type dans le cas du fer qui module l'expression de plusieurs enzymes du métabolisme primaire. Il est intéressant à noter que ce souvent les mêmes éléments qui sont en cause dans l'intervention de la pression partielle en oxygène. Les explications sont encore à venir.

A Smith et al., dans leur éditorial p.205-207, mettent en garde contre une confiance excessive dans les données d'expression du génome. La localisation d'une enzyme de la voie oxydative des pentoses dans les chloroplastes ne signifie, probablement, pas qu'elle est active dans tous les chloroplastes, par exemple. Par ailleurs, les auteurs font remarquer qu'un accroissement de l'expression de la pyruvate kinase chloroplastique coïncide avec une forte synthèse des acides gras, ce qui pourrait faire croire que la glycolyse est activée pour répondre à la demande de squelettes carbonés pour cette synthèse. Il n'en est rien, la glycolyse est déprimée et c'est un flux de pyruvate provenant du cytosol qui est utilisé dans ce but. TJ Buckhout et al. insistent, d'ailleurs, sur les discordances entre données du transcriptome et réalité. Les niveaux de nitrate réductase sont beaucoup plus régulés par les rythmes nycthéméraux de traduction et de modification covalente, ainsi que par le turnover de la protéine que par la transcription.

16. Le saccharose est utilisé pour la synthèse des réserves polysaccharidiques comme lipidiques et il est directement utilisé, chez certaines plantes comme réserve pour le bonheur des caries dentaires (canne à sucre ou betterave sucrière, et dans de nombreux fruits, pour faciliter le dégagement des graines par les microbes, sorte de carie fruitière indispensable à la dissémination des graines par les insectes et autres animaux). C'est aussi un régulateur de la pression osmotique chez certaines plantes où sa production est stimulée aux basses températures ou le stress hydrique. Ceci explique que sa synthèse soit fortement régulée. Une revue de JE Lunn et al.; Current Opinion in Plant Biology 6 (JUN03) 208-214, déja évoquée plus haut est consacrée à ces régulations.

Cette régulation a surtout lieu lors de la première étape catalysée par la sucrose-phosphate synthase (SPS). Il en existe au moins trois familles chez les plantes, ce qui complique les schémas en sus des régulations transcriptionnelles, allostériques et post-traductionnelles de leurs activités. On ne sait pas bien s'il existe des redondances entre ces familles. Le gène codant l'enzyme de la dernière étape, la sucrose-phosphatase (SPP) vient, enfin, d'être cloné. SPS contient un domaine SPP-like C-terminal, ce qui fait qu'un complexe SPS–SPP doit probablement exister.

Le saccharose est également un signal modulant l'expression de certains gènes d'enzymes, de transporteurs et de protéines de réserve, mais aussi de différenciation, dont celles des tissus vasculaires, de la graine ou de la floraison. Il reste, cependant, à établir les mécanismes en cause, ce qui n'est pratiquement pas fait. Les auteurs de la revue avouent ne pas pouvoir couvrir tout ce champ, mais se limitent aux deux enzymes clés mentionnées plus haut.

La SPS permet le couplage de l'UDP-glucose (produit grâce à l'UDP pyrophosphorylase) avec le fructose 6-phosphate. Arabidopsis contient quatre gènes exprimés relevant des trois familles de ces enzymes, et les données actuelles indiquent que toutes les SPS appartiennent à ces trois familles. On y trouve trois sites de phosphorylation ayant, chacun, sa fonction avec des pertes de certaines de ces sérines et subséquemment de fonction. Ainsi la famille inusuelle A* des monocotylédones et les deux SPS de la famille B des dicotylédones sont dépourvues de la sérine424 intervenant dans régulation osmotique.

Les phosphorylations sont surtout assurées, chez les dicotylédones par SnRK1 (apparentée à la kinase de levure Snf1 pour Sugar non fermenting). Une seconde kinase, CDPK (Calmodulin-like Domain Protein Kinase), peut également intervenir. SnRK1 phosphoryle les SPSs de la famille A des mono- et dicotylédones, tandis que les SPS de la famille B des monocotylédones et dicotylédones sont phosphorylés par des CDPKs.

En ce qui concerne la sucrose-phosphatase, on l'a recherché chez le maïs, le blé, la tomate et l'orge qui contiennent au moins deux gènes de SPP, tandis qu'Arabidopsis en a quatre et le riz trois.

17. L'amidon de l'albumen des céréales est utilisé par les granivores et l'homme, mais surtout, à la germination, par l'embryon des céréales lui-même. Il est présent, comme on le sait sous la forme d'amylose en principe linéaire, et d'amylopectine, en principe ramifiée. L'amylopectine est la forme la plus abondante dans l'albumen, avec des chaînes de longueurs variables. Les liaisons a1,6 assurant la ramification concernent environ 5% des glucoses. Ces ramifications ne sont pas aléatoires avec des régions à nombreuses ramifications et d'autres restant linéaires sur des distances relativement grandes ce qui permet un alignement d'a-hélices. Deux types de structures cristallines sont possibles, A et B, qui diffèrent par la symétrie et le compactage des chaînes d'amylopectine. Normalement les amidons naturels sont exclusivement du type A qui permet un contenu minimal en eau liée.

La revue de MG James et al.;Current Opinion in Plant Biology 6 (JUN03) 215-222, fait le point sur les diverses enzymes nécessaires à la synthèse de l'amidon, notamment sur les données récentes sur l'ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP), l'amidon synthase (SS), les enzymes ramifiantes (BE) et déramifiantes(DBE). Elle traite de leurs isoformes et des régulations de ces enzymes. Elle insiste sur le fait que la séquence du génome du riz va permettre une avancée substantielle dans ce domaine.

Comme indiqué plus haut, la synthèse de l'amidon est particulière dans l'albumen. alors que dans les autres tissus des organes de stockage des réserves, autres que l'albumen des céréales, ce sont les hexoses phosphates qui entrent dans le plaste et y sont convertis en ADP-glucose phosphate (ADPG). Cela a l'avantage de laisser ces hexoses phosphates libres pour une autre utilisation cytosolique éventuelle. Chez les céréales, on a une spécialisation, en excès de sucre, vers le stockage de l'amidon et l'on voit se superposer à la voie précédente une conversion cytoplasmique des hexoses phosphates (l'AGP est cytosolique à 85-95%) en ADPG. L'ADPG est dirigé vers les plastes via un transporteur, codé par le gène Brittle1 chez le maïs, où il alimente abondamment la synthèse de l'amidon. Ce mécanisme nécessite plusieurs isoformes des enzymes de la synthèse qui ne sont pas exprimées dans d'autres tissus. La structure de ces enzymes indique que les formes cytosoliques et plastidiales sont constituées de sous-unités différentes (l'AGP est constituée de deux grosses sous-unités et de deux petites). Comme l'indique l'exon 1, les petites sous-unités cytosoliques ont dû apparaître plusieurs fois au cours de l'évolution des céréales.

La régulation de l'AGP, positive par le 3-phosphoglycérate (3-PGA) et négative par le phosphate inorganique Pi, a une importance discutée. Elle semble importante comme l'indiquent des enzymes du maïs exprimées chez le blé, mais semble moins importante que dans la feuille, car l'enzyme de l'albumen est moins sensible au 3-PGA et au Pi. De plus l'AGP des céréales est beaucoup moins sensible au potentiel redox que celle du tubercule de la pomme de terre.

L'amidon synthase (SS) allonge les chaînes à partir de l'ADPG. L'albumen des céréales possède au moins cinq isoformes de l'enzyme. SSI (voir le §18) SSIIa, SSIIb et SSIII sont probablement uniquement vouées à la synthèse de l'amylopectine, sans qu'on ait démêlé leurs rôles respectifs. L'isoforme liée aux grains d'amidon, GBSSI, codée par le fameux locus Waxy (Wx) se consacre spécifiquement à la synthèse de l'amylose. Curieusement le dosage génique de Waxy n'est pas proportionnel à celui de l'amylose dans l'albumen. Il y a donc là des facteurs régulateurs non identifiés, peut être la présence de petits maltose-oligosaccharides comme amorce ou la disponibilité de l'ADPG comme substrat. Il existe bien deux GBSS chez le blé comme chez l'orge, mais la deuxième isoforme n'intervient apparemment pas dans l'albumen mais transitoirement dans le péricarpe (l'enveloppe du grain). Elle permet la synthèse des chaînes courtes (pas plus de 10 glucoses). SSII et/ou SSIII participent à l'élongation au-delà, et cela pourrait exiger la formation de ramifications.

Les enzymes ramifiantes ou BE greffent des chaînes en a1,4 après les avoir découpées ailleurs et en greffant les extrémités réductrices sur le carbone 6 d'un glucose. Il existe deux classes d'enzymes ramifiantes (BEI et BEII) qui diffèrent par la taille des chaînes transférées (mais in vitro). BEII transfère des chaînes plus courtes que BEI. Les céréales possèdent deux isoformes très voisines de BEII (BEIIa et BEIIb) BEIIb transfère des chaînes plus courtes que BEIIa. BEI et BEIIa sont exprimées dans l'albumen et d'autres tissus alors que BEIIb n'est exprimée que dans l'albumen et les tissus reproducteurs.

Le patron temporel de l'expression de ces isoformes est différent : BEIIa intervient au milieu du développement du grain de blé, tandis que BEI et BEIIb sont exprimées plus tard. Elles ont des fonctions différentes, comme l'indiquent les mutants. BEI permet le transfert de chaînes moyennes et longues et BEIIa ni BEIIb ne peuvent compenser ses défauts.

Les mutants de BEIIb du maïs et du riz ont été interprétés, dans le passé comme des surproducteurs d'amylose (amylose-extenders, ae). Mais on a récemment montré, chez le riz, qu'ils produisent en réalité des amylopectines avec des ramifications beaucoup plus longues, ce qui les a fait confondre avec de l'amylose.

De plus la mutation ae du riz cause une baisse de moitié de SSI en sus de l'élimination de l'activité de BEIIb, ce qui suggère que BEIIb et SSI interagissent. Les mutations de BEIIa chez le maïs et le riz indiquent que la perte de cette isoforme ne modifie pas la composition de l'amidon de l'albumen, ni la structure de l'amylopectine. Soit cette isoforme n'est pas indispensable soit il existe des compensations.

On a cherché à démêler tout cela chez la levure avec les trois BEs du maïs. Il semble que BEII intervient avant BEI sur les polymères précurseurs, mais n'a aucun effet sans la présence de BEIIa et BEIIb.

Le rôle des enzymes déramifiantes (DBEs) est plus curieux. Il existe deux familles de DBEs, l'une de type isoamylase (SU1 du maïs et ISA1 de l'orge) et l'autre du type pullulanase (comme ZPU1 du maïs) différant par leur spécificité de substrat. Les mutations su1 (sugary1) du maïs et du riz ainsi que les mutations isa-1 de l'orge portent sur des gènes d'isomylases et entraînent l'accumulation de phytoglycogène, un polysaccharide soluble. Les mutations su1 ont des effets pléïotropes (divers), notamment sur d'autres enzymes de la voie comme BEIIa. Ce qui est intéressant c'est que des formes enzymatiquement inactives de la protéine SU1 compensent ce défaut des mutants, ce qui indique un effet autre qu'enzymatique. De plus, une activité enzymatique très faible de SU1 suffit à produire des quantités quasi-normales d'amylopectine.

ZPU1 du maïs fonctionne comme une enzyme déramifiante lors de la germination, mais contribue à la synthèse d'amylopectine.

Le paragraphe sur les régulations est court, et il n'aurait pas pu être plus développé, tellement nos connaissances sont encore limitées. La kinase SPK, calcium dépendante, est nécessaire à l'accumulation d'amidon aux dépens du saccharose dans l'albumen de riz. Elle phosphoryle la sucrose synthase qui fournit le substrat de l'AGP (ADP-glucose pyrophosphorylase). L'amidon synthase SSIII est la cible de protéines 14-3-3. Je rappelle que les protéines 14-3-3 sont des protéines ubiquistes repérées initialement lors d'un inventaire des protéines cérébrales (c'est un numéro de catalogue). Elles jouent un rôle important dans la coordination de plusieurs activités biologiques. On a évoqué à plusieurs reprises les interactions entre protéines de la voie de synthèse de l'amidon, mais on est encore loin d'un modèle complet convaincant.

18. On trouvera également dans SG Ball et al.; Annual Review of Plant Biology 54 (JUN03) 207-233, une analyse comparative de cette voie avec celle du glycogène chez les bactéries, par des chercheurs du CNRS à Lille. Le glycogène est également un polysaccharide avec enchaînements a-1,4 ramifié en  a-1,6, avec 8–12% de ramifications. Elle fait apparaître que les plantes, avec leur système d'enzymes multiples avec très peu de recouvrements, ont un système nettement plus élaboré que celui de production du glycogène des bactéries qui ne comprend qu'une ADP-glucose pyrophosphorylase, une glycogène synthase, une glycogène phosphorylase et une enzyme déramifiante. Chez Escherichia coli, elles sont codées par deux opérons adjacents. A côté de cette voie principale tournent un certain nombre d'autres enzymes du métabolisme des malto-oligosaccharides.

Le glycogène est monté, chez les eucaryotes, à partir de l'UDP glucose, alors que la plupart des bactéries, y compris les cyanophycées (à l'origine des chloroplastes) le font à partir de l'ADP-glucose. L'amidon est utilisé uniquement par les plantes et leurs dérivés retournés à l'état non photosynthétique, comme les apicomplexes (trypanosomes et consorts) ou les Dinoflagellés. Ceci justifie la comparaison entre synthèses du glycogène des cyanophycées et de l'amidon des plantes.

La revue couvre non seulement la synthèse de l'amidon chez les céréales, mais également chez les autres plantes.

Dans les tissus ne présentant pas une ADPglucose pyrophosphorylase (AGP) cytosolique, le glucose-6-phosphate est transporté dans l'amyloplaste, où il est converti en glucose-1-phosphate grâce à la phosphoglucomutase qui alimente l'AGP plastidiale. La présence de deux AGPs, l'une cytosolique et insensible à une activation, et une plastidiale sensible à une activation peut être interprétée comme le besoin, d'une part d'assurer une synthèse massive de l'amidon dans l'albumen des céréales et, d'autre part une synthèse régulée, couplée à la photosynthèse dans les feuilles.

Les auteurs soulignent également, que les flambées de transcription ne sont pas une indication suffisante, car elle en ne sont pas forcément suivies par une montée de l'activité enzymatique.

Il existe des amidons particuliers comme l'amidon dits "floridéen" des rhodophycées (algues rouges) et leurs parents, dont on ne sait pas trop bien de quel substrat la synthèse part (ADP-glucose, UDP-glucose ou autres).

Cette revue insiste un peu plus que la précédente sur l'assemblage de la structure du grain d'amidon et sur le rôle de la GBSS1. En ce qui concerne l'amidon synthase I, on n'a jamais pu obtenir de mutants (soit effet létal, soit effet si minime qu'on en rate le phénotype lors des criblages) et son rôle est donc difficile à établir alors qu'elle est abondamment exprimée dans l'albumen des céréales. Chez le blé et le riz, elle est modifiée, pour une partie des molécules, en une forme de 55 kDa sans que l'on sache bien quelle en est la signification.

La mutation rug5 du pois concerne l'unique SSII et conduit à la diminution relative des ramifications de longueurs intermédiaires de l'amylopectine. On ne connait pas de mutations de SSIIb des céréales et on n'y a même pas identifié l'enzyme.

Les auteurs insistent sur les enzymes de ramification et déramifications dans la synthèse de l'amidon.

19. Les fructanes ont suscité l'intérêt des industriels du fait de leurs utilisations dans les "aliments fonctionnels". Inassimilables par l'homme, ils participent au bien-être de bactéries affectueuses comme les bifidobactéries (voir le §101). Ce sont donc des prébiotiques. On les retrouve dans de nombreuses plantes consommées comme le blé, l'oignon, l'ail, la banane, l'asperge ou l'artichaut. Des découvertes récentes permettent de mieux comprendre leur métabolisme avec le clonage des gènes de fructosyltransférases et de fructanes exohydrolases. On espère ainsi modeler les fructanes naturels. Ils participent également à la tolérance au froid et à la sécheresse.

Leur synthèse a lieu en présence d'une abondance de saccharose, car ce sont des polymères de fructose dérivant du saccharose. Leur hydrolyse a lieu lors de la croissance des plantes après défoliation, par exemple.

Le saccharose est, comme on le sait, un disaccharide de glucose et fructose et c'est le produit terminal de la fixation du carbone lors de la photosynthèse.

Les plantes produisant des fructanes comme l'inuline sont présentes dans des familles diverses et non liées phylogénétiquement, ce qui suggère une convergence évolutive. L'arbre phylogénétique des fructosyltransférases de la synthèse, des fructanes exohydrolases de l'hydrolyse, et des invertases hydrolysant le saccharose, montre qu'elles sont souvent plus proches entre elles, dans une famille, que les enzymes qui catalysent des réactions de même type appartenant à des plantes de différentes espèces ou familles. Les fructosyltransférases ont probablement évolué à partir des invertases vacuolaires, tandis que les fructanes exohydrolases sont plus apparentées aux invertases pariétales. Une revue sur ces polymères est parue avec T Ritsema et al.; Current Opinion in Plant Biology 6 (JUN03) 223-230.

La revue décrit les différents fructanes connus. L'inuline est un fructane linéaire simple avec des fructoses liés en b(1-2). Elle est présente dans les Astérales comme le topinambour, la chicorée ou les artichauts. Chez les Liliacées comme l'oignon ou le poireau c'est une néo-inuline qui est présente avec deux chaînes b(1-2) de fructoses greffées sur le saccharose amorce. L'une est greffée sur le C1 du fructose (comme dans le cas de l'inuline et l'autre sur le C6 du glucose.

Les fructanes de type levane (souvent appelés phléines) sont observés chez les Poacées. Ce sont des chaînes linéaires de fructoses liés en b(2-6) et greffées sur le fructose du saccharose. Les graminanes sont des chaînes mixtes avec des liaisons b(2-6) et des ramifications b(1-2).Le polymère est parfois rendu plus complexe par l'incorporation de néo-sucres comme dans le cas de l'avoine et des ray grass (Lolium).

La raison de la multiplicité des structures de fructanes est inconnue. Certaines plantes produisent simultanément fructanes et amidon. Chez les graminées, les fructanes sont surtout stockés à la base des feuilles et permettent la croissance réparatrice des feuilles après le passage d'un herbivore, alors que l'amidon est surtout stocké dans les feuilles. L'amidon est stocké dans des plastes spéciaux (amyloplastes) tandis que les fructanes le sont dans les vacuoles.

La synthèse des fructanes commence avec la conversion du saccharose en 1-kestose, (un trisaccharide) grâce à une sucrose:sucrose 1-fructosyltransférase (1-SST).Des fructosyltransférases particulières à chaque espèce allongent le 1-kestose en donnant le spectre des fructanes observé.

1-SST et fructane:fructane 1-fructosyltransférase (1-FFT) ont été isolées de composées avec la 1-SST synthétisant le trisaccharide 1-kestose. 1-FFT a pour substrat le 1-kestose ou des fructanes plus longs. La 1-FFT de l'artichaut donne des chaînes plus longues que celle du topinambour. On vient, cependant, de caractériser un 1-FFT chez l'asperge, qui 'est pas un composée comme on le sait

La synthèse des néo-inulines des liliacées nécessite une fructane:fructane 6G-fructosyltransferase (6G-FFT). Elle permet la formation du trisaccharide néokestose, avec un second fructose lié au glucose du saccharose amorce.

L'accumulation de fructanes chez les graminées est corrélée avec la transcription d'au moins deux gènes de fructosyltransférases. Mais les mécanismes d'induction ne sont pas connus. Il existe manifestement des régulations post-transcriptionnelle avec des épissages alternatifs. Ainsi les invertases possèdent un exon correspondant à seulement trois aminoacides. Lors d'un stress par le froid, cet exon est évité donnant une invertase délétée de ces trois aminoacides. On retrouve cet exon dans le gène de fructosyltransférase du ray grass Lolium perenne.

20. Les brassinostéroïdes (BRs) sont des hormones stéroïdes végétales. Une revue sur la synthèse et le métabolisme de ces molécules est parue dans S Fujioka et al.; Annual Review of Plant Biology 54 (JUN03) 137-164.

Elle porte essentiellement sur le brassinolide, un BR en C28. Les auteurs montre que deux voies d'oxydation en C-6 divergeant au niveau du campestanol et débouchant sur la castastérone et ensuite directement sur le brassinolide. sont connectées à plusieurs étapes (voie réticulée) et reliées au début de la voie précoce d'oxydation en C-22 ou le campestérol est oxydé à cette position dès le début et qui va rejoindre la voie d'oxydation précoce en C-6 plus en aval.

La synthèse des BRs en C27 suit les mêmes voies. La lecture de cette revue est relativement ardue, mais elle me paraît très complète.

Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense

21. Les champignons, mais aussi les oomycètes, présentent dans plusieurs cas, de petits chromosomes surnuméraires de tailles et nombre variables. On ne peut les détecter qu'en électrophorèse en champ pulsé, car ils sont trop petits pour être détectés optiquement. Ils sont hérités de façon non mendélienne et sont remaniés en permanence par des recombinaisons ectopiques durant et après la méiose. Les populations de Magnaporthe grisea sont génétiquement fermées, mais interfertiles et infectent Oryza sativa (le riz), Setaria italica (le millet italien), Panicum miliaceum (millet commun), Eleusine coracana (millet africain) et Triticum aestivum (le blé).Certains ont regroupé ces populations sous le nom de M.oryzae. Ces minichromosomes sont observés chez la plupart des souches du riz et de Setaria italica. Un article analyse les mécanismes de remaniement de ces minichromosomes chez S.italica et suggèrent une origine liée à des recombinaisons ectopiques. I Chuma et al.; Current Genetics 43, n°3 (JUN03) 191-198.

 

22. On trouvera dans GB Martin et al.; Annual Review of Plant Biology 54 (JUN03) 23-61 une revue qui traite des différents types de protéines de résistance (protéines R) chez les plantes. Celles-ci détectent la présence de molécules effectrices indispensables à l'invasion par le pathogène et commandent les mécanismes de résistance. Ces protéines ont vraisemblablement évolué pour inactiver ou dévoyer les mécanismes cellulaires en faveur du pathogène. On connaît cinq classes de protéines R. Leur séquence indique un double rôle de reconnaissance et de déclenchement de signaux intracellulaires (un peu comme des récepteurs membranaires).La revue traite des motifs de la protéine impliqués dans la reconnaissance des pathogènes, et en particulier des cas intéressants de multi-spécificité (cas de RPM1 qui reconnaît AvrB et AvrRpm1, par exemple, ou Pto avec AvrPto et AvrPtoB).

Elle envisage également les fonctions des protéines R au sein de complexes. Certaines d'entre elles jouent, effectivement, ce rôle, mais beaucoup n'interviennent qu'indirectement. L'activité de ces protéines requiert des phosphorylations (voir le §) et une localisation adéquate dans la cellule, ainsi que des dégradations. Certains des composants des cascades de signaux sont partagés par plusieurs voies, alors que d'autres sont spécifiques d'une voie donnée. La revue traite des cas où ces voies ont également une fonction dans une plante saine. C'est le cas de la protéine TIP49a d'Arabidopsis qui interagit avec les protéines RPM1 et RPP5 et qui est homologue de protéines reconnaissant la "TATA box" intervenant dans la transcription, et module des voies signalisatrices variées. TIP49a est un régulateur négatif des voies de résistance RPP2 et RPP5. Elle est, par ailleurs, impliquée dans l'établissement des méristèmes et dans la viabilité des organes reproducteurs femelles. Ceci entraîne des difficultés pour identifier les mutants de résistance et donc l'analyse de celles-ci.

23. La fonction de la protéine RIN4 d'Arabidopsis n'est pas connue, car des mutations n'ont guère de phénotype perceptible. Ce qui est intéressant c'est que l'on vient de montrer que cette protéine est modifiée par Pseudomonas syringae et c'est cette modification (probablement une phosphorylation) qui est perçue comme alerte par au moins deux autres protéines de la plante (RPM1 et RPS2) qui déclenchent les défenses. Une mise au point, basée sur les articles de MJ Axtell et al.; Cell 112 (07FEB03) 369-377 du groupe de StaskawiczMackey et al.;p.379-389 et D Mackey et al.; Cell 108 (22MAR02) 743-754, de celui de Dangl, est parue avec J Ellis et al.; Current Biology 13 (13MAY03) R400-R402.

RPM1, RIN4 et RPS2 font partie d'un complexe pas encore complètement disséqué. RPS2 et RPM1 sont localisées à la périphérie de la cellule sans être insérées dans la membrane. Le complexe AvrRPM1/AvrB (ces deux protéines injectées par le pathogène grâce à un système de sécrétion classique de type III) induisent la résistance caractérisée par la protéine RPM1 et interagissent directement avec RIN4 entraînant sa phosphorylation et déclenchant ainsi le signal d'alerte par RPM1. RIN4, AvrB et AvrRpm1 forment un complexe dans la plante. Ce ne sont cependant pas des kinases, ce qui fait que la phosphorylation est encore mise en doute. Comme RPM1 est dégradée très précocement lors de la reconnaissance du pathogène c'est probablement cette réponse plutôt que la perte de RIN4 qui cause la dégradation de RPM1.

L'interaction RIN4–AvrB n'affecte pas RPS2, associée à AvrB. Dans le cas d'AvrRpt2 qui induit la résistance, cette fois par RPS2, la protéine AvrRpt2 entraîne la dégradation de RIN4 et déclenche les défenses commandées par RPS2.

 RIN4 est manifestement un régulateur négatif de l'activité mortifère de RPS2 et l'apoptose est déclenchée quand le niveau de RIN4 baisse.

24. Une revue de JE Parker; Trends in Plant Science 8 (JUN03) 245-247, compare le système d'immunité innée des animaux à certaines défenses des plantes. Je rappelle que ces défenses innées non spécifiques permettent de reconnaître, a priori, des motifs généraux à la surface des pathogènes, plutôt que des motifs spécifiques d'un pathogène donné. L'existence de mutants de plantes "immunodéprimées" indique l'existence possible de telles reconnaissances larges. Plusieurs motifs moléculaires perçus comme dangereux par les animaux, comme les lipopolysaccharides ou des fragments des flagellines bactériennes, constituent, comme chez les animaux,de puissants éliciteurs des défenses chez les plantes.

Un composant essentiel de la perception du fragment Flg22 de la flagelline, FLS2 d'Arabidopsis, est une kinase Receptor-Like (RLK) à domaine récepteur extra-cellulaire porteur de répétitions riches en leucines (LRR), et un domaine cytoplasmique sérine–thréonine kinase. FLS2 ressemble au récepteur Toll-Like 5 (TLR5, voir le § ProdAn.), mais aussi aux protéines R de résistance spécifique comme Xa21 du riz, ainsi qu'aux protéines RLKs de plantes surveillant les signaux hormonaux et de symbiose. On devrait en trouver d'autres.

On peut, d'ailleurs, lire une autre revue plus ancienne de T Nurnberger et al.; Current Opinion in Plant Biology 5 (AUG02) 318-324 qui aborde également ce sujet (discuté dans le Bulletin d'Octobre-Novembre 2002 §23). La revue discute, en effet, une publication du groupe de Halle (F Brunner et al.; The EMBO Journal 21 (16DEC02) 6681–6688) où les auteurs place dans ces motifs généraux un des éliciteurs classiques Pep-13 de Phytophthora sojae. C'est un fragment interne de la glycoprotéine de paroi GP42 qui est un motif présent dans les transglutaminases Ca2+-dépendantes de tous les Phytophtora. Ces transglutaminases ne ressemblent à aucune autre, et le motif en fait un indicateur de Phytophtora, car elles ne se retrouvent chez aucune plante, ni chez les Peronospora, ni chez les Pythium. Ce motif est situé sur une boucle à la surface de la molécule et serait donc facilement reconnaissable par un récepteur. Ce qui est intéressant est que toute mutation de ce motif entraîne une suppression de la fonction enzymatique ce qui explique sa stabilité et, par conséquent, sa validité dans un grand nombre de Phytophtora. Il est, en particulier, reconnu par la pomme de terre dans Phytophtora infestans.

25. On trouvera dans BM Tyler; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 137-167, une revue sur la reconnaissance, au niveau moléculaire, des Phytophtora par leurs hôtes et vice versa. Il n'y a, pour l'instant, aucune étude un tant soit peu exhaustive des échanges de signaux et des cascades en aval.

Les Phytophthora comme les Pythium, Peronospora, Plasmopara sont des oomycètes, distincts des champignons et plutôt voisins des algues brunes et des diatomées au sein des Straménopiles. Les 60 espèces de Phytophtora sont toutes des pathogènes d'un grand nombre de plantes. Ils reconnaissent leurs hôtes et les déplacements de leurs zoospores sont orientés.

P. cinnamomi, P. parasitica (alias P. nicotianae) et P. cactorum attaquent des centaines d'espèces de plantes. D'autres comme P.sojae (alias Phytophthora megasperma f.sp. glycinea) et P.infestans ont, au contraire un spectre d'hôte très réduit. Ce dernier ayant été la cause de la famine irlandaise du 19° siècle, et il est à nouveau préoccupant.

P.sojae continue, lui, à être une préoccupation dans toutes les régions de culture du soja.

Les Phytophthora pousse sur la forme de cœnocytes hétérotrophes et saprophytes. Les zoospores aquatiques se déplacent avec deux flagelles et sont donc facilement dispersées par une irrigation un peu trop poussée. Elles ne vivent que quelques heures et donnent des cystes adhésifs qui germent pour donner des hyphes.

Les zoospores peuvent subir plusieurs réincarnations avec formations de sporanges puis libération de zoospores secondaires. Ceci leur laisse le temps de trouver un hôte en se guidant sur des molécules émises par ce dernier. Phytophthora comme Pythium reconnaissent des attracteurs peu spécifiques comme les acides aminés, etc… mais aussi l'éthanol émis par les racines en anaérobiose, conditions dans lesquelles elles se trouvent en sol saturé d'eau nécessaire au déplacement des zoospores. Cette faible spécificité est valable pour beaucoup de ces oomycètes, mais pas pour les spécialistes. Ainsi ce sont les isovaléraldéhyde, valéraldéhyde et ante-isovaléaldéhyde qui sont de forts chimioattractants pour les zoospores de P. palmivora.

Le cas le mieux analysé est celui des zoospores de P.sojae attirés par les isoflavones bien connues daidzéine et génistéine qui sont présents dans les graines de soja et exsudées par les racines et qui sont attractives jusqu'à moins de 1 nM. On a pu montrer que la méthylation du 4'-hydroxy trouvées chez beaucoup d'autres légumineuses diminue fortement l'attraction pour les zoospores de P.sojae. une autre chimioattraction intéressante est celles des zoospores vers les zoospores déja enkystées , c'est-à-dire vers un lieu déjà reconnu comme confortable.

Une autre attraction est électrique car les zoospores sont sensibles à des gradients de l'ordre de 0,5V/m. On dit que c'est une façon de distinguer les racines vivantes de celles qui sont mortes.

Il existe également un tropisme des hyphes après germination des kystes. Mais c'est surtout un thigmotropisme qui attire les hyphes qui adhèrent à la surface végétale et pénètrent entre les cellules. Aussitôt après le franchissement, la tendance s'inverse, et les hyphes fuient l'adhérence, éventuellement contre un gradient d'isoflavones attractives.

Une seconde partie de la revue envisage l'aspect plus classique de la reconnaissance de l'agresseur par la plante avec les gènes R de la plante et avr du pathogène.

26. La lutte contre les nématodes phytopathogènes n'est pas facile depuis l'interdiction d'un certain nombre de substances nématicides de synthèse comme les carbamates et organophosphorés. La recherche de nouveaux nématicides acceptables ne séduit pas beaucoup les industriels à cause des coûts non seulement de la découverte, mais encore celle des essais réglementaires de sécurité des produits. On recherche donc des substances naturelles actives issues des plantes. On en a évidemment trouvé pas mal, les plantes ayant eu à lutter contre ces pestes depuis fort longtemps. Ce sont des polythienyls, isothiocyanates, glucosinolates, glucosides cyanogènes, polyacétylènes, alcaloïdes, lipides, divers terpénoïdes, quassinoïdes, stéroïdes, substances phénoliques, etc… Mais, pour l'instant, tout ceci est antiéconomique. Il est clair que toutes ces substances phytochimiques sont probablement moins toxiques pour l'homme, mais certainement pas toutes, ce qui va également nécessiter des essais, même si on est plus tolérant pour ces substances que pour des molécules entièrement artificielles.

Il reste donc les pratiques agricoles couplées à l'utilisation des quelques résistances naturelles connues. Une des pratiques agricoles les plus favorables aux ennemis des nématodes est l'adjonction d'engrais végétaux pour améliorer la structure du sol. La recherche de substances nématotoxiques ou qui leur sont désagréables est largement pratiquée, mais de façon relativement empirique. Les produits sont tellement éphémères que l'on n'a même pas le temps d'évaluer leur efficacité. Un exemple de cocktail empirique commercialisé est celui de la Sincocin™ d'AgriScience composé d'extraits d'Opuntia, Quercus falcata, Rhus aromatica(un des sumacs, anacardiacée) et Rhizophora mangle (le palétuvier des mangroves). Une revue sur de type de lutte par des substances d'origine végétale est parue avec DJ Chitwood; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 221-249. Elle est consacrée, non seulement aux produits nématicides issus de plantes, mais encore des champignons

27. On a admis longtemps que la systémine est le message envoyé dans toute la plante après une agression par un herbivore, signal qui provoque la production d'inhibiteurs de protéases. C'est un peptide de 18 amino-acides issu d'un clivage du précurseur prosystémine, et diffusé dans la plante par le phloème. La systémine est perçue par le récepteur kinase à répétitions riches en leucines (LRR) SR160 de Lycopersicum peruvianum introgressé par la sélection classique chez la tomate cultivée (voir J Scheer et al.;Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (09JUL02) 9585–9590). Le récepteur serait d'ailleurs bien le même que celui des brassinostéroïdes (BRI1), comme l'indiquent T Montoya et al.; The Plant Cell 14 (DEC02) 3163-3176 et M Szekeres; Trends Plant Sciences 8( (MAR03) 102-104.

Des publications de l'an passé analysées dans la revue de JW Stratmann; Trends in Plant Science 8 (JUN03) 247-250, et basées sur les résultats de greffes diverses, montrent que la systémine est bien impliquée, mais comme signal à courte distance, contrairement à l'acide jasmonique qui opère à longues distances. La systémine interviendrait dans la transmission du signal jasmonique dans les feuilles indemnes.

28. La sous-unité b d'une protéine G hétérotrimérique (impliquée dans la transmission de signaux) de Fusarium oxysporum régule, comme FGA1, le développement et la pathogénicité de ce champignon, comme on l'avait déjà montré chez Cryphonectria parasitica. Le gène en a été cloné et sa fonction vérifiée par S Jain et al.; Current Genetics 423 (MAY03) 79-86. Ces complexes comportent trois sous-unités a,b et g, a liant le GDP avec une forte affinité, tandis que bg stabilise le complexe. La dissociation du complexe libère bg qui interagissent avec divers effecteurs.

29. Seule la synthèse de trichothécène (désoxyvalénol) est associée, jusqu'à présent, à la pathogénicité sur blé de Fusarium graminearum. Ce champignon infecte l'épillet du blé et détruit les anthères durant la courte période entre floraison et début du remplissage des grains. De plus la production du tricothécène polluent les grains qui survivent et les rend inaptes à la commercialisation. Le gène de la trichodiène synthase qui catalyse la première réaction dédiée de la voie a été interrompu, ce qui réduit fortement la virulence du champignon. NJ Jenczmionka et al.; Current Genetics 423 (MAY03) 87-95. Les réactions de la plante à une infection, lorsque le pathogène est reconnu, dépendent de cascades de signaux faisant, notamment, intervenir des MAP kinases (Mitogen-Activated Protein kinases). Les MAP kinases fongiques ont des fonctions régulatrices depuis la conidiation (formation des spores de dissémination), la formation des appressoria ou autres organes de pénétration des téguments végétaux, la croissance invasive des hyphes et la régulation de leur turgescence. Les MAP kinases jouent également un rôle important dans la régulation de l'appariement sexuel. Le gène de l'une de ces MAP kinases, Gpmk1 de Fusarium graminearum a été cloné. Son interruption abolit la virulence, diminue la sporulation et empêche la reproduction sexuée.

30. Les antibiotiques les plus utilisés sur les plantes aux Etats-Unis sont l'oxytétracycline et la streptomycine. On utilise les antibiotiques pour soigner les plantes depuis 45 ans. Aux Etats-Unis, toujours, 25% des pommes, 40% des poires et 8% des pêches sont protégées par ce moyen. C'est l'usage principal des antibiotiques dans ce domaine. Cela ne constitue, cependant, que 0.5% de l'utilisation totale des antibiotiques (on a utilisé 8,7 tonnes de streptomycine et 7,5 tonnes d'oxytétracycline en 1997). La résistance à l'oxytétracycline est rare, mais si la streptomycine tue les bactéries sensibles, l'oxytétracycline n'est qu'un bactériostatique sur E. amylovora, et on la complémente par de la gentamicine au Mexique sur poiriers et pommiers et en Amérique Latine sur produits maraîchers.

Par contre des résistances à la streptomycine sont apparues chez Erwinia amylovora, Pseudomonas spp. et Xanthomonas campestris dès 1990, et on utilise donc, sur "feu" bactérien, une quinolone, l'acide oxolinique en Israel. Ces résistances se développent à la suite de transferts génétiques, mais par des éléments qui ne sont pas communs avec ceux des mêmes résistances chez les animaux. Cela n'empêche pas un débat sur leur utilisation, notamment sur les incidences sur la santé humaine de l'usage en agriculture..

Leur utilisation a été préconisée dans les années 50, car ils ne nécessitent que de faibles doses et sans toxicité, contrairement aux bactéricides minéraux comme le cuivre . C'était surtout contre divers pathogènes bactériens maraîchers et contre le "feu" des poiriers et pommiers. Mais, comme pour les pathogènes humains, les résistances à la streptomycine mais aussi au cuivre ont montré les limites de ces deux types de lutte. Mais le feu bactérien a obligé à revenir à l'usage des antibiotiques en attendant que la génétique veuille bien fournir des variétés résistantes sans trop détruire la diversité indispensable de ces fruits. Une revue sur le sujet est parue avec PS McManus et al.; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 443-465.

31. Closterovirus et Ampelovirus ont des génomes monopartites transmis par des pucerons pseudococcidés (mealy bugs), tandis que les Crinivirus (jaunisse infectieuse de la laitue par exemple) sont bipartites et transmis par des aleurodes (Whiteflies).

Le Citrus tristeza virus (CTV) des agrumes est un Closterovirus transmis par les greffes et par les aphides et qui peut persister aussi longtemps que l'arbre qu'il infecte (parfois une centaine d'années). Ce virus possède des formes défectives dont la plupart sont courtes (2–5 kb) avec des extrémités conservées encadrant de grandes délétions. On trouve quelques formes plus longues (~12 kb) retenant quelques ORFs et ressemblant beaucoup au RNA1 des Crinivirus. On vient de montrer qu'il existe également des formes analogues au RNA2 de ces virus avec une dizaine d'ORFs aval du génome. X Che et al.; Virology 310 (05JUN03) 298-309. Ces formes sont issues d'un recombinaison ARN, mécanisme qui n'est connu que depuis une vingtaine d'années. On comprend donc mieux l'origine des formes mono et bipartites.

Les Plantes recombinantes

32. Une revue sur l'utilisation des plantes pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques grâce des vecteurs viraux est publiée par des chercheurs de Large Scale Biology: GP Pogue et al.; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 45-74.

Les systèmes eucaryotes de production de telles protéines recombinantes sont préférés aux procaryotiques pour des raisons de modifications post-transcriptionnelles plus adaptées à leur usage. On utilise actuellement des lignées de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) d'insectes ou des levures.

Le coût de fonctionnement de ces bioréacteurs pousse à des recherches d'économies dont les plantes peuvent profiter, à côté des animaux transgéniques actuellement en lice. Cela crée de nouvelles contraintes qui doivent être envisagées.

Il existe deux stratégies dans ce domaine avec, soit des plantes transgéniques, soit des expressions transitoires avec des vecteurs viraux. Les auteurs s'intéressent plus spécialement aux vecteurs viraux à ARN (+), c'est-à-dire directement codant.

La production de plantes transgéniques nécessite une longue période de mise au point de semences génétiquement stables et débarrassées des problèmes de "silencing" et se prêtant facilement à un confinement génétique.

On sait, par contre, facilement obtenir une très forte expression, difficile à obtenir avec des plantes transgéniques, avec une infection virale. Le montage des vecteurs est l'affaire de quelques semaines seulement. Les méthodes d'extraction ("illustrées" par les auteurs par deux brevets qui n'ont que peu de choses à voir avec le sujet, mais qui sont ceux de leur firme) sont déjà assez largement diversifiées, mais on doit garantir l'absence de contaminations par des molécules toxiques de la plante.

Les premiers vecteurs étaient des vecteurs à remplacements. Le transgène souhaité remplace un gène viral, de sorte que, ou bien il ne peut même pas passer d'une cellule à l'autre, du fait du remplacement de la protéine de capside [cas de bromovirus avec remplacement de la protéine de capside (CP)], soit il ne pouvaient se disséminer dans la plante, cas du même montage avec le virus de la mosaïque du tabac (TMV).

On est rapidement passé à des vecteurs d'addition aux gènes normaux, ou de fusion avec l'une des protéines virales. On prend alors la précaution d'ajouter une séquence permettant le clivage ultérieur de la protéine de fusion. On a ainsi créé des vecteurs à partir des poty- et clostérovirus où on insère le transgène dans la séquence de la polyprotéine virale.

De tels virus nécessitent souvent, de par leur nature, des promoteurs subgénomiques (le virus (+) doit se répliquer en formes subgénomiques) qui sont autant d'occasion d'excision par recombinaison, ce qui crée une instabilité (qui peut être souhaitée pour des raisons de sécurité génétique). Une autre source d'instabilité est la simple charge par un transgène qui cause un handicap pour la réplication des séquences plus longues du fait de l'insertion du transgène (un ajout de 200 nucléotides est déja perceptible de ce point de vue).

Les vecteurs utilisés ont, chacun, leurs contraintes. Ainsi les virus en bâtonnets comme le TMV sont plus tolérants pour la taille de l'insert qu'un virus sphérique (icosaédrique) pour des raisons stériques faciles à comprendre.

Les virus utilisés cités dans la littérature sont le TMV, le virus X de la pomme de terre, le Plum Pox virus, le Zucchini Yellow Mosaic Virus, le Clover Yellow Vein Virus ainsi que le Tobacco Etch Virus.

Il est évident que la production de vaccins oraux est envisagée dans de nombreuses équipes et ce Bulletin en a fait état (voir, par exemple, la revue de A Mercenier et al.; Current Opinion in Biotechnology 12 (OCT01) 510 515). Cette production aboutit, soit à un antigène libre, soit une protéine de fusion avec la protéine de capside. Mais certains peptides de fusion sont très mal tolérés par la plante. D'autres ont peu d'effet sur la plante, mais entraînent des malformations de la protéine de capside qui handicape l'effet amplificateur indispensable du virus vecteur. Une astuce intéressante pour tourner cette dernière difficulté est d'utiliser des codons stop "leaky" entraînant des proportions variables de protéine de fusion et de protéine de capside en bonne et due forme. D'ailleurs des capsides mosaïques sont fortement immunogènes, ce qui est un plus. D'une façon générale, et c'est également valable pour les immunogènes solubles issus de plantes, les agrégats relativement impurs sont plus efficaces que les immunogènes purs.

Les exigences d'une production dans les plantes sont analysées par les auteurs. Ils mentionne la stabilité du transgène évoquée plus haut. Cette stabilité doit être maintenue dans les stocks importants de virus recombinant indispensables à la production dans les plantes. Or les virus à ARN sont congénitalement mutateurs n'ayant, apparemment, pas de systèmes de vérification des copies. On constate, cependant, que des passages successifs dans des plantes ne modifient pas substantiellement les séquences non virales. Il faut, également, que l'expression résiste aux stress inévitablement subis par la culture et aux défenses de la plante qui n'aime pas les ARNs doubles-brins.

Les plantes choisies dépendent de la compétence de la compagnie qui veut les utiliser. Une plante très favorable, car elle est très sensible à toutes sortes de virus, est Nicotiana benthamiana. Malheureusement, revers de la médaille, c'est une plante tellement sensible à toutes les agressions qu'il faut la cultiver en serres. Les génotypes des plantes inoculées doivent être sélectionnés pour une utilisation donnée, mais ces données ne se retrouveront pas de sitôt dans une publication.

L'inoculation à la main des plantes productrices est faisable jusqu'à 1000 pieds, mais au-delà il faut mécaniser l'opération. Large Scale Biology utilise une injection sous pression. Un hectare peut être inoculé à 90% par six personnes en une heure avec des injecteurs multiples sur tracteur.

 Les problèmes de sécurité pour une utilisation orale doivent prendre en compte le fait que le virus, mais également le transgène peuvent modifier le métabolisme de la plante.

Les Insectes et leur Maîtrise

 

33. Des chercheurs de Leuven ont comparé les transcrits du cerveau du criquet migrateur dans ses phases solitaire et grégaire pour rechercher les expressions différentielles. Ils ont, pour l'instant, détecté 8 bandes différentes entre les deux formes physiologiques de l'insecte et caractérisé un gène de phase solitaire et un autre de phase grégaire, mais c'est encore bien sommaire car on connait déja trois facteurs intervenant dont un lié aux œufs, une phéromone dans le sol entourant les œufs (peut-être le même) et le peptide [His7]-corazonine du cerveau. MM Rahman et al.; Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology 135 (JUN03) 221-228.

34. Les abeilles halictines présentent un comportement social très labile. Cela va de femelles socialement égales qui peuvent ne pas être apparentées (mais de la même génération) vivant simplement en communauté, à des insectes hémisociales ou eusociales avec des reines et des ouvrières plus ou moins stériles. Il existe par ailleurs des formes parfaitement solitaires. Ce qui est intéressant c'est qu'il y a, dans une même espèce, une antinomie entre organisation eusociale et en communauté, qui relèvent du genre ou du sous-genre. Halictus sexcinctus, une espèce grecque, contient, cependant, des colonies des deux types. Les colonies des deux types ont, par ailleurs, des différences morphologiques ce qui indique que la différence est déjà acquise au stade préimaginal. L'analyse d'une séquence mitochondriale indique que ce polymorphisme est une étape intermédiaire instable d'une réversion de l'état social vers un état solitaire. MH Richards et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 7175-7180.

Les Biopesticides

 

35. La scarabécine isolée de l'hémolymphe du scarabée du cocotier Oryctes rhinoceros est un petit peptide antifongique de 36 acides aminés qui se lie à la chitine. Il est actif sur de nombreux champignons phytopathogènes. On vient de montrer que le motif responsable de cette fonction est différent de celui de nombreuses autres protéines liant la chitine, même si les motifs structuraux généraux sont semblables à ceux de la tachycitine du Limule et à l'hévéine des végétaux. C'est peut-être un nouveau type de telles protéines qu'on trouve chez les Coléoptères, et un exemple d'évolution convergente. H Hemmi et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (20JUN03) 22820-22827.

36. Une souche de Pseudomonas aeruginosa appelée NJ-15, présente des caractéristiques biopesticides. Elle est plus ou moins active sur divers champignons phytopathogènes. Ses produits actifs sont des sidérophores et l'acide cyanhydrique, ainsi que de l'acide indolacétique via la voie du tryptophane. N Bano et al.; Current Microbiology 46, n°5 (2003) 324-328. Je ne suis pas sûr que la bactérie et ses métabolites secondaires en fassent un biopesticide facile à autoriser.

37. Les chercheurs d'Applied Plant Research de Lelystad étudient le nématode Phasmarhabditis hermaphrodita pour lutter contre la limace Deroceras reticulatum qui ravage les champs d'asperges, dégâts ayant surtout lieu entre April et Mai. Le traitement est commercialisé sous le nom de Nemaslug™, depuis 1994 en Grande-Bretagne. L'adjonction d'eau salée améliore les effets. Un traitement en trois fois est le plus efficace. A Ester et al.; Crop Protection 22 (JUN03) 689-695. La toxicité de ce nématode est surtout due à des bactéries associées.

Moraxella osloensis est une des bactéries associées de façon mutualiste à Phasmarhabditis hermaphrodita. On vient de montrer que M.osloensis produit un lipopolysaccharide (LPS) létal pour Deroceras reticulatum lorsqu'il est injecté (mais pas par simple contact, ce qui exclue de l'utiliser par aspersion). La toxicité réside dans la partie lipidique. La coinjection de galactosamine accroît la toxicité. Cette sensibilisation est annulée par de l'uridine. Mais Moraxella osloensis est un pathogène opportuniste humain. L Tan et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3646-3649.

38. On sait que les plantes attaquées par des chenilles libèrent des substances volatiles qui résultent de l'action d'enzymes salivaires sur les composants de la feuille. Ces éliciteurs attirent les parasitoïdes de ces chenilles.

Les plus courants sont des amides d'acides gras poly-insaturés à 18 carbones couplés à de la glutamine. C'est le cas de la N-linolenoyl-L-glutamine (mais aussi N-linolenoyl-L-glutamate) qui est, avec d'autres éliciteurs, un analogue structural de la volicitine (voir le Bulletin de Septembre 2002 §23). Cette conversion par des enzymes membranaires de Manduca sexta a été analysée. CG Lait et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 7027–7032.

39. On trouvera dans WJ Janisiewicz et al.; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 411-441, une revue sur la maîtrise par voie biologique des maladies post-récolte des fruits. La lutte par fongicide a rapidement été limitée par l'apparition de résistances et la méfiance des consommateurs. Mais, malgré les progrès dans les conditions de stockage, et l'amélioration génétique de la résistance des fruits, les pertes sont encore de 5 à 20% dans les pays développés et de 50% dans les pays "en développement". Il faudrait descendre au-dessous de 5%.

Les premiers biopesticides autorisés et commercialisés existent depuis quelques années aux Etats-Unis avec Aspire™ d'Ecogen et les Bio-Save™ d'EcoScience, qui sont deux champignons hyperparasites actifs sur agrumes et pomme que j'ai notés en 1995. Plus de deux douzaines de programmes sont actuellement en cours. Un projet multinational est d'ailleurs en cours en Europe dans ce domaine (http://www.biopostharvest.org/) avec des produits pas trop éloignés de la commercialisation.

Cette lutte biologique se présente dans des conditions relativement favorables car, contrairement à ce qui se passe au champ, les conditions de milieu durant le stockage des fruits peuvent être manipulées pour favoriser l'antagoniste. De plus les interférences biotiques sont relativement limitées dans ces conditions. Par ailleurs, on peut se permettre d'appliquer de fortes doses de l'antagoniste pour accélérer son effet qui doit être rapide, compte tenu des délais de manipulation des fruits qui sont très courts. On peut se contenter, dans ces conditions, d'une seule application. Enfin les fruits ont une valeur commerciale élevée ce qui réduit le handicap de coût du traitement. .

Les stratégies vont varier suivant que le pathogène tolère bien les stress et donc compétitif, comme les Penicillium des agrumes, ou peu compétitif comme Botrytis cinerea pathogène opportuniste de nombreux fruits.

Une des difficultés, souvent rencontrée dans les pays chauds, est l'existence d'une infection latente au champ qui se développe au stockage, et qui ne peut être contrôlée de la même façon qu'une infection après récolte. On note quand même plusieurs applications efficaces dans les infections latentes comme des Bacillus qui sont des colonisateurs dominants de la feuille et des fruits contre les Colletotrichum de la mangue et de l'avocat. Dans le cas de l'anthracnose de l'avocat, des Bacillus subtilis administrés par trempage ou sous forme de cires de couverture gênent les appressorias de Collectotrichum gleosporioides entraînent une dormance forcée, probablement par soustraction des substrats. Mais dans ces cas de pré-traitements avant récolte, plusieurs applications avant et après récolte sont nécessaires.

On a remarqué que ces applications fortes répétées sur une période de plusieurs années entraînent un renforcement des populations de l'antagoniste et une meilleure efficacité.

Le traitement direct des blessures est indiqué, car c'est un milieu riche où, si on donne une priorité à l'antagoniste, il peut se développer rapidement et constitue un traitement préemptif. On invoque souvent, dans les articles, une compétition nutritionnelle à laquelle les spores d'un Penicillium expansum et Botrytis cinerea sont sensibles, par exemple. Une application au verger avant récolte (les blessures sont surtout causées pendant et après la récolte) est alors utile. Mais il existe probablement bien d'autres mécanismes comme des antibioses, un parasitisme, la sécrétion d'enzymes lytiques, etc… Le cas d'enzymes lytique est illustratif par la b-1,3 glucanase de la levure Pichia guillermondii contre Botrytis cinerea. Une compétition amusante est celle de la soustraction de l'acétate de butyle par les antagonistes Cryptococcus laurentii et Sporobolomyces roseus nécessaire aux conidies (spores) de Botrytis cinerea pour adhérer au fruit. Mais il est très souvent difficile d'apporter des preuves irréfutables de ces mécanismes, car les antagonistes produisent simultanément des antibiotiques.

La sélection des souches d'antagonistes les plus efficaces passe par l'utilisation des conditions qui favorisent le pathogène. Mais il faut tenir compte du fait que le fruit évolue et que les conditions de sélection doivent en tenir compte. Ceci fait que des mélanges d'antagonistes sont probablement indiqués, permettant de couvrir ces différentes conditions. Ceci a été étudié dans le cas de la pomme. En fait le plus large spectre d'antagonistes de P.expansum se collecte dans les blessures de fruits à maturité

Des raisons de sécurité font qu'il faut très tôt se préoccuper de l'innocuité de l'antagoniste.

40. La marguerite Tagetes erecta est une fleur aux usages très divers au Mexique (ornemental, cérémonial, et pharmaceutiques, avec des propriétés antimicrobiennes. Elle produit, en effet, des thiophènes à activités fungicides, nématocides et insecticides.

Son influence sur le champignon pathogène de la tomate Alternaria solani (brûlure de la tomate), a été étudiée par des chercheurs mexicains, en interligne avec de la tomate, et comparé à l'effet d'Amaranthus hypochondriacus dans les mêmes conditions.

L'effet est significatif sur la réduction des lésions fongiques, avec une réduction de 80 à 93% des lésions foliaires et de 70 à 75% de lésions des fruits. La plante modifie le microclimat de la culture (notamment l'humidité), réduit la germination des conidies (spores asexuelles), ce que ne fait pas A. hypochondriacus et joue un rôle dans la réduction de la dissémination des spores, comme A. hypochondriacus. O Gomez-Rodrıguez et al.; Field Crops Research 83 (20JUN03) 27–34.

Quand la tomate est interplantée avec le haricot Mungo (Vigna unguiculata) dans la même rangée, on observe une réduction des attaques de Pseudomonas solanacearum (flétrissure bactérienne) à cause de la barrière physique que constitue le système racinaire de la légumineuse.

Dans le système blé-trèfle (Triticum aestivum–Trifolium repens) le trèfle réduit la dispersion des spores de Septoria tritici. En alternance avec du maïs, la tomate souffre moins de Septoria lycopersici.

Les Productions animales

Les génomes

41. La localisation d'un QTL de trypanotolérance chez la race N'Dama ouest-africaine de bovins vient d'être réalisée par un groupement travaillant autour de l'ILRI (International Livestock Research Institute de Nairobi) et associant des chercheurs israéliens, japonais et britanniques. O Hanotte et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (26JUN03) 7443–7448.

Les auteurs ont croisé un N'Dama (Bos taurus) tolérant et un Boran kényan, sensible. Les auteurs ont typé génétiquement 177 F2 de ce croisement au niveau de 477 marqueurs moléculaires répartis sur les 29 autosomes. Ils montrent que des croisements entre ces deux races et une sélection permettent une meilleure tolérance que pour chacune des races parentales.

Il faut cependant noter que l’introgression massive de gènes des zébus de populations plus nordiques sensibles à la trypanosomiase dans celui des bovins N’Dama tolérants a lieu L’utilisation de sondes ADN par des chercheurs de Trinity College indiquait que cette introgression a déjà eu lieu dans des populations encore considérées comme pures. DG Bradley et al.; Animal Genetics 25: 1 (FEB94) 7-12.

Il y a eu, en 1992, un projet de cartographie de la race N'Dama à la Texas A&M University dont je n'ai plus entendu parlé.

La transformation des cellules animales

42. Les accidents liés à l'insertion de vecteurs de thérapie génique posent des problèmes difficiles à comprendre et résoudre. Ils semblent être plus fréquent qu'anticipé. Cela a été le cas pour des enfants traités avec des vecteurs rétroviraux pour une déficience immunitaire sévère (SCID) qui ont développé une leucémie en guise de thérapie. Un colloque de l'American Society of Gene Therapy a évoqué ces accidents au début de Juin.

H Nakai et al. Nature Genetics 34 (JUL03) 297-302 montrent que les vecteurs basés sur des AAV (Adeno-Associated Virus), qui ne sont pas pathogènes pour l'homme s'insèrent préférentiellement dans des zones de gènes actifs. Ce qui peut conduire à n'importe quoi et, notamment, à des phénotypes pathologiques. Les auteurs qui cherchent à traiter l'hémophilie ont analysé de l'ADN hépatique autour des sites d'insertion chez leurs 14 patients en traitement. Le vecteur interrompt un gène dans 72% des cas, alors que si l'insertion était purement aléatoire, on devrait obtenir 40% de gènes interrompus. On savait déjà que les rétrovirus, et notamment le HIV s'intègrent plus facilement dans les gènes actifs et dans certains "points chauds" du génome (AR Schroder et al. Cell 110 (23AUG02) 521–529).

L'expression des gènes

43. Les récepteurs (nucléaires) de stéroïdes requiert des co-activateurs pour agir sur la transcription. On vient de montrer que ce recrutement peut être spécifique parmi les co-activateurs de la famille SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator-1), ce qui permet un recrutement spécifique de corégulateurs en aval. Le récepteur de la progestérone (PR) interagit avec SRC-1, après fixation de son hormone-ligand, ce qui permet le recrutement de CBP (CREB Binding Protein) et stimule l'acétylation de K5H4 (Lysine 5 de l'Histone H4). Le récepteur des glucocorticoïdes s'associe préférentiellement avec SRC-2 (alias TIF-2/GRIP-1), ce qui permet le recrutement de l'histone acétyltransférase pCAF (p300/CBP-Associated Factor) et l'acétylation de l'histone H3, cette fois. X Li et al.; Molecular & Cellular Biology 23,n°11 (JUN03) 3763–3773.

44. STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription 5) est un acteur majeur dans la réponse aux cytokines. Je rappelle que les STATs sont des facteurs de transcription latents stockés dans le cytoplasme et qui, après phosphorylation par les kinases de récepteurs des cytokines, migrent temporairement dans le noyau où ils permettent l'activation de la transcription, mais on ne sait cependant pas bien comment.

On vient de montrer, en utilisant des inhibiteurs de désacétylases et des réseaux d'expression, que l'induction des gènes cibles de STAT5 requiert une activité désacétylasique qui permet le recrutement de la machinerie de transcription. Cet effet n'est pas dû aux modifications des histones H3 et H4, ni au remodelage de la chromatine dans la zone du promoteur. A Rascle et al.; Molecular & Cellular Biology 23,n°12 (JUN03) 4162–4173.

45. On trouvera dans JC Avise et al.; Annual Review of Genetics 36 (DEC02) 19-45 une revue sur les comportements reproducteurs chez les poissons, abordés sur le plan évolutif. La reproduction peut aller d'une reproduction aléatoire pélagique, à la monogamie, sans oublier les sexes alternatifs. Les alevins sont soit abandonnés à leur propre sort, soit protégés dans des nids, des poches marsupiales, la cavité buccale ou dans les branchies, etc….

Les auteurs évaluent par des techniques de génétique moléculaire les parentés des descendants de divers types de reproduction observés. La variété est alors encore plus grande que pour le type général de reproduction (et assez amusant).

Le développement

46. Deux articles et un commentaire dans Cell du 30 Mai décrivent un nouveau facteur de transcription qui vient se joindre aux systèmes Oct4 et Stat3 indispensable au caractère totipotent des cellules souches embryonnaires (ES). Il s'agît de Nanog qui est un facteur à homéobox qui joue un rôle essentiel dans la détermination des cellules après la formation du blastocyste.

Chez les Mammifères, la première étape décisive de la différenciation a lieu lors de la compaction du trophectoderme, donnant une couche épithéliale extra-embryonnaire qui va donner plusieurs annexes, notamment le placenta, en association avec les tissus utérins de la mère. La masse cellulaire interne (ICM) va donner l'embryon proprement dit. Avant l'implantation, l'ICM se divise, au cours d'une seconde phase critique du développement, en épiblaste qui va donner les trois couches embryonnaires et les cellules germinales et l'hypoblaste qui va donner l'endoderme viscéral et pariétal extra-embryonnaire.

Les cellules ES dérivent de l'ICM. Quatre acteurs ont été caractérisés dans l'établissement et le maintien du caractère "immortel" des cellules ES, les facteurs de transcription Oct4, Sox2, FoxD3 et Stat3. Mais ils ne peuvent agir seuls. Oct4 est impliqué dans la régulation du déterminisme cellulaire dans l'embryon précoce. Il est exprimé, de ce fait, dans l'ICM, et réprimé lors de la différenciation des cellules du trophoblaste. Sox2 et FoxD3 interviennent un peu plus tard dans le maintien de l'épiblaste après l'implantation. Le renouvellement des cellules ES en culture fait intervenir l'activation de Stat3 par la cytokine LIF (Leukemia Inhibitory Factor, mais LIF n'est pas nécessaire dans le développement normal de la souris).

K Mitsui et al.; Cell 113 (30MAY03) 631-642 et I Chambers et al.; p.643-655 décrivent le facteur de transcription Nanog (un terme celte pour le "pays des gens toujours jeunes"). Mitsui et al. montrent que son élimination entraîne un défaut dans la spécification des cellules pluripotentes initiales, qui basculent vers une spécification endodermique extra-embryonnaire. Nanog joue donc un rôle important dans la seconde phase critique, d'ailleurs en association avec Oct4, pour empêcher la différenciation et promouvoir la prolifération, indépendamment de la voie LIF/Stat3.

I Chambers et al. montrent que le facteur Nanog agit en parallèle avec une stimulation of Stat3 par la cytokine LIF, pour induire le renouvellement des cellules ES. Si on le surexprime on peut se passer de Stat3 et maintenir les niveaux d'Oct4.

Voir le commentaire et des schémas dans F Cavalieri et al.; p.551-552.

47. Les protéines Tob inhibent les signaux des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) dans les ostéoblastes en interagissant avec les R-Smads récepteurs Smad1, Smad5 et Smad8. On vient de montrer que Tob interagit également avec l'I-Smad6 (Inhibiteur) au niveau de la membrane plasmique et renforce l'interaction négative de Smad6 avec le récepteur des BMPs. Un homologue du Xénope, Tob2, coopère avec Smad6 dans l'induction d'axes embryonnaires secondaires. Enfin Tob et Tob2 inhibent de façon synergique les signaux BMPs chez le Xénope. Y Yoshida et al.; Mechanisms of Development 120 (MAY03) 629-637.

48. Tous les gènes impliqués dans la formation des muscles lisses contiennent, dans leurs régions régulatrices, deux motifs (ou plus) de fixation pour le SRF (Serum Response Factor). Mais SRF est exprimé dans tant de types cellulaires qu'il ne peut être accusé de cette expression. C'est un autre facteur, la myocardine qui est en cause. C'est un co-activateur de SRF. Son homodimérisation est nécessaire, car elle permet au complexe myocardine–SRF de lier plusieurs sites régulateurs des gènes spécifiques des muscles lisses. Il doit en être de même dans le muscle cardiaque. Z Wang et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 7129-7134.

49. La différenciation des muscles n'est pas un modèle de simplicité. Elle fait intervenir des facteurs de transcription spécifiques du tissu, des facteurs généraux et des régulateurs du cycle cellulaire. Elle comporte la formation de myotubes syncytiaux où les divisions sont arrêtées. Ce retrait du cycle cellulaire est régulé par les facteurs de transcription de la famille MyoD (MyoD, Myf-5, myogénine, et MRF4/Myf-6). Ceux-ci interviennent à plusieurs reprises dans la différenciation musculaire.

L'amplification de MDM2 (qui est également une ubiquitine ligase qui peut entraîner une dégradation des protéines auxquelles elle se lie, notamment la protéine p53) interfère avec l'activité de MyoD et donc la différenciation musculaire, comme elle le fait sur l'activité de la protéine anti-oncogène p53.

MDM2 intervient également sur les transcriptions dépendant de Sp1 (un facteur de transcription faisant partie d'un groupe très spécifique de séquences données), ce qui peut être compensé par pRb (la protéine du rétinoblastome) qui éjecte MDM2 de Sp1. Pour compléter le tout, on vient de montrer que la surexpression de Sp1 restaure l'activité de MyoD, et donc la différenciation musculaire dans des cellules amplifiant également MDM2. Le complexe pRb-MDM2 module manifestement l'activité de Sp1 durant la différenciation musculaire. CS Guo et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (20JUN03) 22615-22622.

50. La masse musculaire est un phénomène adaptatif qui est régulé (voir les body builders). Cette régulation est gérée par accroissement de la taille des myofibres. Il existe deux mécanismes pour ce faire: le premier est le volume cytoplasmique autour des noyaux et le second le nombre de ces noyaux.

Le premier mécanisme est commandé par la voie des 3-phosphoinositides 3-kinases (PI3K) pour l'hypertrophie, et la dégradation des protéines musculaires par des ubiquitine ligases, dans l'atrophie musculaire.

Le second fait intervenir des facteurs de croissance comme IGF-1 (Insulin-like Growth Factor 1) pour la fusion des myoblastes uninucléés avec les myotubes dans l'hypertrophie, tandis qu'une apoptose détruit les noyaux lors de l'atrophie. Le calcium joue un rôle important, comme souvent dans le muscle. Comme d'habitude, la calcineurine intervient. Cette dernière est une sérine/thréonine phosphatase activée par le calcium, avec une sous-unité catalytique, une sous-unité régulatrice et un capteur de Ca2+ qui n'est autre que la calmoduline.

La calcineurine régule, par déphosphorylation, une famille de facteurs de transcription dits NF-ATs (Nuclear Factors of Activated T cells) avec NF-ATc1, NF-ATc2, NF-ATc3 et NF-ATc4. Déphosphorylé, NF-AT passe dans le noyau et active les gènes cibles en association avec des facteurs plus spécifiques. On trouve des isoformes spéciales abondantes dans le muscle squelettique. Ces isoformes ne sont activées qu'à certains stades de la myogenèse. C'est le cas du facteur de transcription NFATc2. La cytokine IL-4 est un facteur régulant la fusion des myoblastes avec les myotubes récemment mis en évidence. NFATc2 induit l'expression et la sécrétion d'IL-4. V Horsley et al.; Cell 113 (16MAY03) 483-494.

Des souris déficientes pour NF-ATc2 ou NF-ATc3 n'ont pas d'anomalies musculaires structurales, mais leur masse musculaire est réduite par réduction de la taille des myofibres. NF-ATc2 intervient dans la fusion des myoblastes et NF-ATc3 dans la différenciation.

La cytokine IL-4 fonctionne en aval de NF-ATc2, ce qui est le premier cas d'intervention de cette cytokine hors du système immun. L'IL-4 sécrétée par les myotubes agit sur les récepteurs IL-4Ra des myoblastes ambiants, induisant leur fusion avec les myotubes. IL-4a est en réalité une sous-unité commune de beaucoup de récepteurs d'interleukines dans de nombreux tissus.

Une constatation intéressante est que IL-4 ne joue pas de rôle dans la fusion entre myoblastes. Il y a donc deux mécanismes distincts de ce point de vue. On a déjà émis cette hypothèse dans le cas de la Drosophile.

Tout cela est passionnant, car les cytokines émises par le système immun lors d'une blessure musculaire pourrait avoir un rôle dans la régénération musculaire, ce dont on se doutait un peu, mais sans mettre la main sur les complices. Ceci ouvre des horizons sur des points encore énigmatiques comme les fusions entre macrophages et myoblastes qui ont été évoqués lors de la régénération éventuelle par fusion des cellules souches hématopoïétiques avec les myoblastes qui ont pu faire penser à une transdifférenciation (voir le Bulletin de Mai §58).

Les voies initiées au niveau des récepteurs IL-4aR pourraient bien déboucher, entre autres, sur les intégrines qui interviendrait directement dans la fusion. Les intégrines b1 et b2 permettent l'adhésion, lors de la fusion des macrophages, sous l'action d'IL-4 et IL-13. Par ailleurs, les intégrines sont impliquées dans formation des muscles. Tout cela est bien intéressant. Voir le commentaire de S Chargé et al.; p.422-423.

51. Le développement du pancréas endocrine comprend un certain nombre d'étapes précoces où des cellules précurseurs s'agrègent puis se différencient en îlots de Langerhans. On vient de montrer que ces cellules sécrètent du FGF2 qui reste lié à la matrice extra-cellulaire et joue le rôle d'un chimioattractant paracrine (agissant sur le même type de cellule). Le gradient agit sur les récepteurs FGFR-1, -2, -3 et –4 d'une sous-population de cellules. L'inhibition de la tyrosine kinase associée à ces récepteurs empêche l'agrégation. AA Hardikar et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 7117-7122.

La Physiologie

52. L'hormone de croissance GH est reconnue par deux récepteurs. Les sites reconnus par les récepteurs lactogènes et somatotrophes présentent des recouvrements, mais ne sont pas identiques. La fixation a lieu au niveau de ce que l'on appelle le site 1 de la GH, puis au niveau du site 2. Les deux sites sont structuralement distincts. La GH subit un changement de conformation après fixation sur le récepteur. Ce qui a lieu après une fixation du site 1 qui démasque alors le site 2.

On peut déconnecter, par mutation, l'activité lactogène et l'activité somatotrophe. La phénylalanine 44 est nécessaire à l'activité lactogène, mais pas à l'activité somatotrophe., et pourtant elle n'appartient ni au site 1, ni au site 2. Elle ne fait que contribuer au démasquage du site 2. KM Duda et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (20JUN03) 22734-22739

Le système immunitaire

53. Le numéro de Juin de Current Opinion in Immunology contient une série de revues, intéressantes par leur généralité, sur la différenciation et surtout l'activation des lymphocytes B et T. Comme toujours il faut s'armer d'un papier et y noter les différents termes techniques utilisés dans le dialecte local des immunologistes pour suivre, d'un article au suivant, ce que fait une protéine donnée. Ce n'est pas leur faute exclusive, car le système est quand même bien compliqué.

Comme partout ailleurs, ces différenciations sont le fruit de la convergence de signaux activateurs et répresseurs, modulés à tous les niveaux depuis la transcription jusqu'à la protéolyse des signaux. On y voit décrits les récepteurs, adaptateurs, enzymes effectrices et leurs substrats cibles dans la voie. Je distillerai sur l'été le contenu de ces revues qui me paraissent assez générale pour intéresser d'autres que les immunologistes

Trois revues se concentrent sur les acquisitions récentes dans le domaine des réarrangements des domaines lipidiques de la membrane plasmique et dans le cytosquelette engendrés par la stimulation de la cellule. On a découvert, il n'y a pas si longtemps, ce réarrangement au niveau du contact entre un lymphocyte et la cellule présentatrice de l'antigène, la synapse immunitaire.

 A Trautmann et al.; Current Opinion in Immunology15 (JUN03) 249-254, discute précisément la formation et le rôle de cette synapse, tandis que P Pizzo et al.; p. 255-260 analysent le rôle des radeaux lipidiques, ces microdomaines à la composition lipidique spéciale (cholestérol et sphingolipides), dans le recrutement des éléments associés aux récepteurs immunitaires des lymphocytes, et donc dans la transmission du signal émis lors de l'interaction entre le récepteur et son ligand spécifique. Enfin AV Miletic et al.; p.261-268 analysent les remaniements du cytosquelette.

Le signal est amorcé au niveau des récepteurs des cellules B et T lymphocytes à la suite de la fixation de leurs ligands spécifiques respectifs, l'antigène dans le cas des cellules B et le complexe MHC chargé pour les cellules T. Le signal est initialement transmis dans la cellule par des tyrosine-kinases comme Src, Syk et Tec indépendantes des récepteurs proprement dits. Ce signal est ensuite amplifié ou bridé par des molécules adaptatrices qui sont analysées dans la revue de E Janssen et al.; p. 269-276. Cette dernière revue fait le point sur une famille particulière d'adaptatrices appelées SAP (pour SLAM Associated Proteins) interagissant avec les récepteurs nouvellement identifiés à la surface des lymphocytes, SLAM (pour Signalling Lymphocyte Activation Molecule, j'ai repris mon dictionnaire).

Les fonctions de ces récepteurs SLAMs sont analysées par A Veillette et al.; p. 277-285. La revue de JH Wang et al.; p.286-293 montre comment l'analyse à l'échelle atomique de ces récepteurs a fait avancer nos connaissances.

Un autre aspect moins bien connu de l'activation des lymphocytes est celui des mouvements des ions Ca2+ après les phosphorylations par des sérines kinases. D Cantrell; p.294-298 s'intéresse aux réseaux de ces enzymes dans les lymphocytes tandis que MM Winslow et al.; p. 299-307, analysent la modulation des signaux par la concentration intra-cellulaire de ces ions Ca2+ (un mécanisme universel) dans le cas des lymphocytes où ce signal module la différenciation et l'activation de ces cellules. Cette concentration est, comme très souvent, assurée par la libération des ions à partir de stocks cellulaires et d'un influx d'ions extracellulaires. Ce dernier influx fait intervenir un canal particulier (encore largement discuté) appelé CRAC (pour Ca2+ Release-Activated Ca2+ Channel) et son rôle éventuel dans la régulation des concentrations de l'ion. Les gènes commandés par cette concentration et par la phosphatase Ca2+-dépendante qu'est la calcineurine ont été identifiés dans les lymphocytes T. On trouvera, par ailleurs, dans un article de S Kuhnert et al.; Cellular Signalling 15 (AUG03) 783-792 une l'analyse subcellulaire des signaux Ca2+ au sein des lymphocytes T.

La répression de l'activité est abordée dans les cellules NK (Natural Killers) et des découvertes dans ce domaine ces toutes dernières années sont envisagées par la revue de LL Lannier; p.308-314. Ces cellules tuent préférentiellement certaines cellules, si ces dernières n'expriment pas de MHC-I. Mais ces cellules ne s'attaquent pas aux érythrocytes qui, pourtant, n'expriment pas ces MHC-I à leur surface, par exemple, et le modèle de la sentinelle et du mot de passe est donc insuffisant. Les cellules NK doivent donc disposer d'un système de reconnaissance positif. Ces cellules disposent, en effet, d'un grand nombre de récepteurs activateurs. Il existe donc un équilibre entre le freinage des activités et leur stimulation. Ces récepteurs sont inhibés grâce à des tyrosines situées dans la partie cytoplasmique des récepteurs qui recrute des tyrosine- ou lipides phosphatases, et modulent ainsi les signaux d'activation engendrés par les phosphorylations des récepteurs liés aux tyrosine kinases et aux phosphatidylinositol-3 kinases Syk et ZAP70. Enfin la revue de IK Jang et al.; p.315-320 traitent des régulations par ubiquitinylation et destruction des protéines régulatrices.

L'homéostasie des cellules T périphériques, dont le pool est maintenu constant durant toute la vie, est traitée par B Seddon et al.; p.321-324, et fait intervenir encore de nouvelles voies de signalisation. Ce n'est que récemment que l'on s'est rendu compte que l'état de quiescence des cellules T naïves, quand elles se localisent à la périphérie et avant activation, est un processus actif nécessitant des signaux de l'environnement pilotant les transcriptions. La réponse à ces signaux dépend des sous-populations de cellules T. Les signaux de survie sont fournis par des cytokines et par interaction du récepteur avec les peptides "soi" associés aux MHC. C'est la compétition pour les signaux de survie qui limite la taille des populations. Inversement, les mêmes signaux permettent le rétablissement de la population en activant les divisions. La réponse aux deux signaux des MHC" soi" et des cytokines entraînent trois types de situations : limitation, rétablissement d'une population et, par ailleurs, activation des cellules et leur différenciation en cellules effectrices. Ce qui est intéressant c'est que toutes ces fonctions utilisent les mêmes récepteurs et il doit y avoir une perception, soit qualitative, soit quantitative des signaux engendrés.

54. L'analyse, par réseaux d'expression, de l'évolution de la transcription chez les lymphocytes B chez l'homme et la souris et T chez la souris, depuis le réarrangement DJ jusqu'à maturité est effectuée par R Hoffmann et al.; Current Opinion in Immunology 15 (JUN03) 239-245.

Les lymphocytes se développent en deux phases, et dans des régions différentes du corps. Le développement initial, indépendant de tout antigène, se déroule dans la moelle osseuse pour les cellules B, et dans le thymus pour les cellules T. Le programme comporte des réarrangements par étapes des loci des chaînes légères et lourdes des immunoglobulines (Ig) dans les cellules B, et des chaînes g, d, b et a des récepteurs (TCR) des cellules T .

On distingue cinq stades du développement des cellules B, avec expression de marqueurs successifs, B220, c-kit, CD25 et IgM. Pour les cellules T de la souris, on a huit stades successifs avec les marqueurs CD25, CD44, CD4 et CD8.

Le développement des cellules B et des cellules T à récepteurs a/b TCR sont très similaires. Le précurseur le plus précoce, pré-B1 des cellules B et CD4-CD8- (double négatifs du stade 2) précède le réarrangement V-DJ.

Après réarrangement des IgH ou des TCRb, la population des précurseurs s'amplifie par prolifération de pré-B/pré-T en une population de cellules pré-BII et en précurseurs double positifs CD4+CD8+de cellules T.

Après 4-5 divisions dans le cas des cellules B, et une dizaine dans le cas des cellules T, la phase de prolifération initiale est terminée et les réarrangements des Igl et des chaînes a  des TCRs commencent dans de petites cellules pré-BII et des précurseurs doubles-positifs de cellules T. Enfin après sélection face aux autoantigènes, les lymphocytes deviennent des lymphocytes prêts à la défense.

La revue porte en fait uniquement sur les stades précoces, c'est-à-dire jusqu'à la formation des récepteurs d'antigènes.

Environ 10% des gènes ayant une sonde sur le réseau montrent une expression différentielle au cours de ce développement. La moitié d'entre eux présente une expression différente entre les deux lignées B et T. Ceux qui sont communs sont liés à la prolifération, ce qui est attendu. Les gènes impliqués dans les signaux et les molécules d'adhésion, ainsi que les facteurs de transcription sont différents entre les deux lignées, ce qui n'est pas inattendu.

L'extrapolation homme-souris est possible car les gènes homologues ont un même patron, d'expression.

55. La famille des facteurs de transcription NF-kB intervient dans tous les mécanismes de défense, immunité, inflammation, apoptose. NF-kB est libéré après la phosphorylation de son inhibiteur IkB qui le piégeait dans le cytoplasme (voir le Bulletin d'Avril §77). On a récemment mis en évidence un complexe comprenant deux kinases (IKKa et IKKß) et une sous-unité régulatrice, ce qui a déclenché une série de découvertes dans le domaine de la régulation de cette voie.

IkB présente plusieurs isoformes IkBa, IkBß, notamment. Cytokines inflammatoires, mitogènes ou certaines protéines virales activent NK-kB et induisant la protéolyse des IkBs et de leurs précurseurs. On a plus de détails dans le cas de IkBa où c'est la phosphorylation de deux sérines particulières qui entraîne une polyubiquitinylation et la dégradation par le protéasome 26S.

 Seule IKK-b est indispensable à la dégradation de IkB. Cependant des fibroblastes de souris dépourvus de IKK-a ne sont pas capables de déclencher les transcriptions dépendant de NF-kB. On s'est donc demandé ce que cette kinase pouvait bien faire dans ce cas. En réalité elle intervient, non pas dans le cytoplasme pour libérer NF-kB de son inhibiteur, mais dans le noyau. Elle interagit avec CBP (CREB-Binding Protein) et, associée à Rel A,elle est recrutée au niveau des promoteurs reconnaissant NF-kB et phosphoryle (ce qui entraîne l'acétylation) l'histone H3. Elle agit donc très en aval dans la voie NF-kB. Y Yamamoto et al.; Nature 423 (05JUN03) 655-659

56. Plusieurs populations différentes de cellules T sont engagées dans les défenses spécifiques contre les pathogènes. Il existe, par ailleurs, les défenses non spécifique de l'immunité innée (reconnaissant des motifs généraux d'une catégorie d'organismes étrangers et éventuellement pathogènes, plutôt que des motifs très spécifiques de chaque pathogène).basés sur les récepteurs TLRs (Toll-Like Receptors).

Il en existe au moins dix reconnaissant, chacun, des motifs particuliers. Ils font intervenir des protéines adaptatrices comme MyD88 (voir le Bulletin d'Octobre-Novembre 2002 §59, 60 et 63 et Décembre §76). Les récepteurs TLR2 et TLR4, font également intervenir un adaptateur voisin de MyD88 dénommé Mal (pour MyD88 adaptor-like, également appelé TIRAP pour TIR domain-containing Adaptor Protein, les immunologistes adorent multiplier les dénominations pour égarer les béotiens). TIR est un motif d'environ 160 amino-acides qu'on trouve dans le domaine cytoplasmique de tous les récepteurs TLRs et apparentés. Une revue fait le tour des réponses des TLRs et des rôles connus des adaptateurs. LAJ O'Neill et al.; Trends in Immunology 24 (JUN03) 286-289.

On a, par ailleurs, découvert un autre adaptateur, TRIF [Toll–interleukin-1 Receptor (TIR) domain-containing adaptor Inducing interFeron-b] ou TICAM-1 (TIR-Containing Adaptor Molecule-1) dans le cas des réponses déclenchées par TLR3 (antiviral). On a récemment trouvé, chez l'homme deux adaptateurs additionnels: TRAM (TRIF-Related Adaptor Molecule) et SARM (Sterile and HEAT–ARmadillo Motifs).

 Les TLRs donnent lieu à une homodimérisation, comme dans le cas de TLR4 (récepteur des lipopolysaccharides), ou à des hétérodimérisations comme dans le cas de TLR2 qui s'associe à TLR1 pour reconnaître les lipopeptides bactériens ou à TLR6 pour reconnaître les lipopeptides mycobactériens.

Seul des TLRs, TLR3 ne semble pas faire intervenir directement MyD88, tandis que Mal intervient dans le cas de TLR4, mais pas dans celui de TLR9. Cette multiplicité des adaptateurs permet d'envisager les mécanismes moléculaires des différentes réponses possibles à l'activation des récepteurs TLRs. En effet, les réponses sont multiples avec activation, notamment, des TNFs (Tumor Necrosis Factors) et l'universel facteur de transcription NF-kB. Ainsi TLR4 active le facteur de transcription IRF-3 (IFN regulatory factor-3), qui régule la production de l'interféron-b et donc tous les gènes qui en dépendent.

57. Le récepteur TLR3 (Toll-Like Receptor 3) reconnaît les ARNs doubles-brins, motif associé à des infections virales. Il active le facteur de transcription NF-kB bien connu et la production des interférons a et b chez la souris comme chez l'homme. Mais ce n'est pas une raison pour considérer que les mécanismes sont identiques chez les deux animaux. Les patrons d'expression de ce récepteur (comme d'ailleurs ceux de TLR2, TLR4 et TLR9) sont différents entre la souris et l'homme. Dans la lignée hématopoïétique humaine, le messager de TLR3 est uniquement produit dans les cellules dendritiques (présentatrices professionnelles d'antigènes. Chez la souris, TLR3 est surtout exprimé dans les macrophages et répond aux lipopolysaccharides bactériens, ce que ne fait pas le récepteur humain.

On vient de montrer que ceci est dû à une régulation différente liée à l'existence de séquences non conservées dans les promoteurs murins et humains. Ces différences dans les promoteurs n'empêchent pas l'induction de la transcription par l'interféron b dans les deux cas; Ceci est dû à la présence d'éléments IRF (Interferon Regulatory Factor) similaires, dans les promoteurs, ce qui expliquerait ses fonctions antivirales. SV Heinz et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (13JUN03) 21502-21509.

58. La réponse des cellules T est très souple. Une revue est consacrée à cette dernière : DL Woodland et al.; Current Opinion in Immunology 15 (JUN03) 336-342.

Les cellules T auxiliaires (helper) T CD4+, cytotoxiques CD8+, la progression de leur forme naïve vers les formes effectrices et "mémoire", leur différenciation en Th1, Tc1, Th2 et Tc2 sont maintenant bien connues. La différenciation entre cellules CD4+ et CD8+ de type 1 ou 2 dépend de l'action des interleukines IL-12 et IL-4.

 Les cellules Th1 produisent l'interféron g, tandis que les Th2 produisent les interleukines IL-4 et IL-5. Les cellules Tc1 spécifiques du virus grippal, par exemple, et exprimant CCR5 (le récepteur 5 des chimiokines CC, caractérisées par deux cystéines adjacentes dans la partie N-terminale de la protéine, par opposition au CXC), se dirigent rapidement vers l'épithélium pulmonaire, tandis que les cellules Tc2, exprimant CCR4 arrivent comme les carabinieri, et reste prudemment dans les espaces insterstitiels, mais sans aucune différences dans leurs capacités effectrices.

Le schéma s'est récemment complété avec la découverte d'une plasticité supplémentaire en termes de phénotype, distribution et fonction effectrice.

Les sous-populations naïves sont celles qui présentent la plus grande homogénéité. L'activation des cellules cytotoxiques (CD8+) Tc1 et Tc2, via leurs récepteurs (TCRs) entraîne une prolifération et l'acquisition de nombreuses fonctions effectrices qui introduisent un premier niveau de diversité, entre cellules soit effectrices, soit "mémoire". Ces deux types de cellules diffèrent dans leur capacité de prolifération en réponse à leur antigène spécifique, à assurer la fonction effectrice cytotoxique et leurs fonctions régulatrices.

Certaines de ces différences sont liées à l'exécution de programmes différents, tandis que d'autres le sont à des particularités du milieu comme la persistance de l'antigène ou la localisation des cellules. Les cellules cytotoxiques T CD8+ isolées du tractus respiratoire de souris immunisées contre le virus grippal transcrivent les gènes des cytokines IFN-g, IL-5 et IL-10, tandis que les mêmes cellules dans la rate produisent IL-2, IL-4 et IFN-g.

La revue discute des mécanismes potentiels maintenant cette hétérogénéité. Les auteurs insistent sur le rôle des facteurs externes dans cette diversification des populations cellulaires. La présence locale de cytokines inflammatoires ou suppressives comme IL-10, TNF-a/b et TGF-b, de chimiokines ou de facteurs stromaux contribuent à la modulation des fonctions effectrices.

IL-21 supprime la différenciation en cellules T de type 1 et stimule la différenciation en cellules de type 2. IL-18 s'oppose à la suppression des réponses de type 1 par IL-4 et active l'expression des récepteurs IL-12 et les réponses de type 1. On a donc de nombreux acteurs permettant de stabiliser, supprimer, différer ou inverser les réponses. On a également vu plus haut que les cytokines produites peuvent ne pas répondre au schéma canonique différenciant les types 1 et 2. Ce qui fait dire à certains que cette distinction est peut-être un artefact. On a suggéré, par ailleurs, qu'il existe des différences entre 1 et 2 liées à la progression vers le statut de cellule "mémoire".

Les cellules T sont hétérogènes également dans leur capacité de prolifération face à leur antigène spécifique. La stimulation du TCR sans les molécules co-stimulatrices induit une absence de réaction (corrigible par IL-2), et cela a probablement son importance dans l'élimination d'une réaction contre les antigènes "soi".

Les cellules T "mémoire" sont également hétérogènes dans leurs capacités effectrices, suivant leur localisation. Les cellules des organes lymphoïdes secondaires sont en général non cytotoxiques alors que celles de la périphérie entrent immédiatement en action sauf pour les cellules du poumon qui ne sont pas cytolytiques. Il semble que les fonctions effectrices des cellules "mémoire" soient régulées, en partie, par des molécules d'adhésion.

59. Le développement de l'embryon chez les mammifères requiert un ajustement de la physiologie maternelle, au niveau de la vascularisation et du système immunitaire. Les placentas hémochoriaux humains et murins comportent un mélange des sangs qui est propice à des réactions inopportunes du système immunitaire.

Les cellules trophoblastiques du placenta produisent hormones et cytokines que l'on soupçonne de contribuer à ce remodelage physiologique.

Chez les rongeurs, le placenta produit des prolactines (PRL). Le rat possède 19 gènes codant des prolactines, et la souris en possède 26. La PRL-like protein-A (PLP-A) est l'une d'entre elles apparaissant lors d'une gestation et interagissant avec les cellules NK (Natural Killer) utérines.

Les cellules NK sont des cellules cytotoxiques existant sous une forme préactivée sans intervention d'une immunisation préalable, ce qui en fait des acteurs de ce que l'on appelle l'immunité innée. Elles exterminent toute cellule ne présentant pas les protéines du MHC-1 à leur surface (qui est donc l'équivalent de l'IFF des avions militaires pour Identification Friend/Foe). Les cellules NK sont un peu les pitbulls du système immunitaire, mais elles sont bien élevées et peuvent être dressées à ne pas trucider de façon indiscriminée, grâce à des récepteurs qui, activés par des interleukines (IL-2, -7, -12 et –15), calment les cellules. La protéine PLP-A émise par le trophoblaste supprime la capacité des cellules NK utérines à produire l'interféron-g (IFN-g).. Elle n'utilise cependant pas ces récepteurs. Les NK sont alors écartées du site d'implantation et sont associées à la néovascularisation du placenta. R Aina et al.; Molecular & Cellular Endocrinology 204 (30JUN03) 65-74.

Les Vaccins

60. On constate un regain périodique d'intérêt pour l'utilisation de l'immunité contre les sucres, surtout dans le cas des parasites, pour qui les vaccins anti-protéines ne sont manifestement pas faciles à construire, et quand ils sont efficaces dans un modèle animal, ils ne marchent pas chez l'homme. Trypanosoma brucei l'agent de la maladie du sommeil en Afrique se joue de cette immunité en modifiant ses protéines de surface toutes les deux semaines. On cherche donc d'autres points d'attaque et notamment les décorations glucidiques des antigènes de surface qui sont plus difficiles à changer, car dépendant de nombreuses enzymes. Un commentaire de C Dennis; Nature 423 (05JUN03) 580-582 portent sur ce type d'immunité, particulièrement dans le cas des leishmanioses. On envisage, dans ce cas, le lipophosphoglucane (LPG), de la surface des Leishmania qui protège, au moins chez la souris, lors d'une infection secondaire. Ces sucres sont des facteurs de virulence, car ils protègent le parasite de la lyse dans le compartiment cellulaire où ils se loge. Il reste, cependant, à prouver que ce sont bien les sucres qui sont responsables de l'immunité, et pas des protéines contaminantes. On essaye actuellement de lever ce doute en utilisant un LPG synthétique.

La validité de cette approche a déjà été démontrée, mais dans le cas d'infections bactériennes beaucoup moins polymorphes comme celles par Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae type b. Le problème réside dans le fait que le système immunitaire n'est pas très fort dans ce domaine et a du mal, par exemple, à se remémorer les motifs glucidiques rencontrés, ce qui n'est pas favorable pour un vaccin. On sait depuis très longtemps qu'un sucre peut devenir très immunogène s'il est greffé sur une protéine. C'est ce que l'on a réalisé avec les vaccins anti-bactériens mentionnés plus haut où la protéine utilisée était une toxine inactive (toxoïde) de la diphtérie ou du tétanos qui ont, de plus, un fort effet adjuvant.

Mais analyser les polysaccharides de surface des parasites n'est pas une mince affaire, ne serait-ce que pour l'extraire et le purifier. Les techniques modernes sont maintenant suffisamment sensibles pour que les analyses puissent être pratiquées avec de petites quantités d'antigène. La structure connue, on peut en synthétiser artificiellement, un peu comme dans le cas des polypeptides.

Un vaccin contre Plasmodium falciparum est actuellement en cours de montage selon ces principes. Il est basé sur un glycolipide, le glycoinositol phospholipide (GPI).

Le cas de T.brucei est un peu désespéré, car ses sucres sont pratiquement inaccessibles aux anticorps. On essaye cependant de s'attaquer à une poche pleine de carbohydrates située à la base du flagelle et qui joue un rôle important dans la capture de nourriture par le parasite et qui est, théoriquement, plus accessible.

61. La protéine immédiate (IE180) du virus de la maladie d'Aujeszky (un herpèsvirus) dans un vaccin ADN confère une protection qui n'est que modérée. Son effet peut être sensiblement amélioré en joignant un plasmide codant la production d'IL-2, soit en incluant l'ADN vaccinal dans des liposomes cationiques. J Bu et al.; Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 26 (MAY03) 175-187.

61.bis Les réponses aux vaccins antigrippaux sont variables. Les sous-unités vaccinales couramment utilisées contiennent l'hémagglutinine et la neuraminidase de la souche prévalente. La réponse est essentiellement humorale (anticorps circulants), les cellules T cytotoxiques tuant les cellules infectées étant peu stimulées, ce qui est regrettable pour un vaccin antiviral.

La production des anticorps IgG par les cellules B nécessite cependant l'aide des cellules T CD4+. Du fait que ces dernières reconnaissent l'antigène en association avec les MHC II (HLA II chez l'homme), le polymorphisme de ces HLA II module la réponse. Il existe une variabilité génétique au niveau de leurs gènes.

Les vaccins classiques sont souvent produits dans des œufs de poulet embryonnés, mais certains individus ne répondent pas à des vaccins ainsi produits, probablement à la suite de différences de glycosylation. Il est possible de renforcer cette action en utilisant du virus produit dans des cellules de mammifères MDCK (Mardin–Darby canine kidney) lors de rappel ou en le mélangeant avec le vaccin aviaire. . JS Oxford et al.; Vaccine 21 (20JUN03) 2743-2746.

62. On utilise couramment des Lactobacillus pour leur "vertus" probiotiques. Cela en fait des vecteurs de vaccins oraux plus facilement acceptables que d'autres. On vient de montrer que le stade de croissance des bactéries administrées influence le type de réponse obtenue. Elles peuvent même être dangereuses, car ce stade ainsi que la souche utilisée affecte la réponse des Th1 (T helper cell type 1 stimulant les réactions inflammatoires et peu actives sur la production des anticorps) comme des Th2. Le rapport IgG1 (Th2)/IgG2a (Th1) est un indice des réponses de ces deux voies. Or on constate de grandes différences entre les souches de Lactobacillus, ce qui signifie que les souches doivent être utilisées judicieusement, si l'on veut piloter leur effet probiotique sous leur forme naturelle ou comme vecteur recombinants vaccinaux. CBM Maassen et al.; Vaccine 21 (20JUN03) 2751-2757.

63. La protection des porcs contre les souches toxinogènes de la bactérie Actinobacillus pleuropneumoniae correspond à une réponse qui dépend également des isotypes IgG et du rapport Th2/Th1, et donc IgG1/IgG2, des anticorps contre la toxine hémolytique. Ce rapport dépend des cytokines intervenantes, et varie selon les individus. En général, les porcs présente un fort rapport IgG1/IgG2 face à une stimulation par IL-10, et un faible rapport après stimulation par l'interféron ou Il-12. Le malheur veut que l'on ne sache pas encore les fonctions des divers isotypes. Une étude a été entreprise dans le but d'élucider en partie ce point. A Crawley et al.; Vaccine 21 (20JUN03) 2911-2922.

Les isotypes des IgG du porc ont des régions constantes très voisines avec des différences entre sous-classes au niveau de la courbure qui permet la flexibilité des bras (Fab) du Y de l'immunoglobuline, et de la région constante CH3. La séquence des isotypes d'IgG montre que tous ces isotypes ont un site de fixation du facteur C' du complément. IgG2a, IgG2b et IgG4 sont plus flexibles en leur milieu qu'IgG1 et IgG3 et activent probablement le complément lytique C' plus efficacement. Il existe donc des différences notables entre les isotypes.

64. Mannheimia haemolytica sérotype 1 (S1) est l'agent le plus important de la fièvre des transports chez les bovins (on accuse également des coronavirus). Il existe de nombreux vaccins contre cette bactérie et, pourtant, la maladie continue à sévir, car ils ne sont efficaces que dans 50% des cas.

L'immunité doit porter sur la leucotoxine sécrétée qui est le principal facteur de virulence ainsi que sur des antigènes de surface, mais on ne sait pas trop lesquels. Il est raisonnable de penser que ce sont des antigènes portés par la membrane externe. L'une de ces dernières protéines pour laquelle la réponse antigénique est bien corrélée avec une protection est la lipoprotéine OMP majeure de 45 kDa (PlpE). Des anticorps contre cette protéine la reconnaissent dans toutes les M.haemolytica, sauf dans le sérotype 11, qui a depuis été reclassée comme une Mannheimia glucosida. On peut donc s'en servir pour augmenter l'efficacité des vaccins commerciaux. AW Confer et al.; Vaccine 21 (20JUN03) 2821-2829.

65. Il existe deux maladies adénovirales communes chez les poulets: l'entérite hémorragique de la dinde et le syndrome "egg-drop" des poules pondeuses détecté pour la première fois en 1976 et qui devient un problème dans le monde entier. Le syndrome "egg-drop" des poules est dû à un adénovirus affectant le tractus génital donnant des oeufs à enveloppes malformées, mous à coquille très fine ou absente, chez des poules apparemment en bonne santé. Les effets sont observés aux alentours de 30 semaines et entraînent alors des pertes de production. Un vaccin inactivé provenant de cultures dans des œufs de canard a été distribué dès 1977 et il est administré vers 14-16 semaines. Mais il est, comme souvent, très impur et contient énormément d'antigènes divers ce qui est inutile. De plus il n'existe pas d'œufs de canards "pathogen-free", et ces œufs peuvent contenir des immunoglobulines interférant avec la vaccination. D'où la quête de vaccins à sous–unités virales, peut être moins efficaces mais plus sûrs.

Des chercheurs israéliens ont monté un tel vaccin utilisant une partie de la fibre du sommet des virions. Ce fragment comporte le bouton terminal dont on sait que c'est le déterminant le plus efficace pour obtenir des effets neutralisants) et 34 amino-acides de la fibre. E Fingerut et al.; Vaccine 21 (20JUN03) 2761-2766.

Les Pathogènes

66. Le génome d'un Mycobacterium bovis (souche AF2122/97) qui a engendré, par sélection (sur pomme de terre additionnée de bile et de glycérol pendant 13 ans, encore un martyr de la science), le fameux vaccin BCG (Bacille Calmette–Guérin) vient d'être entièrement séquencé dans le cadre d'une initiative européenne. T Garnier et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (26JUN03) 7877–7882. Cette souche possède un génome de 4 345 492 pb et a été comparée à ceux de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae. Le génome de M. bovis est identique à 99,95% à celui de M.tuberculosis, mais son génome est réduit à la suite de délétions. Celui de M. leprae montre des délétions similaires. Ce sont les gènes de la paroi et de protéines sécrétées qui varient le plus. Aucun gène n'est particulier à M. bovis, ce sont donc des régulations différentes de l'expression qui sont responsables des tropismes humain et bovin.

Ceci est intéressant dans la mesure où la multiplication des cas de tuberculose bovine est préoccupante. On s'en tient, pour l'instant, à la technique d'élimination des animaux affectés.  Le blaireau est un réservoir naturel de la bactérie, et on cherche actuellement à évaluer l'importance de cette source en Grande Bretagne et en Irlande, en massacrant ces braves bêtes. Mais elle sévit également dans de nombreux autres animaux sauvages comme les buffles et des antilopes, mais aussi les lions comme on l'a montré dans le Kruger Park. La Nouvelle Zélande a fait un effort considérable pour éradiquer la maladie, mais un opossum (Trichosurus vulpecula) vient narguer les vétérinaires et aux Etats Unis c'est un cerf du Michigan qui est en cause.

67. Les Brucella (voisines des Rhizobiacées et des Rickettsies) sont des bactéries intracellulaires qui s'abritent dans les macrophages (ou le trophoblaste) pour s'y multiplier. Elles ne peuvent subsister hors de ces cellules que dans des conditions très particulières comme dans les débris fœtaux issu d'un avortement qu'elles ont provoqué. Elles sont donc des extracellulaires facultatives. Une revue des équipes INSERM de Nimes et Montpellier qui se consacrent à cette bactérie malfaisante est parue avec S Köhler et al.; Trends in Microbiology 11 (MAY03) 215-219.

Ces bactéries se logent dans une sorte de vacuole dont la nature exacte n'est pas encore établie et qu'on nomme provisoirement phagosome. B.suis et B.abortus entrent dans la cellule par des voies détournées pour éviter le contact avec les instruments lytiques de la cellule et, en particulier le lysosome. La revue discute de cette nature et montre que c'est une vacuole très particulière dérivant du réticulum endoplasmique et enrichie en cholestérol qui isole la bactérie de nombre de molécules cellulaires, et en particulier et ce qui est curieux, des nutriments qu'elle pourrait prélever. La bactérie cherche donc à être invisible par la cellule et à en dépendre le moins possible, tout en résistant aux stress engendrés par les défenses cellulaires. Cet isolement lui permet, en tout cas, de pratiquer la respiration anaérobie (elle réduit d'autres molécules que l'oxygène pour respirer).

La mise en œuvre de ces défenses prend du temps car, 7–10 h après infection, 90% des bactéries sont mortes, et ce n'est qu'après que la multiplication peut commencer. C'est le temps de mise en place du "brucellosome" (encore une innovation).Ce compartiment est élaboré grâce à l'opéron de virulence VirB.

68. Maintenant que l'on ne s'intéresse plus hystériquement au syndrome respiratoire aigu qui a ravagé les économies asiatiques, on peut s'intéresser calmement à son origine. Un article se consacre à la détection des coronavirus canins entraînant une infection similaire. K Erles et al.; Virology 310 (05JUN03) 216-223. On sait que la civette (Paguma larvata) comestible en Chine a été accusée de servir de réservoir (voir D Cyranoski et al.; Nature 423 (29MAY03) 467).

On trouvé par RT-PCR (RT pour Reverse Transcription) des séquences semblables à celle des coronavirus respiratoires humains et bovins, mais plus éloignées de celles des coronavirus intestinaux canins au niveau des séquences de la polymérase et des spicules de l'enveloppe.

69. La caille est accusée d'être un réservoir pour les virus grippaux. Elle permet la réplication de 14 des 15 sous-types des souches aviaires du virus de l'influenza A dans leur tractus respiratoire. Une inoculation du virus n'est efficace qu'après une période d'adaptation. On n'observe cependant pas de réplication des virus A ou B humains, et des virus porcins à faible niveau. Mais ces virus se réarrangent relativement facilement et un virus réarrangé codant les glycoprotéines de surface d'un virus de caille et les protéines internes d'un virus humain s'y réplique relativement bien. La caille peut donc servir d'amplificateur à un réarrangement pathogène pour l'homme. NV Makarova et al.; Virology 310 (25MAY03) 8-15.

70. On trouvera dans MA Brinton; Annual Review of Microbiology 56 (OCT02) 371-402, une revue sur le virus West Nile (WNV). Ce virus envahit depuis 1999 tous les Etats-Unis à partir de l'Est, et a déjà fait une incursion en Camargue qui semble avoir été jugulée par une interdiction (évidemment contestée sur le moment pour des raisons commerciales) du déplacement des chevaux.

 Le génome viral de 11 kb permet le codage d'une polyprotéine. C'est un virus du groupe de la fièvre jaune (Flavivirus donc à ARN simple-brin sens) transporté par des moustiques (Culex, Aedes, Anopheles, Minomyia, Mansonia avec une prédilection pour Culex). Il infecte essentiellement les oiseaux, mais également les chevaux et l'homme. Cette infection émergente se traduit par un accroissement progressif de la pathogénicité (il peut être mortel pour les personnes âgées), mais avec une absence de transmission entre humains.

Le virus a été caractérisé en Ouganda en 1937, mais il est très mobile, car un virus isolé en Roumanie avait la même séquence que ceux isolés au Sénégal et au Kenya. Le responsable de l'épidémie américaine, qui a débuté dans le quartier de Queens à New York, provenait vraisemblablement d'oies d'Israel (WN-Israel 1998) où la même épidémie s'est déclenchée en 2000. Elle va s'étendre à tout le Nouveau Monde, car les vecteurs y sont ubiquitaires et les oiseaux migrateurs se chargeront de l'implanter. Les mares d'eau stagnante rassemblent, en périodes de fortes chaleur, moustiques et oiseaux aquatiques.

 La revue fait le tour de la biologie du virus au niveau moléculaire et discute des stratégies de vaccination qui devient indispensable.

71. Le virus de la dengue est le pathogène humain transmis par les arthropodes le plus répandu. C'est un Flavivirus (comme le précédent ) un peu compliqué. Aedes aegypti et Aedes albopictus sont les vecteurs les plus fréquents. On dénombre 100 millions de cas d'infections humaines par an, et les épidémies sont en nombre croissant dans la zone intertropicale. La forme grave hémorragique cause 100 000 cas par an. Il existe quatre sérotypes différents et la fièvre hémorragique semble causée par une série d'infections séquentielles, ce qui pourrait indiquer une contribution immunologique à la pathogénicité et ne facilite pas la mise au point de vaccins. Y Modis et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 6986–6991, décrivent la structure de la protéine E, l'une des trois protéines structurales du virion qui assure la double fonction de la reconnaissance du récepteur et la fusion avec la membrane cellulaire. Elle peut constituer un modèle de référence pour les autres Flavivirus. De plus le fait que la protéine de fusion E1 du Semliki Forest virus (un alfavirus, un autre groupe de virus) présente une structure tout à fait analogue avec la protéine E sans aucune communauté de séquence est intéressant. Un commentaire de FA Rey ; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 6899–6901, (de l'INRA à Gif) décrit ce que cette structure apprend sur la biologie des Flavivirus. Un des points discutés est celui de capacité de fusion entre virus et membrane plasmique qui est déclenchée par un pH acide induisant un changement de la conformation de la protéine.

Comme tous les Flavivirus, le virus de la dengue subit au moins un cycle de réplication dans le moustique. Il passe ensuite dans la peau du patient lors du repas de sang et là il doit retrouver une lectine tétramérique particulière de type C qu'on retrouve dans les cellules dendritiques de la peau. Cette lectine est spécifique des oligosaccharides riches en mannose recouvrant la surface des virions produits chez le vecteur. Or la protéine E comporte deux sites de glycosylation, tous deux utilisés : l'Asn153 est utilisé par tous les flavivirus, et l'Asn67 est particulier à la dengue.

72. Une revue sur les prions des champignons est parue avec SM Uptain et al.; Annual Review of Microbiology 56 (OCT02) 703-741.

On connaît quatre prions chez Saccharomyces cerevisiae ([PSI+], [URE3] et [RNQ+]) et Podospora anserina avec [Het-s]. On a eu du mal à attribuer des anomalies génétiques à ces agents lors de leur découverte, car elles allaient tellement contre le dogme ambiant ADN-ARN-protéine, qu'aucun auteur n'avait le courage de penser à contre-courant. C'est particulièrement vrai dans le cas de la levure.

Le prion de la levure [PSI+] correspond à une conformation modifiée de Sup35, l'une des protéines du complexe de terminaison lors de la traduction. Certains mutants de Sup35 permettent le franchissement de codons stop intempestifs (Sup) dans d'autres gènes, mais d'une manière récessive. Les souches [PSI+] présentent également un tel phénotype, car la terminaison de la traduction est alors déficiente à cause de la transconformation de la protéine, mais [PSI+] est dominant.

Le prion [URE3] affecte la répression catabolique par l'azote, ce qui signifie qu'en présence d'une abondance de la source préférée NH4+, les gènes du catabolisme d'autres sources d'azote, comme l'uréidosuccinate, sont réprimés. La protéine Ure2 régule ce catabolisme en se liant à, et en inhibant un activateur de transcription, Gln3. Le prion [URE3], supprime cette inhibition et élimine la répression catabolique.

Un autre prion de la levure a été déniché par homologie dans les banques de séquences de la levure. Il s'agit de [RNQ+] dérivant de Rnq1 (il est riche en asparagine et glutamine, N et Q).Son phénotype correspond à une fonction non essentielle, mais sa présence coïncide avec celle d'un autre prion, [PIN+] qui induit [PSI+]. C'est le premier exemple d'un prion intervenant dans la formation d'un autre prion.

Le prion [Het-s] de Podospora anserina étudié à Bordeaux (voir le Bulletin d'Août 2002 §92) entraîne une incompatibilité entre les noyaux du stade hétérocaryotique après fusion des hyphes de deux souches de sexe opposé.

L'hétéroroallélisme entre les 9 loci het déclenche la destruction des hyphes par un mécanisme encore inconnu. C'est le phénomène de "barrage" qui a longtemps été analysé à Orsay et qui correspond à l'accumulation d'hyphes mortes après les tentatives renouvelées de fusion. Il y a deux allèles au locus het-s, het-s et het-S. het-s code une protéine pouvant revêtir deux configurations différentes: HET-s se comporte comme un prion, alors que HET-s* ne le fait pas. L'allèle het-S code la protéine HET-S incompatible avec [Het-s], mais reste compatible avec les souches neutres [Het-s*].

La revue résume et analyse la littérature sur ce sujet en insistant sur les similitudes entre les mécanismes de formation et leur rôle potentiel dans l'évolution. En effet c'est un ensemble de mécanisme ajoutant de la souplesse aux régulations face à un environnement changeant et d'autres prions vont certainement être révélés à l'avenir au-delà de la péripétie de la vache folle.

Les animaux transgéniques

73. Des chercheurs coréens décrivent une production à haut niveau de l'interleukine 10 humaine dans le lait de souris.

Ils utilisent un gène mosaïque de b-caséine bovine avec son promoteur et d'IL-10 humaine. La teneur d'IL-10 la plus élevée obtenue est de 1620 mg de protéine par ml. BH Sohn et al.; Journal of Biotechnology 103 (12JUN03) 11-19.

Les Productions Microbiennes

 

74. Le groupe de Taddei a, depuis quelques temps, défendu avec brio l'idée que les stress stimulent les mutations, rendant les bactéries plus adaptables. Des cultures bactériennes exposées à un stress entraînant un blocage de la multiplication comme des carences, multiplient les mutations. On a dénommé ce phénomène: mutations "adaptatives", "de phase stationnaire" ou "inductibles par stress". Mais, jusqu'à présent, les études ont été effectuées sur l'Escherichia coli des laboratoires, et la levure de bière, bêtes de somme de la génétique microbienne et donc bien connues. C'était d'ailleurs judicieux de commencer par là. Mais les souches de laboratoire sont beaucoup plus homogènes que leurs congénères en liberté. Aussi fallait-il élargir les analyses aux souches naturelles pour confirmer la généralité du phénomène. C'est ce qu'on fait I Bjedov et al.; Science (31MAY03) 1404-1409. Voir également le commentaire clair de SM Rosenberg et al.; p.1382-1383.

Dans les cas les mieux analysés, il y a autant de mutations inutiles ou négatives, que de favorables. Ce qui émerge est que divers mécanismes contribuent à ces mutations et que certains sont différents de ceux rencontrés dans des cellules dites" en croissance". Sur trois souches étudiées les auteurs ont trouvé trois mécanismes majeurs différents. Ces trois mécanismes utilisent le capteur de dommage, ainsi que la protéine RecA aux rôles multiples (c'est l'équivalent de la protéine p53 des eucaryotes). Ces protéines activent le processus SOS de réparation des lésions d'ADN, mais seulement deux sur trois font intervenir le système RecBCD de réparation des coupures doubles-brins et exigent une stimulation effective du système SOS. Chacun des mécanismes fait intervenir dans la mutagenèse une ADN polymérase différente parmi les cinq existant chez E.coli, les polymérases à haute fidélité I ou II, ou la polymérase négligente Pol IV.

Mais l'activité est élevée non seulement aux sites endommagés, mais encore partout dans le génome d'où l'effet mutagène (on parle de mutagenèse non ciblée). On a donc considéré ce phénomène comme un effet gratuit et inconsidéré d'une modification de l'appareil de réplication. `

L'une des questions importantes est de savoir savoir si ce sont les mécanismes ont été sélectionnés pour conférer une adaptabilité supérieure, ou si ce sont les mutations elles mêmes (et seules) qui sont sélectionnées.

Le groupe de Taddei montre que la grande majorité des souches naturelles, et ils en ont analysé 787 du monde entier et de tous les milieux, présentent ce mécanisme en réponse à une carence nutritionnelle ou oxydative.

Ils soulignent, d'autre part, que le mécanisme diffère d'une bactérie à l'autre. L'importance de la réponse dépend de la niche écologique, plus que la phylogénie des souches au sein des E.coli. Celles de l'intestin des omnivores ont une réponse peu accusée, plus faible que celle de l'intestin des carnivores, par exemple. On constate par ailleurs, une corrélation négative entre l'activité des activités mutatrices permanentes (comme la réparation des misappariements et celles induites (celles étudiées ici). Les mutateurs permanents sont peu fréquents (quelques pour cent) dans l'échantillonnage examiné. Ils sont sélectionnés dans un environnement très changeant comme dans les souches pathogènes (où on a effectivement besoin sans arrêt de mutations) et dans des cultures à long terme.

Les auteurs utilisent une modélisation pour montrer que, bien qu'elles soient en général défavorables, les mutations inductibles favorisent l'adaptation des souches, notamment pour la dans de nouveaux milieux où la présence d'un tout petit nombre d'individus adaptés suffit à amorcer la colonisation.

75. Un certain nombre de sucres sont les sources de carbone préférées de Saccharomyces cerevisiae, qui peut également utiliser les substrats non fermentescibles comme éthanol, glycérol, lactate, acétate ou oléate. La préférence pour le glucose appelée répression catabolique intervient dans la synthèse coordonnée des enzymes de l'utilisation non fermentescible.

On a mis en évidence une série de complexes stimulateurs ou répresseurs agissant sur ces voies. On trouvera une revue sur ce sujet dans HJ Schüller; Current Genetics 43, n°3 (JUN03) 139-160.

Le complexe protéine kinase Snf1 (alias Cat1) avec sa sous-unité régulatrice Snf4 (alias Cat3) et ses sous-unités b alternatives Sip1, Sip2 ou Gal83 permet la dérépression d'un certain nombre de gènes en présence de fortes concentrations de glucose. Ce complexe désactive le répresseur Mig1, lié à la présence de glucose, en le phosphorylant. Ce répresseur intervient également dans la régulation de la respiration et, dans une certaine mesure, de la gluconéogenèse. L'article passe en revue les éléments régulateurs des gènes du métabolisme non fermentaire et des protéines qui les reconnaissent et interviennent dans les régulations avec leurs interactions respectives. Il examine également les évènements post-transcriptionnels impliqués comme la stabilité des messagers en présence de glucose.

76. La protéine BglF d'Escherichia coli est un capteur de sucres régulant l'activité de l'anti-terminateur de transcription BglG, en jouant sur sa phosphorylation en fonction de la présence de b-glucosides. BglF est une protéine liée à la membrane, alors que BglG est soluble. Les deux protéines sont présentes à l'état de traces dans la cellule. Le problème est celui de savoir comment elles font pour se rencontrer. On a pu suivre par divers moyens (hydridation à deux composants et surface plasmon resonance) pour, respectivement, identifier la possibilité et la réalité d'une association moléculaire de BglG à BglF) l'association des deux protéines, et leur localisation cellulaire par fusion de GFP à BglG.

BglG est membranaire et libérée en présence d'un b-glucoside. Si on empêche la phosphorylation des protéines Bgl par des mutations, on peut montrer que l'association BglG-BglF et le recrutement de BglG vers le capteur BglF requiert une phosphorylation, mais ne dépend pas des sites de phosphorylation sur les deux protéines. Il y a donc vraisemblablement pré-assemblage des deux composants de ce système en l'absence de stimulation et largage du régulateur en présence des b-glucosides. L Lopin et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 7099-7104.

77. On trouvera dans H Fukuhara; FEMS Yeast Research 3 (JUN03) 327-331 une revue sur l'effet Kluyver chez les levures. Cet effet est la dépendance de l'utilisation de certains sucres (notamment les oligosaccharides) par rapport à la respiration, la fermentation étant bloquée en l'absence de respiration. L'utilisation fermentaire du glucose persiste en présence de cet effet. Il dépend des sucres et des levures. Saccharomyces cerevisiae, dont le mode de vie dominant est fermentaire ne présente pas cet effet pour la plupart des sucres qu'elle peut utiliser. Il est dû à l'incapacité des transporteurs de ces sucres à satisfaire au haut débit indispensable à la fermentation (on ne récupère qu'une faible partie de l'énergie potentielle de ces substrats). Il faut cependant se souvenir que S.cerevisiae peut fermenter des sucres sans donner lieu à une croissance, alors que d'autres levures doivent manifester une croissance notable pour fermenter des sucres. Ce genre d'observations rend la définition de l'effet Kluyver plus difficile.

La revue discute si cette observation faite chez Kluyveromyces lactis est généralisable. Le clonage, ces derniers temps de nombreux transporteurs devrait faciliter les choses.

78. Les chercheurs du Nestlé Research Center avaient récemment identifié des protéines de surface des Lactobacillus johnsonii et Lactobacillus gasseri codées par deux gènes, apf1 et apf2, codant des constituants de la couche S périphérique et dénommées Aggregation-Promoting Factor. M Ventura et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (DEC02) 6172-6181. Ces protéines sont impliquées dans la conjugaison et l'auto-agrégation de Lactobacillus gasseri 4B2. Ces deux gènes sont indispensables, car il est impossible d'obtenir une inactivation des deux sans létalité. Par contre, la surexpression entraîne une modification de la forme cellulaire qui donne des cellules polymorphes en chaînes inextricables. I Jankovic et al.; Journal of Bacteriology 185, n°11 (JUN03) 3288-3296. Les auteurs ont réussi à déprimer la production en jouant sur le promoteur d'apf2. On obtient, alors, une filamentation sans cloisonnement, mais sans effet clair sur le phénotype d'agrégation.

79. AL de Boer et al.; Current Opinion in Chemical Biology 7 (APR03) 273-278, discutent des efforts réalisés pour inciter des cellules microbiennes à produire de nouveaux composés chimiques. Beaucoup de métabolites secondaires ont une structure modulaire, mais seule une petite fraction des structures potentielles a pu être révélée. La production de nouveaux composés non naturels est possible par les techniques de la génétique moléculaire éventuellement complétée par les dérivatisations chimiques.

Actuellement les efforts les plus conséquents portent sur les antibiotiques, mais aussi sur les caroténoïdes à côté des polyhydroxyalcanoates. La revue discute des approches récentes avec les synthèses combinatoires associant les gènes de plusieurs voies de synthèse, la combinaison de plusieurs domaines d'enzymes différentes (éventuellement modifiées par évolution dirigée) créant de nouvelles structure enzymatiques.

La production d'une nouvelle structure moléculaire au sein d'une famille suppose que la voie de production des précurseurs soit bien alimentée. Deux classes d'organismes existent de ce point de vue.

La première peut être représentée par les Streptomycètes qui possèdent des voies homologues de synthèses des polycétides. Si l'organisme est transformable, on peut facilement introduire des modifications dans cette voie pour obtenir le composé souhaité.

La seconde est celle où l'on introduit la voie de synthèse des précurseurs pour alimenter la production dans un hôte plus maniable. On a, ainsi, combiné les gènes de plusieurs organismes produisant des caroténoïdes dans une Escherichia coli naturellement non caroténogénique.

La production de beaucoup de métabolites secondaires dépend d'opérons, ce qui facilite le clonage et le transfert. Mais pour beaucoup de raisons, dont le criblage des producteurs puis leur utilisation, il faut obtenir une production très forte. Ceci suppose déjà une dose d'ingéniérie métabolique.

On utilise couramment des disruptions de gènes pour identifier leur fonction, mais cela peut également être utilisé pour réorienter des flux vers une nouvelle voie en créant un produit ou un précurseur, en principe intermédiaire dans la voie normale. Ainsi la disruption du gène pimD chez Streptomyces natalensis qui code une époxydase dans la voie de la pimaricine engendre une accumulation de 4,5-désépoxypimaricine qui est un nouvel antibiotique. La combinaison d'enzymes de différentes voies a été utilisée massivement pour produire des antibiotiques polycétides avec des patrons de glycosylation différents. Ainsi Streptomyces venezuelae (une espèce assez mal définie au sens où plusieurs souches industrielles affublées de noms protégés y sont probablement rattachées) produit quatre antibiotiques de ce type contenant tous de la D-désosamine comme seul sucre. La voie de production de ce sucre chez Str.venezuelae partage des étapes avec celle d'autres sucres affublant streptomycine et calicheamicine, produites respectivement par Streptomyces griseus et Micromonospora echinospora ssp. Calichensis. L'introduction des gènes strL et strM (de la synthèse du dihydrostreptose de Str.griseus dans des mutants KdesI de Str.venezuelae, qui possèdent une voie incomplète de synthèse de la D-désosamine, donne de nouveaux macrolides ornementés de L-rhamnose, cette fois. Ceci signifie que Str.venezuelae possède une transglycosylase éclectique, capable de transférer aussi bien le rhamnose que la désosamine. Ce qui n'est pas inattendu parmi les transglycosylases impliquées dans la synthèse des antibiotiques polycétides.

On peut cependant avoir des ennuis lors de la transglycosylation, car si le sucre souhaité est bien incorporé sur l'antibiotique, des enzymes de montage du squelette en sont gênées et donne un aglycone différent de celui attendu. Cela a été constaté chez le même mutant de Str.venezuelae ou une hydroxylase est gênée par la présence d'un aminosucre.

L'ingéniérie des caroténoïdes est facilitée par la nature colorée du produit qui facilite le criblage ses transformants et l'identification du produit. La revue discute des modifications auxquelles les auteurs ont participé.

80. Des chercheurs de l'IFREMER ont isolé un microorganisme sécrétant un polysaccharide très visqueux. C'est un Alteromonas macleodii subsp. fijiensis biovar. medioatlantica isolé d'une crevette d'un fumeur hydrothermal profond de la crête océanique médioatlantique. Des Alteromonas ayant des propriétés similaires ont déjà été décrits

Le polysaccharide comporte des sous-unités glucose, galactose, et acides glucuronique et galacturonique substitués par des pyruvate et acétate. G Raguénès et al.; Current Microbiology 46, n°6 (2003) 448-452.

81. Des chercheurs d'Utrecht, du TNO néerlandais et d'Unilever ont produit la peroxydase d'Arthromyces ramosus dans Aspergillus awamori, beaucoup mieux connu pour des productions industrielles. BC Lokman et al.; Journal of Biotechnology 103 (26 JUN03) 183-190.

La peroxydase d'A.ramosus est envisagée pour le blanchiment de la pâte à papier depuis 1990. C'est une enzyme glycoprotéique monomérique de 41 kDa. Elle comporte un protohème IX et montre une spécificité très large pour les donneurs de protons phénoliques et aniliniques. Il faut cependant en obtenir une production économiquement viable. Les Aspergillus sont tout indiqués, mais on ne possède que peu de données publiques sur la production de protéines à hèmes dans ces organismes et on sait que la production du noyau hème est limitante. Il semble qu'A.awamori soit capable de régler ce problème.

82. Le numéro de Juin de Currrent Opinion in Microbiology est un pot-pourri de revues sur l'utilisation des microbes dans l'environnement et dans l'industrie. Quelques unes de ces revues seront examinées plus en détail dans ce numéro et dans celui d'Août et Septembre.

Quatre des revues portent sur des outils potentiels fournis par les microbes et quatre autres sur des produits microbiens importants.

S Belkin; Currrent Opinion in Microbiology 6 (JUN03) 206-212 décrit des capteurs cellulaires bioluminescents et fluorescents permettant de détecter spécifiquement des polluants environnementaux, ainsi que d'autres molécules. Beaucoup de ces systèmes utilisent la dépression de la fluorescence en présence d'un polluant lésant la cellule. On utilise maintenant des systèmes basés sur les gènes de stress où on utilise les promoteurs de ces gènes commandant un gène reporteur. Il existe plusieurs fioritures sur ces reporteurs. On peut, d'ailleurs, faire reconnaître deux polluants différents avec des reporteurs fluorescents à des longueurs d'ondes différentes. Il existe également des microréseaux avec jusqu'à 700 souches recombinantes différentes reconnaissant autant de molécules (l'analyse est un peu plus développée au §118)

B Van den Burg; p.213-218 font le point sur les enzymes d'extrêmophiles (tolérant chaleur, salinité ou acidité). Le postulat est que les enzymes issues de ces organismes doivent tolérer ces sévices, ce qui n'est pas évident car la bactérie sait s'isoler du milieu, ou compense les lésions par un turn-over très rapide des protéines lésées. L'auteur discute des enzymes des thermophiles, halophiles, psychrophiles, alcaliphiles, acidophiles, piézophiles etc…. Pour l'instant on exprime les gènes potentiels dans Escherichia coli pour des raisons de commodité.

D Shallom et al.; p.219-228 se concentrent sur les hémicellulases. Ces enzymes sont extra-cellulaire par essence. Les hémicellulases contiennent des modules de fixation et des modules catalytiques. Ces deux fonctions sont assurées de façons différentes. Les auteurs décrivent les interactions entre ces enzymes et leurs substrats.

KA Gray et al.; p.229-235 décrivent les techniques de désulfuration des carburants fossiles et plus particulièrement des dibenzothiophènes par Rhodococcus erythropolis IGTS8 (alias R.rhodochrous).

Quatre enzymes sont nécessaires dont deux monooxygénases et une flavine réductase puis une désulfinase donnant, comme produit final, du 2-hydroxybiphényl et du sulfate. C'est la réductase qui est généralement limitante.

Des Paenibacillus sp. et Mycobacterium phlei thermophiles ont été essayés dans ce domaine à haute température. Pour l'instant l'activité catalytique est trop limitée, ce qui avait encouragé Enchira Biotechnologies à se lancer dans l'amélioration dirigée de ces enzymes (et à promouvoir la commercialisation des intermédiaires).On trouvera une analyse un peu plus complète au § pour la technique et au § pour les péripéties juridiques.

Y Shimizu; p.236-243 discute les avancées dans le domaine de la production de métabolites des microalgues. L'auteur traite surtout de la cyanobactérie tropicale Lyngbya majuscula productrice de nombreuses substances actives et notamment toxiques et ressemblant en cela aux Streptomycètes. La toxinogénicité des dinoflagellés comme Pfiesteria est encore en discussion car cette microalgue ne possède pas de polycétide synthase source des toxines.

T Ishige et al.; p.244-250 s'intéressent aux cires produites par des bactéries à partir d'alcanes et de produits d'oxydation des alcanes. L'estérification d'alcanols et d'acides alcanoïques permet d'obtenir des chaînes alkyls à moyennes et longues chaînes estérifient des acides alcanoïques de C14 à C22. Cette production est très similaire à celle des polyhydroxyalcanoates (PHAs) pour lesquels JM Luengo et al.; p.251-260 font le point sur l'état des lieux pour ces biopolymères et d'autres bioplastiques. Ces polymères sont construits à partir d'hydroxyacyl-CoA via différentes voies métaboliques.

Le talon d'Achille de ces productions (triple talon dans ce cas) est leur coût prohibitif dû à des conditions défavorables de production, au coût des substrats et à la difficulté de récupération. Le polymère s'accumule comme réserve carbonée quand d'autres carences comme celle en azote se manifestent. Du coup la prolifération est sérieusement ralentie. Les substrats utilisables sont encore coûteux, le glucose est exclu de ce fait. On peut tourner la difficulté en les faisant produire dans des graines. Reste alors la récupération qui est encore très difficile, voir les brevets qui se dénigrent mutuellement. C'est la raison pour laquelle ICI qui a commencé une production microbienne en 1982 a jeté l'éponge et a vendu la filière à Monsanto qui s'en est ensuite débarrassée en faveur de Metabolix qui publie en rafale des brevets sur tous ces points

Il faut se rappeler que c'est un français, M Lemoigne, qui a décrit pour la première fois, en 1926 dans le Bulletin de la Société de Chimie Biologique, le poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) chez Bacillus megaterium. Observation complètement oubliée jusqu'à sa résurrection en 1974. Depuis les PHAs ont fait bien du chemin, avec plus de 90 genres de microorganismes capables de les synthétiser identifiés. L'étude de ces synthèses a surtout été réalisée chez Alcaligenes eutrophus devenu, avec la gloire, Ralstonia eutropha, divers Pseudomonas dont in Pseudomonas oleovorans et P.putida.

A Steinbüchel; p.261-270 discute le potentiel de bioproduction de substituts de caoutchouc par des microroganismes, mais on ne connaît pas beaucoup de bactéries qui en sont capables. La revue compare de ces produits avec le cis-1,4-polyisoprène de l'hévéa qu'on produit actuellement à raison de 7 millions de tonnes par an, ce qui correspond à 40% du caoutchouc utilisé, le reste étant produit par synthèse artificielle (caoutchouc synthétique) qui ne reproduit pas toutes les propriétés des caoutchoucs naturels, ce qui explique que le rapport n'ait guère varié au cours des trente dernières années. La seule autre source de caoutchouc naturel, en dehors de l'hévéa, qui continue à régner en maître, est le guayule (Parthenium argentatum une composée), une plante semi-désertique qui a été utilisée pendant la seconde guerre mondiale quand les japonais se sont emparé du Sud-Est asiatique et de ses plantations d'hévéas. Il existe pourtant 2500 plantes produisant des caoutchoucs.

La revue discute des propriétés des élastomères à élasticité entropique et des caoutchoucs viscoélastiques. Les seuls biopolymères naturels qui se rapprochent des caoutchoucs naturels sont les PHAs à chaînes moyennes.

L'idée de cloner et exprimer des synthases végétales dans des bactériese n'est pas simple à réaliser. La revue essaye d'analyser les difficultés qui pourrait être rencontrées en se basant sur ce que l'on sait des polyoxoesters et polythioesters.

Il faudrait d'abord produire la partie isoprène par la voie du mévalonate et du méthylérythritol phosphate puis assurer la polymérisation de l'isoprène via une prényltransférase. Encore faudrait-il disposer de gènes de prényltransférases qui ne sont pas encore connus.

83. Une souche de levure capable de produire de l'éthanol à partir de xylose serait la bienvenue, car elle augmenterait la rentabilité commerciale du bioéthanol en partant de substrats meilleurs marché que les substrats usuels. Saccharomyces cerevisiae n'est pas capable d'utiliser ce pentose issu des hémicelluloses. Des chercheurs suédois et sud-africains ont obtenu une souche (TMB 3400) de S.cerevisiae capable d'utiliser le xylose par incorporation des gènes de D-xylose réductase (qui donne du xylitol), xylitol déshydrogénase qui convertit le xylitol en xylulose) et xylulokinase (conversion du xylulose en xylulose 5-phosphate), puis mutagenèse au hasard et sélection pour la croissance sur xylose. En effet des souches transformées antérieures, comme E.coli TMB 3001, où les gènes permettaient bien la production d'éthanol à partir du xylose, mais pas une croissance anaérobie sur ce pentose. La surexpression de la xylulose kinase est nécessaire. Les gènes utilisés pour la transformation sont ceux de Pichia stipitis. La croissance et la production d'éthanol n'atteignent cependant pas celle de Pichia stipitis CBS 6054, la meilleure utilisatrice connue du xylose. CF Wahlbom et al.; FEMS Yeast Research 3 (MAY03) 319-326. S.cerevisiae possède cependant déjà une faible activité D-xylose réductase et xylitol déshydrogénase.

84. Gary Strobel a publié une revue sur l'utilisation des endophytes pour la production de produits bioactifs. GA Strobel; Microbes & Infection 5 (MAY03) 535-544.

L'intérêt de cette étude est dans l'abord des recherches par une voie écologique, en analysant la biologie des plantes pour en déduire la présence probable et l'utilité des endophytes. Un des cas cités est celui des plantes poussant dans les torrents et donc fréquemment lésées mécaniquement et pourtant sans infections microbiennes plus fréquentes de ce fait. Au-delà de l'exemple classique du champignon endophyte Taxomyces andreanae de Taxus brevifolia producteur de taxol, on a, ainsi, isolé l'antifongique oocydine A produit par une Serratia marcescens sur la podostémacée vénézuélienne, Rhyncholacis penicillata.

Les Protéines et les Enzymes

 

85. Une partie du numéro de Current Opinion in Chemical Biology 7 (APR03) est consacrée aux développements de l'enzymologie à partir des données génomiques.

Parmi les plus de 400 génomes microbiens actuellement séquencés totalement ou partiellement, il n'en existe aucun dont la fonction de tous les gènes ait été établie (il en reste 12% chez Escherichia coli). Il existe, parmi ces fonctions non assignées, celles d'un certain nombre d'enzymes.

La détermination de la fonction fait l'objet de deux revues. PC Babbitt ; p.230-237 (voir §suivant ) qui s'intéresse à la description des fonctions moléculaires des enzymes et à la corrélation avec les séquences et les données structurales connues permettant d'en tirer des arguments fonctionnels utilisables. Elle prend des exemples dans plusieurs superfamilles montrant ce que l'on peut en tirer. Elle en déduit des modifications souhaitables dans la nomenclature EC classique. Voir le § suivant)

 A Osterman et al.; p.238-251 d'Integrated Genomics définissent une approche permettant d'identifier les gènes manquants d'enzymes connues dans une voie métabolique donnée. Les auteurs donnent des exemples avec les synthèses de co-facteurs.

Deux revues s'intéressent à l'évolution des activités enzymatiques en utilisant la comparaison entre les très nombreuses séquences maintenant connues.

La revue de JA Gerlt et al.; p.252-264 discute des fonctions naturelles ou réaménagées (en particulier par évolution dirigée) de la superfamille des enzymes à barillet (a/b)8, tandis que SD Copley; p.265-272, s'intéresse, elle, aux enzymes qui ont une fonction principale et une fonction secondaire, dont on peut inverser l'importance. C'est un problème intéressant qui permet d'aborder celui de l'évolution des fonctions lors des duplications.

Trois revues sont consacrées à l'ingéniérie des voies. La revue d'AL de Boer et al.; p.273-278) discutent des stratégies possibles (voir le § prodMicr). Le cas des voies de synthèse des polycétides est particulièrement intéressant, car on y trouve des enzymes qui, sur un squelette axial greffe des enzymes assurant les étapes successives des synthèses. On retrouve cette structure modulaire non seulement chez les polycétides-synthases mais encore chez les peptides synthases non-ribosomales. Les polycétides sont des métabolites secondaires construits par condensations répétées d'unités acétyle et malonyle donnant de nombreuses substances actives, dont des antibiotiques (tétracycline, daunorubicine ou érythromycine par exemple). Les polycétide-synthases non seulement permettent la condensation d'acyl-thioester, mais encore introduisent une variabilité dans les molécules en y incorporant divers monomères, ou en variant le degré de réduction des ß-carbonyles à chaque cycle de condensation. GF Liou et al.; p.279-284 (voir §plus loin ) soulignent les progrès réalisés dans la compréhension et la manipulation de la spécificité de ces enzymes (voir le Bulletin de Juin 2002 §97 par exemple), tandis que B Shen; p.285-295 (voir §87), insiste sur le fait que ces enzymes ont une diversité encore plus grande qu'on ne le pensait. L'identification de nouvelles polycétides-synthases devrait multiplier nos possibilités de synthèses combinatoires.

L'article de DA Campbell et al.; p.296-303 décrit comment marquer sélectivement les enzymes d'une famille au sein du protéome, ce qui permet de comparer deux situations d'une cellule.

86. La capacité de prédire les fonctions de protéines à partir de la séquence de leurs gènes est bien utile, mais parfois défaillante. Ce qui complique l'exercice est la proportion indéterminée, mais sûrement élevée, d'annotations erronées parmi celles qui figurent dans les catalogues. Une revue de PC Babitt; Current Opinion in Chemical Biology 7 (APR03) 230-237, examine les conséquences des données de la génomique fonctionnelle sur la nomenclature générale des enzymes.

On va bientôt se trouver face à un paradoxe qui est que nombre des structures tridimensionnelles vont être établies pour des protéines de fonctions incertaines. Il faudrait résoudre ce problème, en étant capable de déduire ces fonctions des séquences et des données structurales connues. La revue décrit des tentatives récentes de corrélations à grande échelle.

Dans le système EC, les enzymes sont dénommées selon les transformations qu'elles permettent de réaliser avec un code à quatre nombres (voir http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme). Il correspond à une hiérarchie de classifications fonctionnelles : le premier nombre décrit une fonction générale (hydrolase, transférase, isomérase, etc…), le second raffine la définition et ainsi de suite. Dès le deuxième nombre, la signification varie au sein des six principales classes. Pour les oxydoréductases (classe 1), le second nombre indique le substrat alors que pour les isomérases (classe 5) ce sont les différents types d'isomérases qui sont spécifiés (épimérase, racémases, etc).

Il est adopté universellement, mais il commence, maintenant, à rencontrer des difficultés. Il suppose en effet une description linéaire sans alternative. Il ne prend pas en compte qu'une protéine puisse avoir plusieurs fonctions ou que ce soient des protéines multimériques qui assurent une fonction. Son principal défaut est de ne fournir aucune indication sur le mécanisme sous-jacent avec l'association potentielle avec une séquence ou une structure. Ceci est lié au fait que ce système a été bâti avant que les séquences soient disponibles.

Mais il n'est pas si mauvais que cela, au moins quand les similitudes de séquences sont élevées. Des variations dans le quatrième des nombres du code sont très rares au-dessus de 40% de similitude. Il y a cependant des surprises: ainsi une mélamine déaminase et une atrazine chlorohydrolase ont des séquences identiques à 98% et des identités de séquence supérieures à 40% donnent des enzymes à fonctions générales de différentes classes, alors que des identités de séquences souvent faibles correspondent à une classification identique. Les séquences des o-succinylbenzoate synthases chez différentes bactéries sont dans ce cas. On conserve, cependant, ce seuil de 30-40% comme une limite utile.

Le système EC souffre de deux défauts: il regroupe des protéines structuralement différentes, parce qu'elles sont fonctionnellement semblables et, inversement, sépare des enzymes structuralement similaires, car fonctionnellement différentes.

On observe le premier cas avec l'enzyme lactonisant le muconate (MLE) et l'enzyme correspondant pour le carboxymuconate (CMLE). Ces deux enzymes de la voie du  b-cétoadipate interviennent respectivement dans les ramifications catéchuate et protocatéchuate de cette voie, et ne diffèrent donc que dans le quatrième nombre qui correspond, dans ce cas, à la spécificité de substrat. Leurs fonctions est bien décrite par le code EC. Mais on s'est rapidement aperçu que ce sont des protéines entièrement différentes, dans leur séquence comme dans leur structure. Elles sont manifestement le résultat d'une convergence évolutive. On connait maintenant plusieurs autres exemples et d'autres sont à venir.

Dans le second cas, on peut citer les superfamilles à barillet (b/a)8 (TIM barrel) qui contiennent des enzymes n'ayant même pas le premier nombre en commun. (voir http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/FAM-EC/).Les FMN-oxydoréductases/PP binding proteins comportent des enzymes représentant quatre des six classes de la nomenclature EC.

L'auteur indique quelques unes des tentatives de régler ces problèmes. Tous reposent sur une interprétation de l'évolution. Il semble qu'il y ait peu de cas où la conservation du substrat ait entraîné une conservation du site reconnaissant le substrat. Inversement on semble avoir retrouver beaucoup plus de cas où c'est la structure associée à une réaction chimique (ce qui ne signifie pas que la réaction globale soit la même) qui est conservée. Ceci a été étudié dans les superfamilles des œnolases, crotonases, haloacides déhalogénases, et amidohydrolases. Il apparait qu'une description basée sur la fonction générale est peu utile pour une prédiction de fonction. Il faudrait, au sein d'une superfamille, identifier les caractéristiques structurales conservées à partir des alignements de séquences et de la structure. Il faudrait, ensuite déduire les capacités catalytiques des membres les mieux connus et déterminer les éléments conservés. La correspondance structure/fonction peut alors être déterminée. c'est ce que l'on a réalisé récemment pour les œnolases (voir JA Gerlt et al.; Current Opinion in Chemical Biology 7 (APR03) 252-264).

87. Les polycétide synthases (PKSs) sont passionnantes car elles permettent d'engendrer une multitude de structures avec un nombre limité de fonctions catalytiques d'une façon parfaitement contrôlée. Les produits sont intéressants mais aussi les enzymes par elle-mêmes.

Il existe trois types de PKSs connues. Le type I est constitué d'enzymes multifonctionnelles organisées en modules dont chacun comporte ce qui est nécessaire à un cycle d'élongation du polycétide. C'est le cas de la désoxyérythromycine B synthase. Le type II est constitué de complexes multienzymatiques portant une seule activité itérative permettant la synthèse de polycétides aromatiques, souvent polycycliques, par exemple.

Les PKSs sont probablement dérivées des synthèses d'acides gras et les PKSs sont donc apparentées sur le plan architectural et mécanistique. Les PKS de type I possèdent de multiples sites catalytiques sur un même polypeptide, tandis que les type II possèdent un site sur chaque peptide. Types I et II peuvent comprendre un ou plusieurs modules où chacun de ces modules comprend une cétosynthase (KS), participant à l'élongation, une protéine transporteur d'acyles (ACP), avec un bras flexible à thiol sur lesquels les intermédiaires sont accrochés et une acyle transférase qui transfère les précurseurs acyl-CoA sur l'ACP.

Les PKSs de type III, ou chalcone synthase-like PKSs, sont des enzymes homodimériques qui sont des enzymes condensantes itératives indépendantes des ACPs et agissent directement sur l'acyle CoA.

Tous les trois types condensent les précurseurs acyl-CoA par des décarboxylations séquentielles et la liaison C-C est réalisée grâce au domaine (pour le type I) ou la sous-unité (pour les types II et III) cétoacyle synthase.

Les modules catalytiques peuvent contenir des enzymes comme des b-cétoréductase (KR), qui réduit stéréospécifiquement les b-cétones en hydroxyles; une déshydratase (DH), éliminant l'eau de l'intermédiaire b-hydroxy et une œnoyl réductase (ER) qui hydrogène stéréospécifiquement l'oléfine terminale. Ces enzymes peuvent intervenir à plusieurs reprises au cours du cycle catalytique.

 La revue de B Shen; Current Opinion in Chemical Biology 7 (APR03) 285-295 s'intéressent au fonctionnement des polycétides synthases et à leur variété, et celle de GF Liou et al.; p.279-284, se consacre surtout à la sélectivité des briques de l'édifice des polycétides. Il est, en principe, possible de manipuler la composition du "polymère" en jouant sur a disponibilité des précurseurs, ou sur leur incorporation. Les deux stratégies ont été utilisées. La première joue avec les pools d'acyl-CoA, tandis que la seconde impose de jouer avec les PKS elles-mêmes.

89. Des résultats récents sur les fonctions secondaires enzymatiques ("promiscuity") ou non des enzymes, et les causes de leur multifonctionnalité sont traités dans la revue de SD Copley; Current Opinion in Chemical Biology 7 (APR03) 265-272. L'auteur qualifie cette ambiguïté de "travail au noir". Le nom d'une enzyme comme la N-acyl amino acid racémase d'Amycoplaptosis est, ainsi, trompeur car c'est une fonction secondaire, le rôle principal de l'enzyme se situe dans la synthèse de l'o-benzoylsuccinate dans la voie de la ménaquinone. Cela pose les problèmes de nomenclature évoqués dans la revue de PC Babbitt (voir §86).

Le site actif est souvent utilisé dans beaucoup de cas, mais d'autres sites peuvent être utilisés, d'autres activités profitant de la structure de la protéine.

La tyrosyl tARN synthétase mitochondriale de Neurospora crassa a manifestement une fonction secondaire dérivant de la fonction catalytique. Elle charge non seulement le tRNATyr, mais replie les introns de groupe I en structures auto-épissables. Ceci est lié au fait que le noyau catalytique de ces introns ressemblent beaucoup au tRNATyr. Cette capacité est liée à la présence d'une extension N-terminale qui stabilise une structure permettant l'interaction avec l'intron.

La phosphoglucose isomérase (PGI) intervient dans l'interconversion du glucose 6-phosphate en fructose 6-phosphate au cours de la glycolyse et la gluconéogenèse. Chez les mammifères, elle est sécrétée par plusieurs types cellulaires a, de ce fait, une fonction secondaire de médiateur de différenciation et de maturation (DMM), de neuroleukine et d'autocrine motility factor (AMF). Le récepteur d'AMF et de DMM est une glycoprotéine. Cette fixation sur le récepteur peut être bloqué par l'érythrose 4-phosphate et le 6-phosphogluconate qui ne créent, cependant, aucun remodelage au voisinage du site actif de l'enzyme. Des mutations dans le site actif de l'enzyme font disparaître le rôle d'AMF. Le site actif est donc impliqué dans ces fonctions secondaires. Pourtant les PGI bactériennes, qui ont un site actif similaire, n'ont pas d'activité AMF.

Dans le cas de la géphyrine, la fonction secondaire tire parti de particularités structurales de la protéine. Celle-ci est ancrée à la membrane au niveau post-synaptique du système nerveux et participe à la neurotransmission au cytosquelette. Elle immobilise directement le récepteur de la glycine et indirectement les récepteurs de type A de l'acide g-aminobutyrique. Elle se lie également à d'autres protéines comme profiline, tubuline, collybistine et les chaînes légères de la dynéine.

La géphyrine est une protéine de fusion avec deux domaines correspondant aux enzymes MogA et MoeA d'Escherichia coli qui participent à la synthèse du co-facteur molybdène de toutes les enzymes à molybdène. Elle participe effectivement à cette synthèse chez l'homme et la souris. Sa fonction post-synaptique est manifestement indépendante de son activité enzymatique. En réalité la superstructure hexamérique de la protéine facilite le recrutement d'autres protéines. On n'a pas encore repéré ces sites distribués sur la protéine, sauf dans le cas du récepteur de la glycine. Comme il existe des épissages alternatifs de la protéine cela doit donner des variantes intéressantes.

Enfin la fonction apoptotique du cytochrome c de l'espace intermembranaire de mitochondrie n'a rien à voir, ni avec la fonction de transfert d'électrons, ni avec la structure de la protéine. C'est simplement un signal perçu dans le cytosol qui indique qu'il arrive quelque chose de grave à la mitochondrie.

La polyvalence (promiscuity) de certaines enzymes avec une large spécificité de substrats ou de produits est parfois étonnante. C'est ainsi que les deux sesquiterpène cyclases du sapin de Vancouver (Abies grandis), permettent la production respective de 34 et 52 sesquiterpènes différents à partir du même substrat, l'(E,E)-farnésyl diphosphate. Ce sont autant de cocktails de défenses contre les phytopathogènes et les herbivores.

Les séralbumines sont des protéine très bizarres dans ce domaine car elles possèdent de multiples activités enzymatiques (certes pas très efficaces), alors que ce ne sont pas des enzymes au départ. Elles catalysent l'oxydation de l'oxyde nitrique ainsi que la formation des S-nitrosothiols, la destruction des prostaglandines et l'hydrolyse du pesticide de type carbamate carbaryl pour lequel il n'y a manifestement pas pu avoir de pression positive de sélection. Ce genre de polyvalence peut être un point de départ pour une évolution dirigée vers des fonctions précises et beaucoup plus efficaces, notamment contre des polluants anthropiques. C'est ce que font, naturellement, les cytochromes P450 pour le compte des organismes qui les produisent.

La revue souligne que l'adaptation à différents substrats est liée à la structure autour du site actif avec des parties rigides qui orientent le substrat face au site actif, et flexibles qui permettent d'accommoder des molécules de formes différentes. En ce qui concerne la polyvalence des réactions catalysées, elle souligne que les sites actifs sont bourrés de groupements réactifs avec nucléophiles, électrophiles, acides, bases et cofacteurs.

Le fondement de cette promiscuité est probablement qu'une enzyme qui ne sait réellement faire qu'une seule chose est impossible à monter. Elle fera toujours quelque chose d'autre par mégarde. De plus, il n'y a vraiment rien qui entraîne une contre-sélection de telles activités, tant qu'elles ne consomment, ni ATP, ni équivalents réducteurs, comme c'est le cas des hydrolyses.

Le cas le plus fréquent de polyvalence de substrat est rencontré avec une même réaction pratiquée sur des analogues du substrat principal. La championne dans ce domaine est la méthane monooxygénase qui hydroxyle plus de 150 substrats en dehors du méthane.

La polyvalence de la réaction catalysée est liée à une maîtrise limitée des réactifs, ce qui permet plusieurs réactions en différents sites comme c'est le cas pour la toluène 4-monooxygénase qui hydrolyse préférentiellement le toluène en ortho, mais peut donner plusieurs autres produits en même temps. Cette spécificité peut être obtenu pour des enzymes plus strictes par de mutations ponctuelles dans le site actif comme cela a été montré pour la lipoxygénase de soja.

Un autre type de polyvalence est celui où l'enzyme donne des produits apparemment différents avec le même site actif. C'est le cas de la thymine hydroxylase qui catalyse trois oxydations successives du 5-méthyle de la thymine, mais assure également des époxydations, oxydations de thioethers en sulfoxides et sulfones, hydroxylations de liaisons non activées C-H et l'oxydation de la méthylamine. C'est la plupart du temps le cas d'enzymes à fer.

Il y a enfin, le cas des enzymes qui utilisent les acides aminés du site réactif dans des mécanismes différents.

La prédiction de ce travail au noir est difficile. Une des clés est le patron d'expression dans des tissus ou à des phases où l'enzyme étiquettée n'a rien à faire. Ainsi la maléylacétoacétate isomérase humaine est exprimée dans de nombreux tissus alors que les autres enzymes de dégradation de la tyrosine sont confinées au foie et et aux reins. Elle a donc une autre fonction.

90. La structure cristalline d'une enzyme bifonctionnelle d'un type particulier, la 4-hydroxy-2-cétovalérate aldolase/acétaldéhyde déshydrogénase d'un Pseudomonas. C'est une enzyme constituée de deux polypeptides qui sont interdépendants, l'aldolase étant inactive en l'absence de la déshydrogénase et cette dernière étant très peu active à l'état isolé. Cette observation indique, d'ailleurs, que les deux sites actifs sont distincts. Cette enzyme est impliquée dans la dégradation bactérienne de composés aromatiques toxiques au niveau des deux dernières étapes du méta-clivage du noyau aromatique du catéchol, du 4-hydroxy-2-cétovalérate au pyruvate et à l'acétyl-CoA via l'acétaldéhyde intermédiaire. Cette structure permet la canalisation du produit de la première réaction directement vers le site responsable de la seconde, sans risque de le voir s'égarer où il ne faut pas. La fixation de NAD+ (qui va récupérer les électrons lors de la déshydrogénation) sur la déshydrogénase entraîne l'ouverture d'un canal de 29 Å de long qui va permettre la communication entre les deux sites, mais deux barrières existent, entre les deux sites actifs, ce qui indique qu'il y a une régulation intermédiaire. BA Manjasetty et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 100 (10JUN03) 6992-6997.

91. Une xylanase dépourvue d'activité cellulasique issue d'Acrophialophora nainiana, un champignon thermotolérant, a été purifiée et caractérisée par des chercheurs brésiliens. Deux de ces enzymes avaient été identifiées et l'utilisation de l'une d'entre elles dans la délignification dans le procédé Kraft et la réduction de la viscosité de la pâte à papier a été décrite. C'est un troisième xylanase à Topt de 55° et pHopt de 6,5 qui est décrite.

92. On trouvera dans S Kahl et al.; Microbiology 149 (JUN03) 1475-1481, une technique d'isolement d'activités de type dioxygénases de cycles aromatiques. Ces enzymes coupe le cycle aromatique et fixent deux hydroxyles sur deux carbones voisins. Elles sont très éclectiques car certaines peuvent même s'attaquer au trichloréthylène qui n'a rien d'aromatique. L'intérêt de ces enzymes est leur utilisation dans l'obtention de synthons chiraux ou la dégradation de polluants aromatiques.

La technique consiste à utiliser des déterminants fonctionnels consensus de ce type d'enzymes et à en extraire des amorces pour l'amplification. Comme on sait que c'est la seule grande sous-unité a (plus particulièrement sa partie C-terminale) qui est importante pour la spécificité de substrat et la nature du produit, c'est elle que l'on a choisi pour l'identification.

Le groupe de gènes bphA de Burkholderia LB400, bien connue, a été modifié pour permettre l'insertion des gènes ainsi pêchés. Il est, en effet, facilement exprimé de façon hétérologue (dans d'autres organismes). Les auteurs ont ainsi pu créer des dioxygénases aromatiques chimériques ayant des caractéristiques originales et exploitables.

On peut donc partir d'organismes identifiés ou pas ou de mélanges d'acides nucléiques extraits du milieu.

93. On vient de montrer que les catalases ont, certes, des propriétés antioxydantes mais, sous UV-B, engendrent, bien au contraire, des oxygènes réactifs. DE Heck et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (20JUN03) 22432-22436. Cela a été montré dans des kératinocytes mais c'est un phénomène général. Il s'agit probablement d'une capture de l'énergie, et des enzymes antioxydantes autres interviennent pour neutraliser les radicaux réactifs.

L'Agroalimentaire

 

94. Les exopolysaccharides (extra-cellulaires ou EPS) des bactéries lactiques (LAB) sont très appréciés, car ne soulevant pas l'ire des puristes. De fait l'onctuosité, c'est-à-dire la texture et la rhéologie des yaourts, leur est due. De plus on peut leur attribuer des effets positifs sur la santé si on le souhaite, car ils persistent plus longtemps dans l'intestin. Mais faute d'une production suffisante de ces polysaccharides, on se contente d'augmenter la teneur en lipides, sucre, protéines ou stabilisateurs comme les pectines, amidons, alginates ou gélatine dans les aliments.

On cherche donc à sélectionner des souches et des procédés pour améliorer leur production, aussi bien quantitativement que qualitativement, en modifiant leur structure pour un objectif donné. Il faut cependant comprendre leurs effets après incorporation à un produit.

Une revue sur ces synthèses et leurs améliorations est parue avec AD Welman et al.; Trends in Biotechnology .21 (JUN03) 269-274. On peut également lire l'article de F Levander et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (FEB02) 784-790 et la revue d' IC Boels et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (FEB03) 1129-1135 commentés dans le Bulletin de Mars 2002 §132, et Mars 2003 §122.

Les EPSs bactériens sont des polysaccharides à longues chaînes ramifiées comportant glucose, galactose et rhamnose en différentes proportions. Il s'agit, soit d'homopolysaccharides (cellulose, dextrane, mutane, alternane, pullulane, levane et curdlane), soit d'hétéropolysaccharides (gellane et xanthane). Ils sont bien libérés de la cellule et faciles à récupérer, ce qui les distingue des polysaccharides sécrétés, mais restant fixés sur la paroi.

Les homopolysaccharides comportent soit des glucoses, soit des fructoses. Les hétéropolysaccharides des bactéries lactiques sont très différents les uns des autres. Ils sont basés sur des répétitions d'oligosaccharides de 3 à 8 monosaccharides et leurs tailles vont de 40 à 6 x103 kDa.

Les liaisons b(1,4), comme celles observées chez Lactococcus lactis subsp. cremoris B40, donnent des chaînes plus rigides que celles avec des liaisons a(1,4) ou b(1,3) et les liaisons a sont en général plus flexibles que les liaisons b.

La divergence entre les voies cataboliques (consommation) et anaboliques (synthèses) du glucose se place, on le sait, respectivement au niveau des glucose 6-phosphate et glucose 1-phosphate , interconversion assurée par la phosphoglucomutase. Le glucose-1-phosphate est converti en UDP–glucose et dTDP–glucose par l'UDP–glucose pyrophosphorylase et la dTDP–glucose pyrophosphorylase. La conversion du galactose en glucose-1-phosphate a lieu via le galactose-1-phosphate, lorsque la voie de Leloir est présente, ce qui fait, dans ce cas, qu'on peut utiliser la totalité du lactose.

L'assemblage des monosaccharides dans les monomères oligosaccharidiques est assuré par plusieurs glycosyltransférases greffées à la face cytoplasmique de la membrane via un transporteur de lipides isoprénoïde en C55. On entre ensuite dans les supputations. On admet que la molécule est retournée vers la face périplasmique de la membrane par une "flippase". La longueur de la chaîne est alors régulée par l'intervention d'enzymes poursuivant la polymérisation. Ce principe est conservé chez de nombreuses bactéries Gram+.

Les gènes codant la synthèse des EPS peuvent être portés par des plasmides comme chez Lactococcus lactis et Lactobacillus casei, ou par le chromosome, comme chez toutes les bactéries lactiques thermophiles étudiées jusqu'à présent. Le locus de synthèse des EPS comprend 13 gènes (epsA à epsM) chez S. thermophilus Sfi6. Lactococcus lactis NIZO B40 porte 14 gènes (epsRXABCDEFGHIJKL) commandés par le promoteur en amont d'epsR) sur un plasmide de 40 kb. On retrouve cette organisation avec 14 gènes, cette fois, chez Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

On admet qu'une production "rentable" d'EPS et de l'ordre de 10-15 g/l, mais la plus forte production "naturelle" connue est celle d'un Lactobacillus rhamnosus avec 2,8 g/l. Vous verrez, plus loin qu'on en est encore très éloigné.

Il faut dire que l'efficacité énergétique des bactéries lactiques laisse beaucoup à désirer. Heureusement, le métabolisme énergétique est pratiquement découplé entre métabolisme de base et synthèses. Le principal produit de la conversion du glucose est l'acide lactique obtenu grâce à des lactate-déshydrogénases (LDH), et on a donc cherché à limiter cette production, qui est d'ailleurs inhibitrice de la croissance. On a déjà utilisé cette stratégie pour obtenir une surproduction de produits divers allant de l'alanine à l'éthanol ou l'acétoïne (aromatique) le 2,3-butanediol, etc…chez Lactobacillus plantarum, en inactivant la L-LDH et la D-LDH. Mais il faut alors se méfier des conséquences sur le potentiel redox des cellules. Cela devrait marcher pour les EPS, si on peut rétablir, grâce une NADH oxydase le rapport NADH:NAD+ indispensable. Cela a été réalisé chez Lactococcus lactis avec le promoteur nisA commandant le gène de la NADH oxydase de Streptococcus mutans.

Mais on se heurte, alors, à une deuxième objection de la bactérie qui se plaint de ne plus avoir assez d'ATP, vu la réduction du flux dans la voie glycolytique. Il va donc falloir trouver un moyen de rétablir ce flux, bien qu'il ne débouche plus ou peu sur la conversion du pyruvate en lactate. Il vaudrait même mieux que l'ATP soit en excès par rapport aux besoins.

On peut donc essayer de découpler la voie de Leloir de la glycolyse, le glucose du lactose servant aux besoins énergétiques et le galactose à la synthèse des EPS. On peut aussi bien envisager l'inverse et le galactose utilisé directement pour la cellule par la voie du tagatose (remplacez glucose par galactose et fructose par tagatose dans la glycolyse) et le glucose pour les EPS,… quand une cellule possède cette voie. Un autre point d'attaque peut être l'enzyme de Leloir, l'UDP-galactose-4-épimérase, car l'UDP-galactose est indispensable à la production d'EPS chez L.casei .

Enfin on peut espérer des gains en jouant sur les glycosyltransférases, ce qui a été montré mais avec des effets limités, chez L.lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus et L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

On voit donc que l'inefficacité métabolique des bactéries lactiques est un frein technologique, comparé à ce qui se passe pour les producteurs aérobies comme Xanthomonas campestris pour les xanthanes par exemple. Il n'est pas facile à lever tant qu'on ne saura pas analyser quantitativement le métabolisme de ces bactéries, ce à quoi on s'acharne actuellement. Mais la possibilité de jouer sur la structure des EPS, est séduisante, notamment en jouant sur la spécificité des glycosyltransférases, mais cette approche est encore très théorique, et on a même démontré qu'elle est peut-être impossible chez Lactobacillus sake 0-1 dont la composition des EPS est constante quelle que soit la source de carbone utilisée.

95. Les bactéries lactiques produisent toutes sortes de glycosyltransférases et fructosyltransférase donnant des polymères de glucose ou de fructose à partir du saccharose (sans besoin de co-facteurs d'ailleurs). Une particularité intéressante est que ces enzymes permettent d'obtenir des oligosaccharides à différents degrés de polymérisation quand des accepteurs de glucose ou de fructose comme le maltose ou le lactose sont ajoutés au saccharose. Les glucosyltransférases utilisées dans les productions industrielles ont été beaucoup étudiées, particulièrement celles qui permettent la production de dextranes (dextrane-sucrase) ou d'alternane (alternane-sucrase) par les Leuconostocs.

L'inulosucrase de Leuconostoc citreum est une fructosyltransférase anormale car elle est plus grosse que les autres. Elle présente par ailleurs des caractéristiques bizarres avec un transfert très faible de fructose sur maltose et lactose. Le polymère synthétisé ressemble à l'inuline avec des liaisons glucosidiques ß(2,1). Le gène de l'inulosucrase de Leuconostoc citreum CW28, islA, a été cloné, séquencé et exprimé chez Escherichia coli. Des chercheurs mexicains montrent que c'est une fructosyltransférase insérée dans une glucosyltransférase. V Olivares-Illana et al.; Journal of Bacteriology 185, n°12 (JUN03) 3606-3612. La partie N-terminale de l'inulosucrase ressemble à la région variable des glucosyltransférases, son domaine catalytique est bien celui d'une fructosyltransférase et son domaine C-terminal correspond à la partie liant les glucanes d'une alternane-sucrase (une glycosyltransférase). C'est une enzyme chimérique naturelle où le domaine catalytique d'une fructosyltransférase s'est substitué à celui d'une alternane-sucrase ressemblant à celle de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355 .

96. Des chercheurs canadiens décrivent une technique pour détecter les gènes de glycosyltransférases dans le groupe de Lactobacillus casei. Ces enzymes permettent de produire les exopolysaccharides (voir le §). La technique repose sur des amorces particulières permettant de capter des séquences relativement éloignées du consensus, avec une séquence consensus associée à des séquences dégénérées. C Provencher et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3299-330.

La technique a été utilisée sur 44 souches commerciales de Lactobacillus rhamnosus, L.casei, Lactobacillus zeae et Streptococcus thermophilus.

Les gènes impliqués dans la synthèse des exopolysaccharides ont été caractérisés chez Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp.cremoris et quelques Lactobacillus.

97. La transamination des acides aminés (ablation, ou greffe du groupement amine à partir d'une molécule donatrice) est la première étape de leur dégradation et la dernière de leur synthèse. C'est, en effet, une réaction réversible catalysée par les aminotransférases. Les transaminases aminent donc les céto-acides.

Des chercheurs de l'INRA à Jouy montrent que Lactococcus lactis pilote ses pools d'acides aminés, lors de sa croissance dans le lait, grâce à une régulation par CodY de deux aminotransférases (AraT et BcaT). Ces deux transférases, qui avaient été caractérisées par le même groupe, sont responsables de la dégradation de l'isoleucine en excès et sont impliquées dans le métabolisme des acides aminés ramifiés et aromatiques. L'isoleucine est, en effet inhibitrice, de la croissance. Cette inhibition est due à CodY, un répresseur transcriptionnel pléïotrope, qui réprime le système protéolytique alimentant la bactérie en acides aminés. Cet inhibiteur a été caractérisé par homologie avec celui de Bacillus subtilis qui intervient sur l'opéron de la dipeptide perméase (dpp) ainsi que plusieurs gènes de dégradation des acides aminés, comme le groupe l'avait antérieurement montré. E Guedon et al.; Molecular Microbiology 40 (JUN01) 1227-1239.

98. Les voies d'utilisation du lactose chez les bactéries lactiques sont assez variées. Chez les Lactococcus et quelques souches de Lactobacillus casei, l'importation du lactose utilise un système de phosphotransférase dépendant du phosphoenolpyruvate avec, en aval, un système de phospho-ß-galactosidase. Les gènes sont tous portés par un plasmide.

 Le système de lactoperméase de Streptococcus thermophilus débouche sur une ß-galactosidase se retrouve chez Lactobacillus bulgaricus et Leuconostoc lactis, avec des gènes chromosomiques chez S.thermophilus et L.bulgaricus, alors que la ß-galactosidase de Leuconostoc lactis est codée par un plasmide. On peut observer, par ailleurs, des souches de Lactococcus lactis ou L.bulgaricus possédant ß-galactosidase et phospho-ß-galactosidase.

Chez S.thermophilus et L.bulgaricus, les gènes d'importation (lacS) constituent un opéron avec le gène de la ß-galactosidase en aval. Chez Leuconostoc lactis et Lactobacillus sake, cette ß-galactosidase est codée par deux gènes partiellement recouvrants, lacL et lacM, et aucun opéron lactose n'est décelable. Les gènes lacS et lacLM sont séparés, chez Leuconostoc lactis, par 2 kb contenant une séquence d'insertion.

Les gènes d'utilisation du lactose et du galactose de Lactobacillus helveticus, un starter thermophile, ont été séquencés. MG Fortina et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3238-3243. Leur organisation est inusuelle.

Les gènes lacLM (codant la ß-galactosidase) sont orientés de façon divergente par rapport au gène régulateur lacR et du transporteur lacS. On trouve, en aval de lacM, galE qui code une UDP-galactose 4 épimérase dans la même orientation que lacM. lacR est séparé de lacS en aval par 2kb de débris d'une autre perméase (lacS'). lacL, lacM et galE constituent un opéron transcrit en présence de lactose à partir du promoteur en amont de lacL. En présence de glucose et galactose, galE est transcrit, probablement de façon permanente à partir de son promoteur.

99. La biodisponibilité des minéraux dans le pain peut être améliorée par la panification. Si la fermentation par la levure minimise les effets défavorables des acides phytiques, la panification au levain permet de mieux utiliser magnésium, fer et zinc présents dans la farine, comme le montrent des chercheurs auvergnats. HW Lopez et al.; Nutrition 19 (JUN03) 524-530.

La vraie panification au levain est encore utilisée par la boulangerie de luxe, mais nécessite de nombreuses manutentions et entraîne une nette irrégularité des résultats, ce qui est contraire à tous les canons de la boulangerie moderne. Cette fermentation est essentiellement l'œuvre de bactéries lactiques.

Les différentes étapes de la préparation traditionnelle du pain au levain sont les suivantes. On prépare un levain chef en prélevant sur une fournée 5 à 10 kilogrammes de pâte. On ajoute, à ce levain chef, de la farine et de l'eau de façon à doubler ou tripler son poids. Une fois pétri, ce levain est dit "rafraîchi" et appelé levain de première. On le laisse fermenter 6 à 7 heures. On lui rajoute eau et farine, on le "rafraîchit" donc, et il devient alors un levain de seconde. On le laisse encore fermenter pendant 4 à 5 heures. Un dernier "rafraîchissement" en fait un "levain de tout point". Une à deux heures de fermentation finale en font un levain utilisable qu'on incorpore à une pâte.

La mie de tels pains est très serrée et a un goût acide prononcé qu'on peut très bien recréer artificiellement par l'ajout à un pain normal d'acide lactique, ce que font d'ailleurs certains boulangers.

Les Pré- et Probiotiques

100. On vient de montrer que les fructooligosaccharides provoquent une stimulation des lymphocytes B des plaques de Peyer de l'intestin grêle. Ils n'ont, cependant, pas d'effet sur les lymphocytes T. Ils n'ont donc pas seulement un effet dans le gros intestin. N Manharrt et al.; Nutrition 19 (JUL-AUG03) 657-660.

101. Les bifidobactéries sont une composante importante du gros intestin humain et elles se régalent des carbohydrates que nous ne sommes pas capables d'utiliser. Certains pensent qu'il faut renforcer cette population et donc d'abonder notre alimentation en de tels carbohydrates. C'est le cas des fructooligosacharides qui sont actuellement commercialisés. Ce sont des polymères de 2 à 60 fructoses enchaînés par des liaisons b-2->1 avec un unique glucose à l'extrémité non réductrice.

La longueur de la chaîne dépend du mode de production. Ceux produits à partir de l'inuline (2-30 fructoses) résultent d'une hydrolyse partielle. Ceux résultant d'une synthèse enzymatique sont plus courts, avec 2-4 fructoses, produits à partir du saccharose grâce à une b-fructofuranosidase fongique qui donne un cocktail de saccharose de sucrose (GF glucose-fructose), 1-kestose (GF2), nystose (GF3), 1F-b-fructosylfuranosylnystose (GF4).

Bifidobacterium lactis (alias B.animalis) a été isolé d'un yaourt. Il colonise l'intestin des animaux, mais on le retrouve également dans celui des personnes âgées. Il utilise, de préférence, des oligosaccharides dérivés du lactose, ce qui s'explique par son origine.

Diverses souches sont actuellement commercialisées comme probiotiques, et additionnées à des aliments infantiles ou des yaourts, souvent associées à des fructooligosacharides ou de l'inuline car certaines souches sont capables de consommer ces prébiotiques.

Une b-fructofuranosidase de Bifidobacterium lactis de la souche commerciale BB12 dérivée de B.lactis DSM 10140 vient d'être caractérisée après expression classique dans E.coli. Elle ne ressemble que de loin aux autres fructofuranosidases. Sa Topt est de 40°. A Matthias et al.; Current Microbiology 46 , n°6 (2003) 391-397.

102. Des carences en folate existent, y compris dans nos pays, et sont dangereuses pour le développement embryonnaire. Des chercheurs du NIZO ont accru sa production par Lactococcus lactis par ingénièrie génétique. W Sybesma et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3069-3076.

Lactococcus lactis est capable de produire et d'accumuler des quantités appréciables de folate sous sa forme polyglutamyle, mais seule une toute petite partie est libérée dans le milieu.

Cinq gènes sont impliqués dans cette synthèse, et ont été identifiés dans la souche MG1363 de L.lactis : folA, folB, folKE, folP, et folC. Le gène folKE code la 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydroptéridine pyrophosphokinase et la GTP cyclohydrolase I. Sa surexpression entraîne une nette augmentation du folate produit, mais surtout exporté. La surexpression concertée de folKE et folC (qui code la polyglutamyle folate synthétase) diminue l'exportation. La surexpression de folA (codant la dihydrofolate réductase) déprime la production du folate) ce qui indique une régulation en retour du folate réduit sur la production.

La sécurité alimentaire

103. Des chercheurs irlandais ont monté, par conjugaison, des Lactococcus starters produisant les deux lacticines, 3147 et 481, bien connues. Comme dans le cas des d-entoxines de Bacillus thuringiensis, on cherche à combiner plusieurs bactériocines pour diminuer la probabilité de résistance des bactéries cibles. La combinaison est active sur une large gamme de Gram+. Les souches ainsi montées sont plus efficaces sur Lactobacillus fermentum et Listeria monocytogenes LO28H que les souches parentales ne produisant que l'une d'entre elles. L O'Sullivan et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3681-3685.

La lacticine 481 ne comporte, comme les nisines, qu'un seul peptide et elle est modérément active que sur d'autres bactéries lactiques et Clostridium tyrobutyricum (celui qui fait éclater les meules de gruyère).Elle possède une propriété intéressante qui est celle de lyser les starters lactiques sans arrêter complètement la fermentation lactique, ce qui permet de dégager plus rapidement les arômes du produits laitiers en libérant les enzymes endocellulaires des bactéries lactiques. On connait les gènes de production,; immunité et transport et ils sont portés par un plasmide.

 La lacticine 3147, bien connue, comprend deux peptides agissant de façon synergique, LtnA1 et LtnA2. Elle possède, comme la nisine un très large spectre de cibles. Elle peut être utilisée dans des produits frais, mais a aussi été préconisée pour réduire les mammites.

Les gènes de synthèse et d'immunité sont portés par un plasmide de 60 kb très facilement transmissible, pMRC01).

104. Des chercheurs de l'INRA à Saint-Genès Champanelle ont caractérisé, par insertion d'un transposon, dans le cadre du European Listeria Genome Consortium, les gènes de résistance aux pHs alcalins et au sel chez Listeria monocytogenes. R Gardan et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3137-3143. Ce sont effectivement des conditions rencontrées lors du traitement des produits carnés. Les gènes caractérisés codent des transporteurs et des gènes de fonctions inconnues.

105. Les allergies alimentaires font l'objet d'une revue, bilan de de l'étude "Protall" financée par la Communauté et qui a donné lieu à des colloques au cours des trois dernières années. Ce sont les conclusions de ces colloques qui sont rassemblées dans la revue d'ENC Mills et al.; Trends in Food Science & Technology 14 (APR03) 145-156.

Ces allergies font l'objet d'une attention renouvelée, car leur fréquence augmente chez les enfants. Seuls 7 à 10 types d'aliments, dont ceux issus de l'arachide, de noix diverses, du blé et du soja, sont responsables d'allergies alimentaires, en particulier les dérivés de l'arachide qui peuvent causer des allergies fatales. On estime que 1 à 2% de la population et jusqu'à 8% des enfants souffrent d'une allergie alimentaire. Mais la croyance populaire fait monter à 30% ce pourcentage. Il faut, cependant, bien distinguer les intolérances alimentaires des allergies. Les premières sont souvent liées à des déficiences enzymatiques, les secondes à une anomalie de fonctionnement du système immun qui donne lieu à une hypersensibilité liée aux immunoglobulines E (IgE).

Ce n'est pas la quantité d'une protéine dans un produit qui en permet l'allergénicité, même si c'est un facteur aggravant. Trois types de protéines engendrent la majorité des allergies: les prolamines des réserves des céréales (mais qui comportent également les albumines 2S de réserve des dicotylédones comme les moutarde, colza, noix, tournesol ou sésame etc…, des protéines de transfert non spécifiques de lipides, et des inhibiteurs d'aamylases, notamment de céréales par inhalation), les cupines, avec les globulines de réserve 11S, comme la glycinine de soja, l'arachine de l'arachide, et 7S avec la b-conglycinine du soja, la conarachine de l'arachide, etc… ) et les protéases à cystéines comme la papaïne.

Il n'est, actuellement pas possible de prédire l'allergénicité d'une protéine donnée, on ne peut que la caractériser. On manque, par ailleurs, de modèles animaux adéquats de ces allergies alimentaires, ce qui se comprend bien, vu les régimes de chacun qui ont sélectionné des réponses différentes, sans compter les différences dans les réponses immunitaires en général.

Les allergies alimentaires comportent deux phases : une première de sensibilisation et une seconde de réaction lors d'une ré-exposition à l'allergène.

Les cytokines des cellules T-helpers Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 et IL-13) stimulent la production des immunoglobulines, spécialement celle des IgE. Elles sont donc associées aux allergies. les Th2 réagissent à la présentation de peptides mâchonnés par les cellules présentatrices d'antigènes après que ces dernières les aient rencontrées dans leurs sites périphérique de surveillance, notamment les muqueuses pulmonaires et digestives pour ce qui nous intéresse ici.

Les motifs reconnus sont, pour la plupart, des épitopes dits conformationnels, rassemblant des séquences dispersées le long de la structure primaire de la protéine et rassemblées dans la configuration normale de la protéine. Il est donc encore très difficile de prédire et repérer de tels épitopes sans établir la structure tridimensionnelle de la protéine, et encore. Les séquences de protéines ne sont donc pas d'une grande aide. Ainsi si on a une certaine homologie entre les allergènes du pollen de saule (voir plus loin) avec l'allergène majeur de la pomme, la tropomyosine du poulet a un degré d'homologie supérieur avec celle de la crevette, dont elle est l'allergène majeur or il n'existe aucune réaction croisée entre les deux tropomyosines. Il faut donc se méfier des homologies qui sont linéaires et pas conformationnelles.

La réaction allergique a lieu quand des IgE se lient aux récepteurs de surface des cellules du système réticulo-endothélial des tissus ou des basophiles circulants reconnaissant Fc (la tige du Y de l'immunoglobuline). Le pontage de plusieurs de ces récepteurs entraîne ce que l'on appelle une dégranulation de ces cellules (qui est le signal que l'on détecte souvent quand on veut savoir si une substance est allergène).

Cette dégranulation correspond à la libération de divers médiateurs des symptômes de l'allergie (dont l'histamine, mais aussi les leucotriènes, la prostaglandine D2 et des attracteurs de divers types cellulaires du système immun qui convergent vers le site de l'inflammation qui se développe alors). les cellules réticulo-endothéliales émettent alors IL-3, IL-5 et le GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) qui entraînent l'inflammation. Les lymphocytes Th2 sont également stimulés et produisent les mêmes cytokines pro-inflammatoires qui amplifient le phénomène.

On admet que, dans le cas des aliments, l'allergie aux œufs, lait, poissons et arachide est liée à une sensibilisation dans le tube digestif. Mais le développement d'une allergie comme celle aux oeufs chez l'adulte peut être lié à une inhalation de la sérumalbumine des plumes qui donne lieu à une réaction croisée avec l'a-livetine des oeufs.

De telles réactions croisées se retrouvent avec l'allergie au pollen de saule qui donne des symptômes oraux et pharyngés qui, chez certains patients sont également déclenchés par la consommation de fruits (surtout les pommes), de noisettes ou des carottes ou céleri crus. Ces patients possèdent des IgE correspondant aux deux allergènes majeurs, Bet v 1 ou Bet v 2 (Bet pour Betula, et qui sont des profilines). On observe, d'ailleurs, des sensibilités parallèles au pollen de l'armoise. On ne sait plus si l'allergie primaire est d'origine respiratoire ou digestive, étant liée à une réaction croisée. On a pu le déterminer en examinant le nombre des épitopes reconnus par les IgE des patients dans les deux types de réaction. Ils sont moins nombreux dans le cas des aliments que dans celui du pollen, qui semble être le déclencheur primaire. Mais toutes les allergies aux fruits ne semblent pas être secondaires, par réaction croisée, à une allergie respiratoire au pollen. Dans le cas de certains fruits ce sont des protéines de transfert non spécifique de lipides qui sont en cause, sans aucune intervention du pollen. C'est le cas de la pomme ou de la pêche.

Une allergie peut, d'ailleurs, être déclenchée par les deux voies, respiratoire et gastro-intestinale, comme le cas des inhibiteurs d'a-amylases causant l'asthme des boulangers dans le cas du blé, de l'orge et du seigle et causant, par voie intestinale, des allergies alimentaires dans le cas du blé, de l'orge et du riz. L'allergène le mieux caractérisé est, dans ce cas celui du riz.

Les protéases à cystéine ont été incriminées dans certaines allergies. Elles existent chez les bactéries et les plantes et sont d'origine lysosomales et doivent être activées par protéolyse. L'actinidine du kiwi est une de ces protéines allergènes. Plusieurs sont allergènes chez le soja et on les retrouve aussi bien avec la protéine associée aux globules lipidiques (Gly m Bd 30K, Gly m 1, ou P34), la protéine Gly m Bd 30K ayant d'ailleurs perdu sa fonction protéase.

La revue discute de ce qu'il faudrait faire pour améliorer la sécurité immunitaire des aliments.

106. Usuellement les infections par Listeria monocytogenes concernent les lymphocytes T. On vient de montrer que la bactérie est fort capable d'infecter les lymphocytes B. A Menon et al.; Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 26 (MAY03) 157-174.

107. Des chercheurs canadiens montrent qu'on peut utiliser l'expression de la protéine de stress DnaK pour quantifier l'effet de la cuisson sur la santé d'une Escherichia coli. Cela permet de compléter les comptes de survivants. Cette protéine est surtout produite à 50° et protège de traitements plus drastiques. Elle est également produite au cours de la récupération du choc thermique chez les survivants. K Seyer et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3231-3237.

108. La souche O157:H7 bien connue (et redoutée) d'Escherichia coli à shiga-toxine (STEC) descend de la souche O55:H7 par acquisition de deux bactériophages, l'un codant la shiga-toxine Stx2 et, plus tard, l'autre, Stx1. Toutes les souches E.coli O157:H7 sont porteuses de stx2, et les trois quarts de stx1. La plupart des souches (STEC) non-humaines O157:H7 possèdent stx1 mais pas stx2.

Stx1 est identique à la toxine extra-cellulaire Stx de Shigella dysenteriae sérotype 1. Stx2 présente 56% d'identité avec Stx1. Les sous-unités A et B de ces deux toxines sont codées en tandem dans la portion centrale d'un phage lambdoïde. E. coli O55:H7 and STEC appartenant au sérogroupe O157 forment un clade dit STEC 1 (ce sont les souches entérohémorragiques d'E. coli).

 Le modèle évolutif admis est que les souches O157:H7 ont perdu les gènes rfb à gnd O55 et ont acquis le bactériophage stx2, puis récupéré les gènes rfb-gnd O157 . Entre ces deux évènements les souches O157:H- ont perdu la capacité de fermenter le sorbitol, tandis que les souches stx2+ O157 fermentant le sorbitol ont donné les formes non mobiles O157:H-. Cette séquence évolutive a été suivie restropectivement N Shaikh et al.; Journal of Bacteriology 185, n°12 (JUN03) 3596-3605.

Contrairement à ce qu'indiquaient deux séquences établies (celles des souches Sakai et EDL933), des bactériophages tronqués occupent un même site chez pratiquement toutes les E. coli O157:H7 dépourvues de stx1. C'est la région centrale du bactériophage qui a disparu et qui a été remplacée par une très courte séquence, apparemment par recombinaisons autour de cette zone. Le bactériophage stx2 occupe un site précis chez les souches stx1+/stx2+ d'E.coli O157:H7, mais ce site est inoccupé chez les souches stx1-/stx2+, précurseurs évolutifs d'E.coli O157:H7 stx1+/stx2+. Le trimethoprim-sulfamethoxazole induit l'excision de tous les bactériophages et la ciprofloxacine et la fosfomycine le font pour une partie des insertions, les sels biliaires limitant ces excisions. L'acquisition de stx1 a donc probablement été un processus en plusieurs étapes et il est vraisemblable que sels biliaires et antibiotiques ont été des facterus fdavorisant la stabilisation de ces souches.

109. On trouvera dans CL Kruger et al.; Food & Chemical Toxicology 41 (JUN03) 793-805, de ENVIRON International et Johnson & Johnson Consumer & Personal Products Worldwide, une revue sur l'évaluation de la sécurité des additifs fonctionnels des aliments (pré- et probiotiques). La revue fait justement remarquer que tous les aliments sont fonctionnels par nature, car biologiquement actifs.

Aliments fonctionnels et nutraceutiques (alicaments pour faire plaisir à l'académie) sont surtout examinés pour les contre-indications, peu a été fait pour prouver leur effet sur la santé (et c'est la faiblesse de ces additifs) on se contente de comparaisons entre deux échantillons humains très réduits car cela coûte cher et génétiquement très hétérogènes, ou d'enquêtes où le reste de l'alimentation est mal maîtrisé. www.fao.org/WAICENT/FAOINFO/ ECONOMIC/ESN/food/foodandfood_probio_fr.stm.

Les additifs traditionnels comme les acidulants, antioxydants, agents de conservation ou les arômes sont ajoutés à cause de leur valeur nutritionnelle ou de leurs propriétés techniques. Les additifs "fonctionnels" sont utilisés pour leur effet potentiel sur la santé.

Ces additifs sont très variés. Ils comportent des composés allyliques de l'ail, les caroténoïdes et flavonoides des fruits et légumes, les glucosinolates des crucifères, hypéricine et pseudohypéricine du Millepertuis, les peptides opioïdes ou l'EGF (Epidermal Growth Factor) et la lactoferrine du lait, ainsi que les acides gras poly-insaturés arachidonique et docohexaenoïque du lait humain, et issus dans le commerce, de sources bactériennes, algales ou des huiles de poissons et additionné dans divers aliments infantiles.

Le problème posé par l'utilisation de ces additifs sur le plan de sécurité est la marge existant entre la dose maximale sans effets adverses (NOAEL) et la consommation prévisible (mais très sujette aux variabilités individuelles, ainsi Atatürk ne mangeait plus que des pois chiches à la fin de sa vie).

Comme d'habitude, quand on ne sait pas grand chose, on applique une marge de sécurité d'un facteur de sécurité de 100 entre la NOAEL et la dose journalière acceptable.

Ce concept marche correctement quand la probabilité de consommation est de 1,5 g/jour ou moins. Ceci permet de respecter cette marge, mais ce n'est pas si fréquent que cela. Les malheureux rats chez qui on vérifie l'innocuité ne peuvent souvent pas tolérer cent fois la dose journalière admise quand elle est supérieure à 1,5 grammes par jour. De plus, pour des substances physiologiquement actives ou des aliments, les effets observés ne sont pas des effets toxiques proprement dits, et la marge de sécurité est toujours plus faible. L'index thérapeutique (la marge de sécurité entre effets favorable et toxique) est toujours plus petit (essayez de faire prendre l'équivalent de 100g d'aspirine à un rat et vous aurez un effet toxique garanti, ce qui ferait interdire l'aspirine aux doses thérapeutiques usuelles. La marge de sécurité de certains aliments est donc faible, de l'ordre de trois à cinq fois (pensez à la rhubarbe avec l'acide oxalique). Enfin faire manger à un animal cent fois plus que la normale d'un produit créera invariablement un déséquilibre nutritionnel, car il ne pourra ingérer assez des autres composants de son alimentation normale. Ceci fait que les résultats cliniques chez l'homme sont indispensables pour détecter des effets contraires à la santé humaine.

L'utilisation de cocktails d'herbes médicinales s'amplifie dans tous les pays développés sous prétexte de "naturel",  mais les interférences avec des médicaments sont préoccupantes.

Ginkgo (Ginkgo biloba), Millepertuis (Hypericum perforatum), ginseng (Panax ginseng), Kava (Piper methysticum), ail (Allium sativum), et les Echinacea (E.purpura, E. pallida et E. augustifolia) et, dans une certaine mesure l'Ephedra (Ephedra sinica), sont les plus utilisés. L'Ephedra a suffisamment de contre-indications pour que son utilisation ait été limitée.

Les ginkgolides sont de puissants antagonistes de l'agrégation des plaquettes et donc contre-indiqués en présence d'antinflammatoires non stéroïdiens. On constate des hémorragies cérébrales dans le cas de consommation simultanée.

Les extraits d'Hypericum induisent des enzymes métaboliques hépatiques et doubleraient l'activité p450. Ceci peut causer des hémorragies en combinaison avec des contraceptifs oraux. Plus de 73 médicaments et composés endogènes sont métabolisés par ces enzymes. Un avertissement récent de la FDA signale ces dangers, mais qui consulte la FDA avant de prendre une tisane? et pourtant des rejets de greffe d'organes brutaux liés à ces herbes médicinales sont pourtant signalés

Le ginseng produit des effets hypoglycémiants et doit donc être pris avec précautions (voir pas du tout) en présence d'une médication de régulation de la glycémie.

Le Kava présente une toxicité hépatique, et on connaît sa toxicité nerveuse en combinaison avec les benzodiazépines et l'alcool. Il inhibe l'action de la dopamine.

L'ail a un effet sur l'agrégation des plaquettes et du fibrinogène, et ne doit pas être utilisé avec de l'aspirine.

 Les Echinacea sont des composées dont les rhizomes sont utilisés en Inde comme médicaments. Une bonne tisane de cette plante devient hépatotoxique quand elle est utilisée en présence de stéroïdes anabolisants. Ses effets stimulant le système immunitaire peuvent contrebalancer l'action de la cyclosporine lors de greffes d'organes.

L'Environnement

110. Un consortium dont fait partie P.Chambon de Strasbourg vient de montrer comment la dioxine modifie les réponses aux œstrogènes. F Ohtake et al.; Nature 423 (29MAY03) 545-550. Le fait que ces composés affectent la fertilité humaine, mâle et femelle et peuvent, suivant les conditions, augmenter ou diminuer la sensibilité aux œstrogènes.  Ces facteurs affectent les fonctions des récepteurs nucléaires d'œstrogène ERa et b et modifient les interactions avec, notamment, le 17b-œstradiol.

Le récepteur dit AhR (Aryl hydrocarbon Receptor), est activé par les dioxines, forme un complexe avec l'Arnt (Aryl hydrocarbon nuclear translocator) et peut activer la transcription comme les récepteurs des œstrogènes après de leur dimérisation, mais en se liant à des séquences dites éléments de réponse aux xénobiotiques.

Les hétérodimères AhR/Arnt s'associent avec les récepteurs les récepteurs ERa et ERb. Cette association entraîne le recrutement des ER et du co-activateur p300 sur les promoteurs cibles des œstrogènes.

111. On admet généralement que les bactéries ne sont pas aussi efficaces que les champignons pour la délignification. Mais elles peuvent réduire les impuretés qui polluent l'environnement et diminuent la qualité du papier. La réduction des substances polluantes du bois (essentiellement des triglycérides, des acides gras, des stérols, stéryl esters et d'autres substances par des bactéries est étudiée par des chercheurs finlandais. A Kallioinen et al.; Journal of Biotechnology 103 (12JUN03) 67-76.

Les extraits lipophiles sont regroupés sous le nom de "poix". S'y ajoutent des substances hydrophiles comme les lignanes.

Les méthodes conventionnelles comportent l'écorçage des troncs et l'utilisation des additifs. On a déjà commencé à utiliser des lipases (vu la composition de ces sous-produits) après traitement Kraft (mécanique). On a également préconisé l'utilisation des stéryl estérases.

Le traitement de la pâte à papier par une souche albinos du champignon Ophiostoma piliferum (Albinex™, ex-Cartapip™) permet de se débarrasser des résines avant pulpage.

Les bactéries décroissent la quantité des extraits polluants du bois. Si ces bactéries s'avèrent efficaces, elles auront l'avantage de pousser plus vite et la préparation des starters sera plus rapide.

112. La biolixiviation (solubilisation) des minerais de métaux lourds par les microbes fait l'objet de la revue de DE Rawlings; Annual Review of Microbiology 56 (OCT02) 65-91.

 L'extraction du cuivre par les microorganismes date de la plus haute antiquité sans que l'on ait décelé l'importance des microorganismes impliqués. La biolixiviation a été utilisée dans les gisements du Rio Tinto (dans la région de Sevilla) par les populations préromaines (notamment les carthaginois) pour l'argent et par les romains pour le cuivre. Le nom de la rivière (rivière rouge) est lié à la très forte teneur en fer ferrique qui la rend imbuvable et abiotique. Le site a été redécouvert en 1556 par Diego Delgardo, un prêtre chargé par Francisco de Mendoza, qui était supposer aider Philipe II à regarnir ses coffres forts. Les villageois ont expliqué au prêtre que si on mettait un objet en fer dans cette eau, il disparaissait rapidement. Mais une autre constatation a été faite par le prêtre, qu'il se garda bien de consigner par écrit et qu'il communiqua de vive-voix au roi lui-même: "le fer se transformait en cuivre". Il décrivait le phénomène électrochimique par lequel le cuivre précipite pendant que le fer se dissout. C'est le principe appelé maintenant cémentation.

La découverte du prêtre était considérée comme de l'alchimie qui devait ultérieurement permettre de "créer" de l'or. Ce n'est qu'en 1750 qu'on est revenu à des objectifs plus réalistes avec l'extraction du cuivre. Ce sont des microorganismes acidophiles, chimiolithotrophes oxydant fer et soufre qui interviennent. On les utilise pour extraire cuivre, uranium et or de minerais peu concentrés. Les sulfures métalliques sont oxydés en sulfates.

 On travaille actuellement avec des organismes mésophiles, mais on dispose maintenant d'organismes capables de travailler à 80° ou plus, ce qui permettrait d'appliquer la technique à d'autres minerais.

Les caractéristiques générales de ces microorganismes sont passées en revue ainsi que ce que l'on sait de leur biologie moléculaire et des mécanismes de biooxydation

Les procédés actuellement utilisés sur le plan industriel sont analysés avec la lixiviation et les réacteurs agités.

Les microbes sont d'ailleurs à l'origine de certains dépôts actuels. Les réducteurs anaérobies du soufre venant engendrer les sulfures que l'on cherche maintenant à exploiter, cette fois en oxydant les sulfures avec des microorganismes pratiquant une respiration au soufre. On obtient ainsi des sulfates souvent solubles que l'on récupère. Dans le cas de l'or, la situation est un peu différente, car il s'agit de dégager l'or de sa gangue de sulfures dont on se débarrasse ainsi par solubilisation.

113. Les biofilms peuvent être envisagé en pathologie, avec la plaque dentaire, par exemple, ou la contamination des prothèses. Mais ils sont importants dans la décontamination des surfaces alimentaires (car un biofilm est beaucoup plus résistants aux biocides que les cellules libres), mais aussi dans des installations industrielles, où ils colmatent les canalisations par les dépôts d'hydroxyde ferrique, par exemple, avec les films de Gallionella ferruginea ou Sphaerotilus natans. Ils permettent également des corrosions très difficiles à combattre à cause d'abord des activités métaboliques (production d'acide sulfurique ou de H2S). L'acide sulfurique produit à partir d'hydrogène sulfuré ou de soufre réalisée par les biofilms de Thiobacillus est à l'origine de nombreuses corrosions de tubes souterrains comme les conduites de gaz en acier ou celle d'eau en fonte. C'est ainsi qu'en Grande-Bretagne on a pu observer, dans un lotissement neuf, des destructions de telles conduites en moins de trois ans.

Un autre aspect indépendant du métabolisme est la corrosion électrolytique par les biofilms, en créant les conditions pour la création de "cellules électrolytiques". Les métaux sont l'objet, en dehors de toute intervention biologique, d'une corrosion potentielle à la suite de mécanismes électrochimiques qui induisent une différenciation de sites sur le métal, les uns chargés positivement (anode) par rapport aux autres (cathode). Les microorganismes sont capables de créer une telle différenciation en modifiant localement le milieu. Ainsi une colonie bactérienne aérobie sur une plaque métallique, consomme l'oxygène et crée ainsi une zone sans oxygène qui devient une anode par rapport au métal environnant qui devient une cathode.

On trouvera dans P Stoodley et al.; Annual Review of Microbiology 56 (OCT02) 187-209 une revue intéressante sur la structuration des biofilms.(voir également P Stoodley et al.; Current Opinion in Biotechnology 13 (JUN02) p.228-233). Ce sont des communautés procaryotiques hautement organisées où les métabolismes sont complémentaires. Un peu comme chez les organismes pluricellulaires, on retrouve une sorte de développement avec des étapes successives. Les patrons d'expression génique sont nettement distincts de ceux des formes planctoniques (libres). Ce mode de vie conditionné par une surface où une microniche se crée permettant de créer un environnement biologiquement stabilisé. Un biofilm c'est comme je l'écrivais, dans le Bulletin d'Avril 2002 §93, des HLM avec leurs avec des escaliers et des ascenseurs pour faire monter les nutriments dans des colonnes aqueuses et des vide-ordures pour éliminer les déchets

Un chapitre est consacré à la structure et la différenciation des biofilms, avec les étapes initiales et la différenciation ultérieure. Il souligne l'importance de l'hydrodynamique sur la structure.

Un second chapitre discute la phase irréversible de la fixation, la maturation du biofilm. Les interactions entre cellules (quorum sensing ou non) jouent un rôle très important dans ces étapes orientant la différenciation.

Un troisième chapitre discute les caractéristiques biologiques principales d'un biofilm qui peut être considéré comme une communauté intégrée de microbes, avec ses comportements particuliers, mais aussi comme un système auto-assemblé. Enfin le rôle des surfaces est examiné et la nature de la matrice extra-cellulaire sécrétée par les cellules est discutée en tant que matériau.

114. Les géobactéracées, qui permettent la bioremédiation des sites contaminés par de l'uranium en le précipitant par réduction de l'U(VI) en U(IV) peuvent être favorisées par addition d'acétate et leur nombre augmente alors de plusieurs ordres de grandeur. Ceci avait été montré dans le cas de zones de réduction du Fe(III) contaminées par des hydrocarbures ou des percolations de décharge. L'acétate constitue un substrat carboné oxydé par la bactérie, qui réduit le fer dans le cadre d'une respiration sur fer.

Malheureusement les géobactéracées ne supportent pas la salinité. Or une forte salinité est fréquente dans les usines de traitement des minerais, du fait de l'utilisation massive d'acides. Si on veut réaliser cette opération dans ces conditions, il faut rechercher d'autres microorganismes. On peut le faire en ajoutant de l'acétate à l'aquifère salé contaminé. Il se développe alors des Pseudomonas et des Desulfosporosinus capables d'effectuer la réduction avec une respiration sur nitrates, puis sur les métaux oxydés. KP Nevin et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3672-3675.

115. Le vanadium est un métal de transition relativement abondant et à multiples utilisations (notamment dans les pots catalytiques des automobiles, ou la production d'acide sulfurique où il joue un rôle de catalyseur, ou dans le développement des photographies, la teinture textile ou céramique). Shewanella oneidensis couple l'oxydation anaérobie des lactate, formate et pyruvate à la réduction du pentoxyde de vanadium (VV) dans le cadre de ce que l'on peut considérer comme une respiration anaérobie. Le vanadate (VV) est alors réduit en vanadyl (VIV) qui précipite. Elle vient s'ajouter aux souches de Pseudomonas qui en sont également capables. W Carpentier et al.; Applied & Environmental Microbiology 69 (JUN03) 3636-3639.

116. Les taux de soufre tolérés dans les carburants sont continuellement abaissés sur le plan réglementaire et les techniques physico-chimiques d'hydrodésulfuration ne pourront bientôt plus satisfaire cette réglementation. L'hydrodésulfuration consiste en une hydrogénation catalytique avec cobalt, molybdène, nickel ou tungstène comme catalyseur immobilisé sur de l'alumine. Quand on utilise molybdène sur alumine, on rajoute usuellement du cobalt et du nickel pour renforcer l'action. Cette technique est surtout utile quand les composés soufrés organiques constituent la plus grande partie des contaminants soufrés. Mais le H2S dégagé empoisonne le catalyseur. De plus, à côté de composés labiles faciles à désulfurer, d'autres sont récalcitrants. ce qui fait que même après hydrodésulfuration, il faut désulfurer les gaz de combustion. Le manque de spécificité de substrat des catalyseurs métalliques n'est pas une gêne, car les composés sont très divers. Parmi les composés réfractaires il y a les hétérocycliques soufrés comme les benzothiophènes où, de plus, les substituants au voisinage du soufre viennent gêner l'accès au soufre. Le pétrole brut contient de nombreuses molécules soufrées, mais c'est dans les fractions moyennes (gazole) que se distillent les dibenzothiophènes alkylés (DBT) qui sont les molécules les plus récalcitrantes.

Ces dernières nécessitent des pressions et températures plus élevées ainsi qu'une énorme quantité d'hydrogène, ce qui constitue un handicap certain, car il nécessite des équipements spéciaux. C'est pourquoi on a cherché depuis une cinquantaine d'années à faire réaliser l'opération par des microorganismes.

Des chercheurs de Diversa et de Dow Chemical font le point sur la biodésulfuration des carburants fossiles et plus particulièrement sur les transporteurs d'électrons associés. KA Gray et al.; Currrent Opinion in Microbiology 6 (JUN03) 229-235.

Les réactions impliquées font appel à la rupture de liaisons C-C et C-S. Plusieurs bactéries sont capables de désulfurer les hydrocarbures en ouvrant les cycles aromatiques comme le font plusieurs Pseudomonas, Beijerinckia et Brevibacterium. Puis elles libèrent le soufre sous forme de sels solubles. Le composant modèle (et difficile à dégrader qu'est le DiBenzoThiophène (DBT) est oxydé (DBT ->1,2-dihydroxyDBT) et ouvert, ce qui le rend hydrosoluble. Malheureusement d'autres molécules aromatiques du pétrole sont également attaquées, et cela est gênant pour le raffineur. Par ailleurs, les produits de décomposition du DBT donne des thiophènes (surtout du 3-hydroxy-2-formylbensothiophène) très difficile à éliminer de la phase aqueuse. De plus, comme l'attaque du cycle se fait le plus souvent aux positions 2 or 3 du DBT, les DBT substitués par un alkyle à ces deux positions ne peuvent pas être traités, comme c'est le cas pour l'hydrodésulfuration.

Rhodococcus erythropolis souche IGTS8 est capable de se fournir en énergie avec le soufre sans causer de pertes d'hydrocarbures (donc en oxydant le soufre) et ne fait donc pas intervenir, en principe, de rupture du cycle aromatique.

L'accélération des découvertes a été liée à la révélation progressive de la voie de désulfuration avec les gènes Dsz. L'élimination complète du soufre des DBTs requiert quatre enzymes de la voie dite 4S. La DBT monooxygénase (DszC ou DBT-MO) et la DBT-sulfone monooxygénase (DszA ou DBTO2-MO) sont flavine-dépendantes et requièrent donc une flavine réductase (DszD).La HPBS désulfinase (DszB, celle qui va finalement détacher le soufre de l'hétérocycle 2-(20-hydroxyphényl)benzènesulfinate), complète la dégradation en un 2-hydroxybiphényl composé phénolique (2-hydroxybiphényl) et acide sulfureux. Les gènes de ces enzymes ont été caractérisés chez de nombreux microorganismes. La caractérisation de la flavine réductase, DszD, importante dans ce processus [US Patent n°6 274 372 (14AUG01) encore signée d'Enchira Biotechnology et deux des auteurs de la revue], et surtout l'amélioration des enzymes par évolution dirigée (voir  §121) vont permettre d'augmenter le débit des voies qui n'est pas encore suffisant. Ainsi Enchira Biotechnology ont utilisé un enrichissement en chemostat de mutants à gain de fonction après évolution dirigée pour les gènes dszA et dszC (JJ Arensdorf et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (FEB02) 691-698). La commercialisation de la biodésulfuration est, en effet, encore gênée par des enzymes peu performantes.

Plusieurs flavine réductases, dont des thermo-tolérantes ont été caractérisées ainsi que la HPBS désulfinase.

Les Japonais, avec le Petroleum Energy Center, sont également sur le coup, avec les US Patents 6 479 271 (12NOV02) et 6 420 158 (16JUL02) faisant suite aux brevets japonais 10-090387 (02APR98) et 10-310545 (30OCT98). L'Institut Français du Pétrole possède également un brevet avec l'US Patent 6 337 204 (08JAN02) faisant suite au brevet français 99-07807 (17JUN99), mentionné dans le Bulletin de Février 2002 §129 et qui porte sur des souches de Rhodococcus erythropolis et Rhodococcus rhodnii.

Des équipes chinoises publient en ce moment sur le sujet. Ainsi FL Li et al.; FEMS Microbiology Letters 223 (27JUN03) 301-307, utilise une mycobactérie thermophile (Mycobacterium sp. X7B) pour désulfurer le gazole. Elle est, en plus, capable de convertir le 2-hydroxybiphényl, produit de la voie 4S en 2-méthoxybiphényl et possède donc une voie un peu plus complète. Des dérivés du DBT comme le 4-méthylDBT et le 4,6-diméthylDBT, particulièrement récalcitrants sont attaqués par cette souche. La teneur en soufre du gazole déjà hydrodésulfuré a été réduit de 86% par des bactéries en phase stationnaire pendant 24 h à 45°C.

117. Les Arthrobacter sont des actinomycètes très fréquents dans le sol sont considérés comme des aérobies stricts dépendant de la respiration sur oxygène et incapables de fermentation. Ce sont les bactéries souvent les plus fréquentes du sol ce qui fait que les fréquentes limitations en oxygène devraient les handicaper.

Des chercheurs allemands montrent que des Arthrobacter peuvent se multiplier en anaérobiose en utilisant l'ammonification de l'azote à partir de nitrates. Ces bactéries peuvent utiliser une large gamme de produits organiques comme source de carbone et d'énergie, dont des herbicides et pesticides variés en sus de la nicotine ou des acides nucléiques. Ce sont de plus des bactéries Gram+ tolérant les solvants. Arthrobacter globiformis (le prototype du groupe) utilise également des fermentations produisant lactate, acétate et éthanol, tandis qu'Arthrobacter nicotianae se contente de la seule respiration sur nitrate. M Eschbach et al.; FEMS Microbiology Letters 223 (27JUN03) 227-230.

118. La détection classique des polluants fait appel à des installations physico-chimiques lourdes et donc coûteuses et peu propices à l'analyse sur le terrain. L'utilisation des cellules de microorganismes pour la détection quantitative des polluants de l'environnement est analysée par S Belkin de l'Université Hébraïque de Jérusalem. S Belkin; Current Opinion in Microbiology 6 (JUN03) 206–212. Ce travail a été financé, en partie, par la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) de l'US Department of Defense.

Les organismes utilisables font partie des cyanobactéries, levures et champignons qui répondent à des doses précises de polluants et révèlent leur présence par des gènes reporteurs à fluorescence ou luminescence. Le tout peut, maintenant, être utilisé sur des réseaux ou des puces permettant une détection simultanée de nombreux polluants.

Un biocapteur couple directement un matériel biologique à un système de détection d'une modification spécifique du métabolisme (enzyme sur substrat, anticorps sur antigène, etc.). On joue alors sur la spécificité de la réaction. Dans le cas traité par la revue, le matériel biologique utilisé est une cellule vivante. On perd donc, peut être, en spécificité, mais on gagne en détectant une série de réactions qui ne peuvent exister que dans une cellule entière et vivante. La biodisponibilité d'une molécule, sa toxicité et particulièrement la génotoxicité ne peuvent l'être que dans une cellule fonctionnelle.

Les marqueurs fluorescents ou bioluminescents sont largement utilisés. La bioluminescence permet une détection plus facile et plus sensible que la fluorescence. Cela est dû au fait que la bioluminescence utilise une activité enzymatique (et donc amplificatrice), alors que la fluorescence détecte uniquement la présence d'une protéine. L'avantage de la fluorescence est sa très grande stabilité. Si la mesure en temps réel est impossible, alors la stabilité plaide en faveur de la fluorescence, si on laisse le temps au signal de s'accumuler. Dans ce cas même la sensibilité ne devient plus un handicap.

La question "posée" aux capteurs cellulaires de polluants est, non pas si une molécule est présente, mais si elle se révèle toxique pour la cellule. On détecte la toxicité ou la réaction de stress de la cellule. On peut le faire en observant une disparition d'un signal (light-off) normal dans la cellule ou, au contraire, l'apparition d'un signal de détresse ou de catabolisme du polluant (light-on). Le premier système de ce type était celui, en 1990, qui permettait de détecter spécifiquement le catabolisme du naphthalène et du salicylate par bioluminescence positive avec une fusion nah-lux.

Un exemple de système "light-off" est l'extinction de la luminescence de Vibrio fischeri. On peut transférer et faire fonctionner dans Escherichia coli les gènes luxCDABE de V.fischeri (E.coli HB101) ou dans des Pseudomonas fluorescens, immobilisés dans du polyvinyle alcool pour un usage plus commode. La technique "light-off" suppose une expression permanente du gène de luminescence. Un autre exemple est celui de Synechocystis PCC6803, une souche de cyanobactéries exprimant le gène luc codant la luciférase de la luciole Photinus pyralis,mais il faut fournir le substrat luciférine dans le milieu d'immobilisation.

L'auteur cite également l'utilisation d'un variant très sensible de la bactérie luminescente marine Photobacterium leiognathi. L'utilisation de deux champignons naturellement luminescents, Armillaria mellea (pourridié de la vigne et du pommier, ou blanc des racines) et Nycena citricolor sont également mentionnés.

Une approche plus récente se base sur les réactions de stress non spécifiques couplées à une révélation par gène reporteur fusionné au promoteur du gène de la protéine de stress. Ce sont des exemples de techniques "light-on".Elles ont été utilisées pour détecter les dioxines et autres disrupteurs endocriniens (voir le §110). Mais comme les organismes détecteurs ne stressent pas toujours de la même façon, il faut utiliser une batterie d'organismes réagissant de façon complémentaire à différentes molécules.

Dans le cas particulier de la génotoxicité, les promoteurs (qui sont les capteurs) ont été choisis parmi ceux des opérons de réparation de l'ADN comme ceux du système SOS et les reporteurs utilisés ont été des gènes lux et celui de la b-galactosidase, mais aussi la GFP, ce qui est réalisé chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Les fluorescences naturelles parasites peuvent être éliminées par utilisation de la polarisation de la fluorescence comme le montre une équipe de Manchester active dans ce domaine.

 On peut imaginer des cellules ayant des réactions différentes suivies par des reporteurs différents et cela a été réalisé avec une détection de la réaction SOS (génotoxicité) et de stress thermique.

 L'immobilisation sur différents supports et enrobage avec divers polymères permettant une survie suffisante a été décrite. La détection du signal lumineux est souvent assurée par des fibres optiques vers un capteur de type CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) les cellules étant logées, soit dans des micropuits, soit directement dans une encoche à l'extrémité de la fibre. On trouvera une analyse de tels systèmes dans KL Cook et al.; Current Opinion in Biotechnology 14 (JUN03) 311-318.

La Vie des Sociétés

 

119. Le tour d'horizon annuel de Nature Biotechnology sur les sociétés de biotechnologies montre que leur nombre et leurs bénéfices sont en chute. La capitalisation boursière est souvent inférieure à celle de leurs actifs. C'est le cas de Human Genome Sciences, Celera Genomics et Incyte Genomics, par exemple.

Vingt quatre sociétés ont disparu des listes de la bourse en 2002, en fait le même nombre qu'en 2001. Les 416 compganies restantes ont pu lever 10,4 milliards de dollars contre 12,4 en 2001. Les financements privés et par le capital-risque (voir le § suivant) ont, eux, été relativement florissants avec 2,7 milliards de dollars. Mais les pertes ont triplé en 2002 y compris dans les entreprises jusque-là bénéficiaires. Ainsi les compagnies à plus gros revenus en 2001 montraient des profits de 2,3 milliards de dollars alors qu'en 2002, ce sont 5 milliards de dollars de pertes qui sont affichées par le même groupe, et ce ne sont pas de simples changements de règles comptables.

Certaines pertes sont liées à des acquisitions onéreuses comme celle d'Immunex par Amgen.

Les réductions des dépenses ont porté sur tous les chapitres, tout particulièrement la recherche. Ainsi Syngenta a fermé son centre de San Diego, le Torrey Mesa Research Institute. L'industrie des biotechnologies européennes a perdu 6% de ses effectifs. C'est la première fois que ce potentiel décroît. R Lahteenmaki et al.; Nature Biotechnology 21 (JUN03) 607‑612.

On constate que 70% des compagnies sont basées aux Etats Unis, et en Europe la Grande-Bretagne représenterait 45% du potentiel. Mais l'Europe a maintenant plus de compagnies (côtées ou non côtées) de biotechnologies que les Etats-Unis, mais elles sont encore très petites et leurs revenus sont en déclin pour la première fois en 2002. Cette petite taille et le fait que les sociétés sont apparues trop tard pour se constituer des réserves auprès des investisseurs (trop peu, trop tard) font qu'elles seront peu attractives si un rebond se déclenche car une valorisation substantielle, nécessaire à une entrée sur le marché, est hors de leur portée. Fusions et acquisitions sont inévitables.

Les compagnies ayant au moins 500 millions de dollars de revenus voient leur nombre passer de 14 à 19. Parmi les dernières arrivées, on trouve trois sociétés de recherche sous contrat.

On constate plus de mouvement dans les classes intermédiaires entre $0.5‑5 millions et $5‑50 millions de revenus. Ces classements sont perturbés par de très gros contrats, comme la production de vaccin contre la variole commandés par les Etats-Unis pour la société britannique Acambis. D'autres sont liés au débouché de médicaments comme l'a-galactosidase A, destinée à la destruction du lipide toxique globotriaosylcéramide présent dans les cas de maladie de Fabry qui est maintenant autorisé en Europe (mais pas encore aux Etats-Unis) ce qui ouvre des horizons nouveaux aux investisseurs.

L'élimination du NASDAQ porte sur un nombre réduit de sociétés comme en 2001, mais cela est lié à un changement dans la règle utilisée par cette bourse. Jusqu'à présent il fallait que l'action reste au-dessus de 1 dollar, mais une tolérance plus grande est apparue avec une exigence d'une valeur, même épisodique, au-dessus de 1 dollar. Ceci fait qu'il suffit aux investisseurs ou aux gestionnaires d'acquérir quelques actions au bon moment à 1,01 dollar pour que la société soit maintenue.

120. L'économie morose aux Etats-Unis n'a pas découragé les investissements par capital-risque en 2002. un article de MD Dibner et al.; Nature Biotechnology 21 (JUN03) 613‑617, détaille l'attitude du capital-risque dans ce pays avec 440 fonds différents. A la fin de 2002, les investissements du capital-risque, dans son ensemble étaient au plus bas depuis 1998. Les deux années 2001 et 2002 ont érodé les retours sur investissement (qui sont considérés comme raisonnables à 15%). Les investisseurs ont abandonné les firmes Internet et se rabattent sur les biotechnologies.

Le plus gros fonds en biotechnologie est MPM Capital LP de Boston qui a levé son troisième tour de financement, Bioventures III LP, avec $900 millions en Novembre 2002. Quaker BioVentures a levé $180 millions en Mars 2003. Ce sont probablement 33 milliards de dollars qui ont été investis au total en 2002 par le capital-risque.

Les investissements en Bourse ont piétiné, probablement différés par les scandales d'ImClone et Elan, ainsi que les échecs de certains essais cliniques de phase III.

Les introductions en bourse ont été limitées au premier semestre de 2002 et peu de sociétés ont pu les pratiquer, comme ZymoGenetics, DOV Pharmaceutical et Ribapharm et encore ont elles très mal fini l'année.

Les sociétés de biotechnologie ont été autant financées par les fonds de capital-risque que toutes les autres industries réunies. Mais cette tendance semble s'être inversée au début de 2003. On ne sait pas encore s'il s'agit d'un accident ou d'une tendance plus profonde.

En 2002 80% des investissements de capital-risque étaient constitués d'investissements supplémentaires dans des entreprises déjà financées par le fond et seulement 20% dans de nouvelles compagnies. Les financements d'amorçage étant typiquement les moins coûteux la masse totale des fonds investis dans l'expansion des sociétés par rapport aux phases d'amorçage ne signifie, cependant pas grand-chose et les fonds indiquent que leur stratégie n'est pas modifiée.

C'est d'ailleurs perceptible dans l'abondance des fonds en cours de collectes d'argent qui constituent un fonds sur huit alors que les fonds dans le domaine Internet sont tous(ou presque) clos. Seul 3% des fonds ont clos leur cycle. Cela est probablement une conséquence du fait que clore actuellement ne permet guère de retours sur investissement.

Il existe cependant une tendance forte de migration vers les sociétés ayant des produits en voie de commercialisation par rapport à, par exemple, les sociétés de moyens comme la bioinformatique qui a vu ses financements capital-risque chuter de 87% au cours du troisième trimestre. Toutes les sociétés dans ce domaine ont dû monter une vitrine indiquant une intégration dans la chaîne de découverte de médicaments par exemple.

121. Les techniques plus ou moins opérationnelles de biodésulfuration des hydrocarbures ont été mises au point par Enchira Biotechnology (alias Energy Biosystems, travaillant sur une licence de l'Institute of Gas Technology. Or Enchira Biotechnology été acculée à la disparition par Maxygen lors de la perte de son procès (pour des problèmes de confidentialité non respectée) sur la technique d'évolution dirigée RACHITT (RAndom CHImeragenesis on a Transient Template) alors qu'elle commercialisait ces techniques de désulfuration et qu'elle mettait au point des enzymes améliorées. Les auteurs ont donc émigré. Encore un progrès de la technique grâce aux brevets. Il ne s'agissait pourtant que d'un accord de confidentialité et pas d'une utilisation abusive de données protégées.

Les découvertes initiales ont porté sur Bacillus sphaericus. L'US Patent 5 002 888 (26MAR91) porte sur le mutant de Bacillus sphaericus qui va faire l'objet de plusieurs brevets de l'Institute of Gas Technology. Elles vont ensuite porter sur Rhodococcus erythropolis souche IGTS8 (pour Institute of Gas Technology) avec le brevet US 5 104 801 (14APR92). Les brevets d'Energy Biosystems liée ou non à l'ITG se sont, depuis, accumulés. L'US Patent 5 132 219 (21JUL92) porte sur les enzymes de Rhodococcus rhodochrous (alias erythropolis) et de Bacillus sphaericus impliquées dans la réaction. L'US Patent 5 198 341 (30MAR93) porte sur l'utilisation de Bacillus sphaericus, et l'US Patent 5 344 778 (06SEP94) sur le procédé de désulfuration correspondant. L'US Patent 5 358 870 (25OCT94) de l'IGT et d'Energy Biosystems porte sur l'utilisation de microémulsions pour réaliser l'opération. Enfin l'US Patent 5,356,801 (18OCT94) d'Energy Biosystems porte sur un ADN du Rhodococcus lié à la désulfuration. Depuis, les auteurs sont passés chez Diversa.

122. Embrex annonce l'autorisation de commercialisation de son vaccin in ovo Newplex™ contre la maladie de Newcastle administrable via son système Inovoject™. Le principe de ce vaccin est d'associer un virus modérément atténué à des anticorps spécifiques du virus. La présence de l'anticorps modère l'infection virale initiale. Ce vaccin est compatible avec d'autres vaccins administrés simultanément ou après éclosion. Des essais en grandeur nature ont été réalisés chez des élevages de poulet de chair. La société compte attaquer les marchés sur et centre américains, et asiatiques. Embrex Press Release (19MAY03).

La Politique

 

123. Malgré les efforts du gouvernement fédéral allemand et des Länder en faveur des biotechnologies, les industries biotechnologiques sont, ici comme ailleurs, en difficulté. Les instances gouvernementales se disputent sur les moyens de les sortir d'affaire. P Mitchell; Nature Biotechnology 21 (JUN03) 587‑588.

La ministre de la recherche Edelgard Bulmahn propose des modifications de la fiscalité pour les industries "high-tech" qui encourageraient le capital-risque. Elle affirme que c'est le financement à long terme qu'il faut pouvoir assurer. Mais, là comme ailleurs, le ministère des finances, qui va y perdre des recettes, se fait tirer l'oreille.

Près de 150 sociétés de biotechnologies ont été créées lors de la période d'argent facile à partir de 1998. Tout le monde reconnaît que cela n'a fait que différer les problèmes de financement des start-ups. Les sociétés de capital-risque sont conscientes qu'il faut plusieurs tours de financement (ce qui explique le montant des financements privés aux Etats-Unis alors que le marché est déprimé (voir §sociétés). Or la fiscalité en Allemagne ne facilite pas ces financements additionnels. Ceci explique que les financements de ce type, qui correspondaient à la moitié des investissements européens en 2000, soient tombés à 20% en 2002 et soient de tout petits financements à moins de la moitié de ceux pratiqués ailleurs en Europe.

La modification de la fiscalité consisterait à permettre l'imputation des pertes initiales au bilan lors des bénéfices éventuels ultérieurs. Ceci est, en principe, permis par la législation allemande, mais est contrecarré par des dispositions destinées à éviter l'évasion fiscale. Une clause stipule que si la propriété d'une compagnie est modifiée de plus de 50%, ce qui arrive inévitablement lors de tours additionnels de financements, l'imputation n'est plus possible. La ministre de la recherche propose que les sociétés qui consacrent plus de 15% de leur budget à la recherche puissent effectuer l'imputation de leurs pertes initiales, et qu'elles soient totalement exemptées de la taxe sur les sociétés durant huit ans.

Certains animateurs de sociétés de capital-risque pensent que ces exemptions fiscales ne sont pas la meilleure méthode et préfèraient que le fond européen de financement investisse ou co-investisse directement dans les sociétés de biotechnologie. Mais vu la façon dont ce type de financement risque d'être attribué en quotas par pays en fonction de leur contribution, je ne vois pas l'avantage par rapport à un financement régional. De toute façon ce fond ne pourra être opérationnel que dans neuf mois, et c'est bien tard dans l'état actuel des sociétés. Une baisse de la fiscalité sur les stock-options est également envisagée.

Mais un obstacle potentiel est celui de la Commission qui voit d'un très mauvais œil toute mesure destinée à favoriser une industrie nationale par rapport aux autres industries européennes. Mais des aides de ce type sont déjà pratiquées en Grande-Bretagne et en France, et vont l'être ce mois-ci en Suède.

124. L'Office Européen des Brevets (EPO) a confirmé le brevet européen EP0301 749 d'Agracetus (depuis longtemps détenu par Monsanto qui l'a combattu avec vigueur en soutenant qu'il était "without merit", jusqu'à ce que la société ait acquis Agracetus et qu'il le défende avec autant de vigueur). C'est le brevet sur la transformation les variétés de soja recombinées quels que soient le gène ou le mode de transformation. Le brevet européen sera cependant limité au soja. Combattu, en 1994, à la fois par des associations, Monsanto, Novartis et Pioneer pour la raison qu'il entraîne un monopole sur le soja, celui-ci subsiste et le silence actuel des opposants indiquerait que cela va passer devant les tribunaux. Nature Biotechnology 21 (JUN03) 593

 Ayant lu le brevet, je constate qu'il porte sur la seule transformation biolistique. La justification n'est pas encore publiée. Mes questions sur le sujet à l'examinateur n'ont pas obtenu de réponse, car il a quitté l'EPO.

125. On trouvera dans AR Kapuscinski et al.; Nature Biotechnology 21 (JUN03) 599‑601, une proposition d'un groupe de personnes en faveur d'une approche pro-active de la sécurité des produits génétiquement modifiés. Les auteurs sont surtout des universitaires, mais également un ressortissant de GlaxoSmithKline et un ingénieur spécialisé en sécurité dans les transports aériens. Il s'agit de la "Safety First Initiative". Cette initiative regroupe en réalité des spécialistes de l'agriculture, des biotechnologies, de l'agroalimentaire jusqu'au marketing. Elle est animé par John Block, ancien secrétaire à l'agriculture, Charles S.Johnson, ancien vice-président executive de DuPont, Margaret G.Mellon de l'Union of Concerned Scientists, etc…).Ce mode d'approche est certainement encourageant et utile, mais est-ce suffisant pour convaincre les aspects religieux des opposants ? cela ne règle pas du tout, pour autant, le problème de la domination grandissante des industriels nord-américains qui détruisent les industries européennes des semences, par exemple, handicapées par les hésitations gouvernementales compréhensibles, mais peu encourageantes dans ce domaine.

Il n'en reste pas moins que les problèmes de risques sont abordés après commercialisation donc après une dizaine d'années de mise au point. Ce délai augmente les risques de refus réglementaire. Les méthodes d'évaluation des risques sont encore en devenir alors que des défis très importants comme des productions des poissons transgéniques et de plantes produisant des médicaments sont instance de commercialisation.

L'exemple de l'aéronautique avec des essais standardisés et donc bien définis comme les vols à longue distance sur deux moteurs (modèles ERs qui n'ont donné, jusqu'à présent à aucun accident), réexaminés en cas d'incident, les notifications nombreuses de modifications en conséquence, constituent un cadre qui rassure les utilisateurs. Cette approche, préemptive dans la plupart des cas, a commencé il y a plus de 30 ans.

The Safety First Initiative va commencer par s'intéresser d'abord à deux groupes de produits: les utilisations non alimentaires des produits agricoles et l'utilisation des poissons génétiquement modifiés dans l'alimentation.

Le groupe en tirera des recommandations valable pour toutes les industries concernée qui devront être prises en compte dans la conception des produits.

Les critères de sécurité seraient définis à l'avance et vérifiés lors de la commercialisation. Ils couvriraient les risques génétiques et plus généralement environnementaux, et les risques d'allergie.

Le problème des "tests" de vérification est à résoudre. C'est par exemple la mesure de l'adaptabilité (fitness) des organismes modifiés.

Normes de sécurité et vérification ne peuvent résoudre tous les problèmes car on ne peut, pas plus que dans l'industrie aéronautique anticiper tous les accidents possibles comme dans le 747 de la TWA avec les problèmes de détonation dans les réservoirs. C'est l'affaire du suivi.

Pour que tout ceci puisse fonctionner, il faut remplir trois conditions : disposer d'ingénieurs de sécurité bien formés et certifiés indépendamment, une attitude des compagnies vis-à-vis de la sécurité qui encourage une réponse rapide à la mise en évidence de risques réels et une revue indépendante de leurs pratiques, et enfin une organisation qui permettent une application généralisée des standards utilisés avec des audits indépendants. L'industrie aéronautique et de l'acier pratique déjà ces mesures. Dow AgroSciences et DuPont appliquent déjà, dans leur gestion de la sécurité dans les biotechnologies, les règles utilisées dans leurs productions pharmaceutiques et chimiques.

L'effort sur la production de protéines dans les plantes transgéniques est appuyé par la Biotechnology Industry Organization.

 

 

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