Concepts et Techniques

1. On trouvera dans F Hediger et al.; Nature Cell Biology 4 (MAR02) E53-E55, un commentaire sur les relations entre transcription et localisation dans certains domaines spatiaux (régions) du noyau.

Chez Drosophila melanogaster, des anomalies d'expression de gènes marqueurs sont liées à des sites d'expression différents. Dans les cellules de mammifères le "silencing" de gènes au cours du développement des lymphocytes B et T exige Ikaros, une protéine qui transfère les séquences dans l'hétérochromatine centromérique, ce à quoi s'oppose dans d'autres sytèmes cellulaires des "enhancers" qui empêchent ce changement de conformation vers l'hétérochromatine.

 On sait que les télomères, au moins ceux de la levure Saccharomyces cerevisiae, sont positionnés en paquets au contact de l'enveloppe nucléaire. Le positionnement de gènes, normalement transcrits, dans cette zone entraîne la suppression de leur expression. On avait pû le montrer en utilisant la visualisation de la protéine Rap1 qui se fixe sur les répétitions ADN télomériques, ainsi que les protéines Sir-3 et –4 (Silent information regulators).

L'accumulation de ces deux dernières protéines est nécessaire à l'initiation de la répression. On a pu le montrer en dispersant ces protéines ou en les surexprimant, par des astuces génétiques. Le regroupement facilite probablement l'utilisation de ce pool. L'ancrage périphérique est, cependant, indépendant de cette accumulation.

Le mécanisme d'ancrage a, progressivement, était révélé. On a pu montrer, en 1998, que l'hétérodimère Ku70p, une protéine qui reconnaît et lie les cassures ADNs, se lie aux télomères. S'il est défectif, les télomères ne se rassemblent pas à la périphérie et ceci compromet la répression des sites HM contenant les types sexuels réprimés. Ils ne sont pas les seuls responsables de la localisation. Le facteur Mlp2p, qui se lie à Ku, et qui ressemble à la myosine, participe à  la localisation car, quand il est muté, les télomères se dispersent (voir F Feuerbach F. et al. Nature Cell Biology 4 (JAN02) 214-221). Ces derniers auteurs montrent, par ailleurs, que les nucléoporines des pores nucléaires, Nup60 et Nup145, pourraient bien également intervenir. Il existe donc au moins trois sites fonctionnellement différents dans l'enveloppe nucléaire, les pores, les sites d'attachement des télomères et les sites d'ancrage de la chromatine où se concentre l'hétérochromatine.Ces sites interviennent de façon coordonnées dans ces régulations. On a, cependant, parfois du mal à discerner ce qui est la cause, et ce qui est la conséquence du blocage de la transcription dans des interactions aussi complexes. Mais c'est une notion qui se confirme de plus en plus.

2. Une nouvelle revue sur les ARNs interférants (post-transcriptional gene silencing ou PTGS et RNA interference ou RNAi) est parue avec NJ Caplen; Trends in Biotechnology 20(FEB02) 49-51. Ces mécanismes (probablement très voisins) quoique découverts de façon indépendante (PTGS chez plantes et champignons, et RNAi chez Caenorhabditis elegans et Drosophila), présentent de fortes analogies, comme le signalent les articles déjà analysés dans ce bulletin (par exemple le bulletin d'Août 2001 §58). On a également démontré son existence chez les mammifères, mais les fonctions physiologiques assurées in vivo , principale question à ce sujet, restent à élucider. On s'en sert, cependant, et dès maintenant, pour établir rapidement la fonction de gènes. La revue revient sur le rôle de la RNase Dicer qui découpe les ARNs en polynucléotides courts de ~21–23 nucléotides correspondant aux ARNs doubles brins inducteurs. Dicer a probablement une activité hélicase. Une seule protéine du complexe de répression RISC (RNA-Induced Silencing Complex) a, jusqu'à présent, été caractérisée.

Une revue de EG Moss; Current Biology 12 (19FEB02) R138-R140, porte à nouveau sur les microARNs de 21-24 nucléotides codés directement dans le génome par plus d'une centaine de gènes (dont deux, chez Caenorhabditis, lin-4 et let-7, jouent un rôle dans le développement) et qui ont fait l'objet d'une rafale d'articles l'an passé (voir également les Bulletins de Février §8 et Mars §5).

3. On peut utiliser l'interférence ARN en provoquant une expression symétrique des deux brins de l'ADN chez la Drosophile. C'est plus simple à réaliser qu'avec des séquences contenant des répétitions inversées qui engendrent le même phénomène mais, par ailleurs, peuvent provoquer des remaniements génomiques. E Giordano et al.; Genetics 160 (FEB02) 637-648. Les auteurs ont utilisé deux batteries convergentes d'UAS (Upstream Activating Sequences de la levure) dépendantes de Gal4 flanquant des séquences des ARNs à éliminer. L'induction tissu-spécifique de la construction permet une déplétion des messagers dans ces tissus.

4. Un nouveau système d'exhibition de peptides sur les formes L (sans paroi) d'Escherichia coli et Proteus mirabilis est décrit dans C Hoischen et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (FEB02) 525-531. On obtient ainsi des formes actives d'enzymes exprimées de cette façon.

5. Le génome des eucaryotes est fragmenté en domaines (ADN) dont l'expression est coordonnée par des "enhancers" (séquences activatrices de transcription) dont l'action se fait sentir sur des distances considérables au sein du domaine. (Voir également le § )Ils contiennent des domaines chromatiniens condensés qui peuvent perturber l'expression dans des domaines immédiatement adjacents. La cellule dispose, cependant, de moyens pour éviter ces débordements, dont les "isolateurs". Ce sont des séquences reconnues par des protéines spéciales qui spécifient de façon stable les frontières d'un domaine, et limitent les perturbations d'origine extérieures.

Une revue sur ces "isolateurs" "est parue avec AG West et al.; Genes & Development 16 (15FEB02) 271-278. Elle traite, en fait aussi bien des "enhancers "que des isolateurs. Elle est nettement touffue.

Ils peuvent intervenir de deux façons différentes; soit par blocage l'action d'une enhancer en s'interposant entre l'enhancer et le promoteur, soit en empêchant la chromatine de se condenser à partir d'un domaine voisin.

Certains isolateurs sont capable des deux. D'autres, particulièrement chez la levure, jouent surtout le rôle de barrière. On a pu montrer, au moins dans le cas de l'élément HS4 du gène de ß-globine que l'isolateur joue les deux rôles, mais les activités sont séparables. Mais il semble bien qu'il n'existe pas de modèle universel du mécanisme.

Au moins un des isolateurs caractérisés intervient sur la formation de boucles de la chromatine empêchant les interactions enter éléments situés de part et d'autre de l'isolateur. Parmi ceux qui interviennent sur la condensation de la chromatine on a pu caractériser une intervention sur la modification des histones. Un des problèmes est que les essais effectués dans des montages risquent de ne pas correspondre à la réalité in-vivo. Des progrès sont actuellement en cours dans ce domaine.

6. Lors de l'empreinte parentale un seul des deux allèles parentaux d'un autosome de mammifères est inactivé pour assurer un dosage génique convenable. Ceci s'opère par un mécanisme épigénétique fonctionnant en cis (sur le même ADN). La plupart des gènes à empreinte des mammifères sont regroupés par paquets et associés à des gènes codant des ARNs non traduits. Dans le cas des gènes Igf2/Ins2 du chromosome 7, associés au gène H19, codant l'ARN non traduit, l'empreinte est gérée par un "silencer" et un isolateur. L'empreinte est liée à la méthylation de l'isolateur.

Dans le cas des gènes Igf2r/Slc22a2/Slc22a, situés dans une région de 400 kb du chromosome 17, et uniquement exprimés chez la femelle, un "silencer" bidirectionnel de 3,7 kb contient également le gène Air, exprimé chez le mâle et donnant un ARN non traduit. Son promoteur  est localisé dans cette séquence de 3,7kb appelée imprint control element (ICE) et qui est localisée entre Slc22a2 et Slc22a3 en amont et Igf2r en aval.

Air recouvre, en antisens, l'un des trois gènes et son promoteur est localisé dans l'intron 2 de Igf2r. On savait que l'expression d'Air est corrélée avec la répression des trois autres gènes dans le génome mâle, et qu'il entraîne une méthylation du promoteur. On vient de montrer que cet ARN d'Air est indispensable à la répression des trois gènes.

 Une troncature de 96% de l'ARN Air, entraîne un maintien de l'empreinte et la méthylation du promoteur d'Air, mais la perte de la répression des trois gènes et donc de leur empreinte. Cet ARN intervient donc directement dans l'empreinte, contrairement à ce qui se passe pour H19, et ICE a une action bidirectionnelle. F Sleutel et al.; Nature 415 (14FEB02) 810-813.

7. Ce que l'on appelle la co-suppression, c'est à dire la répression de gènes, que la cellule estime en trop grand nombre, est probablement une défense contre les acides nucléïques envahisseurs :virus, transposons etc. Elle fait intervenir une reconnaissance par homologie et n'impliquent apparemment pas de destruction des messager comme dans le PTGS ou RNAi (voir le §2).

Les nombreux exemplaires des rétrotransposons Ty1 (une trentaine) sont dispersés dans le génome de Saccharomyces cerevisiae, et sont fortement exprimés (10% des messagers). On pourrait donc penser qu'il n'y a pas de co-suppression. On vient de montrer, en utilisant un transposon reporteur Ty1-URA3 associé à une sélection négative par le 5-fluoroorotate, qu'il peut sibir une telle co-suppression indépendante de la méthylation de l'ADN (la levure n'utilise pas cette méthylation) et de l'intervention des gènes polycomb impliqués, chez la drosophile, dans la répression de l'expression des gènes homéotiques via la chromatine. Les gènes de Ty1 sont, soit tous exprimés, soit tous réprimés. YW Jiang; Genes & Development 16 (15FEB02) 467-478.

Le basculement d'un état vers l'autre est rapide. Il faut un grand nombre de copies de Ty1 pour que la co-suppression soit déclenchée, ce qui suggère que les gènes de Ty1 sont sous une commande en boucle négative. Les répresseurs transcriptionnels de Ty1 facilitent la co-suppression et les promoteurs de Ty1 sont indispensables, ce qui indique que cette co-suppression se situe bien au niveau transcriptionnel.

La transcription des éléments Ty1 est régulée par le type sexuel et la voie des MAP kinases Ste11, Ste7 et Kss1 (impliquées dans la filamentation). On repère le rôle du système de type sexuel chez les haploïdes où l'expression est plus forte du fait de la présence du répresseur hétérodimérique a1/a2 chez les diploïdes. La voie des MAP kinases (celle fonctionnant en carence d'azote) permet d'activer la transcription en stimulant les facteurs de transcription Ste12 et Tec1.

8. Il existe bien d'autres petits ARNs dans les cellules. Parmi eux on trouve les ARNs nucléaires riches en uracyle (U snRNAs). L'ARN 7SK est connu depuis longtemps, mais son rôle était resté énigmatique. On a récemment montré que c'est un régulateur négatif du facteur d'élongation P-TEFb (pour Positive-Transcription Elongation Factor) associé à l'ARN-polymérase II (la transcriptase), lors de la transcription. P-TEFb est un hétérodimère associant une kinase (Cdk9) qui phosphoryle la queue C-terminale de la polymérase II d'une part, à l'une des sous-unités de cyclines (T1, T2 ou K) d'autre part. Cette phosphorylation active l'activité des complexes de transcription lors de l'élongation. On constate, lors d'un stress, une séparation entre P-TEFb et 7SK, ce qui augmente la population de P-TEFb actif (Z Yang et al.; Nature 414 (15NOV01) 317-322 et VT Nguyen et al.; p.322-325). Un commentaire de BJ Blencowe; Current Biology 12 (19FEB02) R147-R149, discute les implications de cette révélation. Ce dernier souligne que dans les complexes actifs que l'on étudie actuellement pour révéler des interactions, des bandes anormales peuvent fort bien être constituées d'acides nucléïques.

9. L'utilisation de la Rnase P pour moduler l'expression de gènes est évoquée dans V Gopalan et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (01MAR02) 6759–6762.

Cette RNase P opère un clivage unique en 5' dans les tARNs lors de la maturation à partir du précurseur. C'est une enzyme chez qui on observe une sous-unité ARN essentielle (sauf, et peut-être, chez certains chloroplastes et chez les mitochondries des trypanososomes). Le substrat naturel peut être réduit à deux nucléotides seulement.

10. La reconnaissance des codons "stop" lors de la traduction (codons dits non-sens) est encore très mal connue. On a découvert récemment qu'un tripeptide des RF1 et –2 (Release Factors) bactériens interviennent dans cette reconnaissance. En réalité une glutamine adjacente au tripeptide joue un rôle important,  car quand on lui substitue un autre acide aminé, la terminaison de la traduction se fait n'importe où. On vient de montrer que des interactions électrostatiques du domaine C des RFs leur permettent de se positionner correctement sur le ribosome. Si ce positionnement est incorrect le ribosome peut passer outre au signal stop. M Uno et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 1819-1824.

11. La transposition de l'élément Mu a lieu au sein d'un complexe ADN-protéines appelé transpososome. Il comprend les quatre sous-unités de la transposase MuA qui reconnaissent chacune un site de 22 pb situé près de l'extrémité du transposon. Les six sites existants ne sont pas tous utiles, mais plusieurs sont indispensables à l'assemblage du transpososome. Il y en a trois d'un côté de la boucle reliant les deux sites de clivage et trois de l'autre (L1 à L3 et R1 à R3). Trois des sous-unités se lient à R1, L1 et R2, tandis que la quatrième se lie probablement à L2, mais de façon assez labile. R3 et L3 sont reconnus par des sous-unités additionnelles non catalytiques. On peut utiliser ces sites pour une transposition. Il en suffit de deux voire un seul. I Goldhaber-Gordon et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (08MAR02) 7694-7702. La structure des sites reconnus est analysée dans un second article du même groupe avec ses éléments  I Goldhaber-Gordon et al.; p.7703-7712. Il est vraisemblable que les sites multiples permettent le positionnement des sous-unités de la transposase chaque site activant allostériquement la transposase. Chaque sous-unité reconnaît un site sur l'ADN et  un site de clivage de l'autre côté de la boucle. Un schéma clair est donné.

12.Lors de la Genome Tri-Conference du Cambridge Healthtech Institute du 26 Février,  Open Channel Software et des chercheurs de Wayne State University ont dévoilé leur nouveau logiciel d'identification de fonctions qui est sensé corréler automatiquement les données de microréseaux d'expression avec des fonctions des gènes révélés. Il s'agit de Onto-Express™.

Il permettrait de déterminer, à partir d'UniGene, GenBank et Ensembl, la fonction structurale ou régulatrice des protéines dont l'expression est modifiée, leurs rôles connus dans une fonction biologique, la localisation de leur activité dans les cellules et la localisation chromosomique des gènes identifiés en quelques minutes. Une version de base gratuite est disponible à http://www.onto-express.org. La version commerciale ajoute des algorithmes permettant notamment d'indiquer l'indice de confiance (p value) des résultats. PRNewswire (26FEB02).

Open Channel Software (OCS) est une organisation Internet qui distribue des logiciels triés utiles aux sciences de la vie.

13. Bien que l'on n'ait identifié qu'une quarantaine de milliers de gènes chez l'homme, on estime qu'ils codent probablement beaucoup plus de protéines et cette dernière diversité est probablement la plus importante. Il est donc difficile de dire qu'on a identifié le gène d'une protéine. Les fonctions peuvent être fort diverses, et il suffit parfois de peu de modifications post-transcriptionnelles pour assurer cette diversité, parfois sans qu'on puisse facilement détecter ces légères différences. C'est ce que soutient un commentaire de J Rappsilber et al.; Trends in Biochemical Sciences 27 (FEB02) 74-78. La spectrométrie de masse porte sur des peptides relativement courts qui sont ensuite confrontés avec des protéines connues de banques de données. La technique de spectrométrie de masse, du fait qu'elle fait largement intervenir les données de banques de données peut fort bien ignorer les (ou des) isoformes. Ceci permet de caractériser les protéines, puis de les identifier à une fonction, les banques de données remplissant les trous, mais ceci risque de faire passer à côté de modifications fines non répertoriées, et donc d'autres fonctions. Elle est capable d'identifier une protéine, par recours à une banque, à partir d'un peptide de 7 acides aminés qui est généralement unique dans l'espèce humaine, par exemple. Par conséquent plusieurs peptides permettent d'obtenir une quasi-certitude. Ceci encourage à la paresse. Les anticorps ont été largement utilisés dans l'identification des protéines, mais l'idée qu'un gène correspond à une protéine et donc à une fonction est implicite dans ces procédés. Il y a donc une insuffisance notoire de la protéomique sous ses formes actuelles.

Il existe d'autres sources d'erreurs. Ainsi un anticorps est dirigé contre un épitope limité de la protéine dépend de l'organisation tridimensionnelle de charges, et de l'hydrophilie ou hydrophobie de l'épitope reconnu. Elle n'est pas toujours spécifique d'une séquence (antigénicité croisée). C'est plus particulièrement vrai pour les anticorps polyclonaux qui sont, de fait, un mélange d'anticorps monoclonaux. Inversement on peut les utiliser pour détecter des homologues protéïques dans une espèce différente. Le fait qu'un anticorps reconnaisse un motif donné fait qu'il ignore une grande partie du reste. On a ainsi détecté chez l'homme l'homologue d'un facteur d'épissage de la levure en utilisant un anticorps contre la sous unité p65 du facteur NF-kB qui intervient, comme nous l'avons souvent vu, dans les cascades de signaux chez les mammifères, donc avec une toute autre fonction. Il faut donc beaucoup d'autres données d'origines différentes pour trier les résultats.

14. Une méthode de détection de la fixation de protéines sur l'ADN en mesurant les changements de charge sur l'ADN est décrite dans EM Boon et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 282-286. Les auteurs ont effectué la démonstration avec la protéine se liant à la boîte TATA  ou la méthylase HhaI ou l'uracil DNA glycosylase, ainsi qu'une enzyme de restriction face à son substrat méthylé ou non.

15. Les protéines kinases constituent une famille étoffée (plus de 2000 d'entre elles sont connues). On admet, par ailleurs, qu'au moins 30% des protéines cellulaires ont une version phosphorylée. Il est, cependant, difficile de localiser les sites de phosphorylation et d'essayer d'en déduire les domaines fonctionnels. On trouvera dans SB Ficarro et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 301-305, une technique pouvant permettre d'identifier, d'un seul coup, toutes les protéines cellulaires phosphorylées sans les isoler, ni les purifier.

On peut, par ailleurs, visualiser la phosphorylation de protéines dans une seule cellule (M Sato et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 287-294). On peut ainsi visualiser les cascades de transduction de signaux dans une cellule. On fusionne des versions de la GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescent différemment avec un segment de liaison flexible (linker) comprenant un domaine substrat de la kinase à étudier, lié à un domaine reconnaissant sa version phosphorylée. Le rapprochement des deux va modifier la conformation générale et influer, ainsi, sur la résonance de fluorescence entre les deux GFPs. 

Des puces pour l'analyse quantitative de l'activité des kinases sont, elles, décrites dans BT Houseman et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 270-274. Elles utilisent des peptides dont la phosphorylation est détectée par SPR (Surface Plasmon Resonance, c'est à dire un système de détection et de quantification basé sur les changements de réfraction de la surface quand la masse des peptides est modifiée), ou fluorescence. Le problème avec les puces de peptides résident dans la mauvaise maîtrise du processus chimique de fixation sur le support. Dans ce cas, un procédé de fixation pour la kinase c-Src est décrit.

16. L'un des gènes codés par l'ADN mitochondrial chez la quasi-totalité des eucaryotes est celui de la sous-unité 6 de l'ATP synthase (ATP6). Il existe cependant des exceptions: Plasmodium (agent du paludisme), les ciliés Tetrahymena et Paramecium, ainsi que l'algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. On connait la séquence complète des génome mitochondriaux chez ces organismes, et on y a recherché, en vain, des gènes cryptiques codant cette protéine. On en a déduit que le gène devait être nucléaire. On vient de le démontrer chez Chlamydomonas. S Funes et al.; Journal of Biological Chemistry 297 (22FEB02) 6051-6058. La protéine a dû être modifiée au cours de l'évolution pour pouvoir retourner dans la mitochondrie. Les ATP synthases, comme les autres protéines des systèmes membranaires de la membrane interne assurant la chaîne respiratoire et la phosphorylation oxydative, sont très hydrophobes avec, dans le cas de l'enzyme mitochondriale humaine, cinq domaines transmembranaires. Ceci a été partiellement corrigé dans le cas des enzymes à codage nucléaire. La protéine est, alors, moins hydrophobe. Trois des domaines transmembranaires qui n'interviennent pas directement dans la translocation des protons sont, en effet, moins hydrophobes. Le dispositif de retour à la mitochondrie est complété par une longue séquence (107 aa) de ciblage rajoutée. On retrouve ce dispositif pour les gènes nucléaires de cytochrome oxydases COXII et COXIII. Voir également le commentaire de H Jacobs; Trends in Genetics 18 (MAR02) 120.

17. On sait depuis un certain temps qu'un stress permet un accroissement de la fréquence des mutations. Ce qui est toujours resté plus ou moins mystérieux est que tout paraît indiquer, par exemple dans le cas d'une mutation d'utilisation du lactose, que ces mutations semblent se concentrer particulièrement dans l'opéron lactose. On vient de suggérer que ce ciblage des mutations est probablement un mécanisme purement darwinien, au cours duquel la sélection naturelle agit en trois étapes: la première est une amplification de lac, puis  on a sélection des allèles lac+ dans la batterie de gènes amplifiés, enfin les lac mutants sont progressivement éliminés et les possesseurs des seuls lac+ ségrègent. H Hendrickson et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2164-2169.

Les Productions Végétales

Les gènes et les génomes

18. Il n'y a pas que chez Escherichia coli que les stress engendrent une fréquence augmentée de mutations (voir le §17). On vient de montrer que c'est également le cas chez Arabidopsis. Des chercheurs de Syngenta et de Paradigm Genetics associés au groupe de B Hohn ont constaté qu'une agression par le champignon pathogène Peronospora parasitic stimule la recombinaison somatique. Ceci est lié à l'entrée en action des défenses, car les analogues de l'acide salicylique comme l'acide 2,6-dichloroisonicotinique ou le benzothiadiazole de Novartis ont les mêmes effets. De plus, le mutant cim3 qui présente des symptomes de défense, même en l'absence d'agression, présente une recombinaison somatique accrue. JM Lucht et al.; Nature Genetics 30 (MAR02) 311-314.

Les effets de la recombinaison somatique sont particulièrement importants chez les plantes où il n'existe pas de lignée germinale semblable à celle des animaux et où, en principe, toute cellule peut regénérer une plante. Tout ce qui provoque des coupures doubles-brins de l'ADN est susceptible de déclencher le processus. On vient donc de montrer, qu'un stress biotique peut avoir les mêmes effets.

Les auteurs font une relation avec l'intérêt pour la plante à pratiquer une recombinaison somatique entre ses gènes de défense dont on peut mesurer les effets dans l'évolution des gènes de résistance.

19. Les microsatellites sont des répétitions de motifs simples dans l'ADN. Leur abondance est expliquée par les effets mutagènes de dérapages lors de la réplication. Il semble que, chez les plantes, ils soient préférentiellement localisés dans l'ADN non répétitif. C'est ce qu'affirment les chercheurs de du Pont de Nemours. M Morgante et al.; Nature Genetics 30 (FEB02) 194-200.

20. Le déséquilibre de liaison (également appelé déséquilibre gamétique) est une autre façon de dire qu'un gène et un marqueur donné sont tellement proches qu'ils sont difficilement séparables par recombinaison. Ils sont utilisés pour pointer un locus pouvant être responsable d'un phénotype donné. Ils sont d'autant plus utiles que la carte des marqueurs est plus dense. Les marqueurs SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sont particulièrement indiqués. Cereon a identifié (http://www.arabidopsis.org/cereon/) plus de 56 000 SNPs chez Arabidopsis. On s'attend à ce qu'Arabidopsis présente de nombreux déséquilibres de ce type car elle est très largement autofécondée. Cet effet est particulièrement marqué dans les populations locales.

On trouvera dans JA Rafalski; Plant Science 162 (MAR02) 329-333 une revue sur l'utilisation de ce déséquilibre dans la cartographie génomique chez les plantes, particulièrement du maïs (l'auteur est de DuPont Crop Genetics/Molecular Genetics). Chez le maïs, DuPont a caractérisé les SNPs par séquençage direct parmi les lignées d'élite américaines. Le polymorphisme est considérable avec, en moyenne, un SNP toutes les 48 pb dans les séquences non codantes et une toutes les 131 pb dans les séquences codantes. Les marqueurs indels (insertion or deletion) présentent un polymorphisme également important (une toutes les 126 pb) mais, pour des raisons évidentes, exclusivement dans les séquences non codantes. Les données acquises sur le maïs indiquent un goulet d'étranglement probable dans l'histoire des maïs cultivés. Les données de SNPs issues des ESTs publiques sont déposées dans la maize databank (http://www.agron.missouri.edu/).

L'importance du déséquilibre de liaisons dépend des populations et varie, évidemment, en fonction de la fréquence de recombinaison le long du génome, du système de reproduction et de l'histoire de la population (dont la sélection par l'homme). Ceci explique qu'elle puisse varier considérablement selon qu'on considère une population sauvage ou des lignées inbred. Une espèce autoféconde comme le soja va montrer des groupes de liaisons beaucoup plus grands qu'un pin à fécondation croisée, par exemple.

On peut relire avec intérêt, à ce propos, l'excellent survol des techniques d'utilisation des marqueurs moléculaires par S Santoni et al.; Cahiers Agricultures 9 (JUL-AUG00) 311-327. Voir également la revue sur le même sujet  de M Nordborg et al.; Current Opinion in Plant Biology 5 (FEB02) 69-73.

L'expression génique

21. La première démonstration de la co-régulation de gènes de plantes dans un domaine chromosomique (voir §5) est donnée par L Mlynarova et al.; Genetics 160 (FEB02) 727-740. Ces chercheurs de Plant Research International et de Biometris ont utilisé deux gènes reporteurs de ß-glucuronidase et de luciférase commandés par divers promoteurs flanqués par l'élément A du lysozyme de poulet. Cet élément est un isolateur de type MAR (Matrix-Associated Region). Je rappelle que ces MARs sont des séquences riches en AT qui assurent d'une part l'ancrage de la chromatine à la matrice nucléaire, mais surtout associe, d'autre part, la chromatine à l'enveloppe nucléaire (au moins in-vitro), ce qui explique peut-être leur rôle potentiel dans la régulation de l'expression (voir §1). Il faut cependant noter que tous les MARs n'isolent pas complètement un domaine et cetains laissent "passer" l'effet de "silencers" voisins.

Le développement

22. On trouvera dans Current Opinion in Plant Biology 5 (FEB02) 11-13, un ensemble de revues inspirées par un colloque qui s'est tenu à Jena en Mars 2001 sur le thème de la généralité de certains mécanismes du développement chez les plantes. Ce développement des plantes a surtout été été étudié chez quelques plantes modèles et ce n'est que récemment qu'il a été envisagé plus globalement. Il est clair que plusieurs mécanismes de base du développement des fleurs dérivent de ceux de la formation des cônes des Gymnospermes, par exemple. D Weigel et al.; p.11-13.

Comme souvent, ces articles sont un peu hétéroclites. Mais ils font intervenir plusieurs ténors de la discipline.

Trois revues se consacrent à la biologie des graines. AT Lohe et al.; p.19-25 analysent la contribution des génomes mâle et femelle à la formation de la graine. Ils analysent particulièrement les régulations épigénétiques intervenant dans le développement de l'albumen. Ils en soulignent l'importance pour la compréhension de l'apomyxie.

M Koornneef et al.; p.33-36, se penchent sur la dormance de la graine, et discutent de l'utilisation des variants naturels chez diverses plantes pour cartographier les QTLs correspondants. On n'en est pas encore à leur identification moléculaire.

J Casal; p.37-42 discute de l'impact considérable, chez les plantes, de la lumière sur plusieurs mécanismes du développement. 

Inversement P Mullineaux et al.; p.43-48 analysent les diverses réactions des plantes à des irradiations lumineuses excessives.

VE Franklin-Tong; p.14-18, discute des données récentes sur des mécanismes de la fécondation côté pollen, notamment l'hydratation du pollen et sa germination sur le stigmate.

Le développement des fleurs et de la feuille et le rôle de gènes orthologues (gènes homologues entre deux espèces) font l'objet de deux revues: K Shepard et al.; p.49-55 et J Hofer et al.; p.56- 61. Cela leur permet de placer la symétrie florale, la détermination du sexe, l'architecture des inflorescence et des feuilles composées dans un contexte évolutif.

Sucres et acide abscissique régulent la transition entre établissement du patron de la graine et la maturation de cette dernière. RR Finkelstein et al.; p.26-32 analysent l'interaction entre ces deux voies et poursuivent cette analyse au delà, lors de la germination et de la croissance de la plantule d'une part, et à leur connexions avec les autres voies (éthylène, etc…).

D'autres revues de ce numéro ont été analysées dans le Bulletin de Mars §10 et §12.

23. Comme pour beaucoup de fruits cultivés, la taille et la forme du fruit peuvent, grâce à la sélection, différer de façon considérable. La taille et le poids des fruits de melons Cucumis melo peuvent varier de C.melo var. agrestis avec 4 cm et 50g. à C.melo var. flexuosus avec 2 m. et 15 kg. La forme du fruit dépend fortement de celle de l'ovaire et elle est déterminée avant l'anthèse. C Périn et al.; Molecular Genetics & Genomics 266 , n°6 (FEB02) 933-941, comme le montrent des chercheurs de l'INRA à Avignon.

La plupart des QTLs de la forme du fruit co-ségrègent, et sont voisins de deux gènes de développement de la la fleur a (monoecious) et p (pentamerous), qui ont un effet majeur sur le forme de l'ovaire et donc du fruit.

La Physiologie des Plantes

24. On a récemment caractérisé un gène de la famille Polycomb qui intervient dans la commande de la floraison plusieurs semaines après une période de froid (vernalisation). (voir les Bulletins de Mai, Juillet §28, Septembre 2001§26). La vernalisation est souvent amorcée au stade de la plantule et la persistence du signal indique un effet épigénétique.

FRIGIDA (FRI) et FLOWERING LOCUS C (FLC) sont deux gènes importants intervenant dans la vernalisation. FRI code une protéine facilitant l'accumulation des messagers de FLC. FLC est un répresseur fort de la floraison et son gène est du type à MADS box. La vernalisation entraîne une répression de son expression. Sa production est réprimée par les gènes intervenant dans ce que l'on appelle la promotion autonome de la floraison (c'est à dire celle ne dépendant que du stade de développement de la plante par opposition aux voies qui, comme le vernalisation, font intervenir des signaux du milieu) comme FCA, LUMINIDEPENDENS, FVE et FPA.

L'article des chercheurs de Norwich (AR Gendall et al.; Cell 107 (16NOV01) 525-535) a montré que le gène VERNALIZATION 2  (VRN2) intervient dans cette régulation épigénétique de la vernalisation chez Arabidopsis. Ce qui est intéressant c'est qu'il code une protéine à doigts à zinc de type Polycomb. Chez les animaux ces protéines interviennent sur les gènes homéotiques, alors qu'ici c'est un gène à MADS box. Chez les mutants vrn2 l'expression de FLC est normalement réprimée à basse température mais, au lieu de rester déprimée, elle repart à température normale. VRN2 maintient la répression de FLC après un traitement par le froid et sert de mémoire.

C'était déjà montré pour la protéine codée par CURLY LEAF agissant sur le gène à MADS box AGAMOUS, par exemple.

VRN2 est indispensable non à la répression initiale de FLC lors de la vernalisation, mais plutôt au maintien de cette répression. C'est donc un fonctionnement similaire à celui des protéines Polycomb de la drosophile. Voir le commentaire de C Köhler et al.; Current Biology 12 (19FEB02) R129-R131.

25. La tomate en développement métabolise le saccharose, soit via la sucrose-synthase (SuSy) clivant ce dernier en UDP-glucose (qui permet la synthèse d'amidon) et fructose, soit via l'invertase clivant le saccharose en glucose et fructose. La voie de la SuSy est observée dans les jeunes fruits verts qui présentent une accumulation transitoire d'amidon, tandis que la voie de l'invertase est observée dans les stades ultérieurs dépourvus d'amidon. Dans les deux cas la moitié du saccharose est récupérée sous la forme de fructose qui ne peut être recyclé qu'après phosphorylation, ce qui est le rôle d'hexokinases qui phosphorylent glucose comme fructose et de fructokinases qui, comme leur nom l'indique, sont spécifiques du fructose. La période précoce du développement du fruit comporte une augmentation de l'activité de la SuSy comme de la fructokinase, associée à celle de l'ADP-glucose pyrophosphorylase et de l'amidon synthase qui interviennent dans la synthèse de l'amidon. On a isolé trois isoformes de fructokinases dans le fruit de la tomate : FKI, FKII et FKIII, mais c'est surtout FK1 qui est la principale responsable de l'activité chez les jeunes fruits. FK1 comme la SuSy sont sujette à la répression par le fructose. Trois gènes différents de fructose kinases sont connus chez la tomate. LeFRK1, est exprimé en permanence au cours du développement, et son produit n'est pas soumis à une répression par le substrat, ce qui indique qu'il code la seule isoforme insensible à cette inhibition, FKI. LeFRK3 n'est pas exprimé dans le fruit. Ce qui indique que FKI est le produit de LeFRK2.

On peut donc penser que la fructokinase FK1 est indispensable à l'accumulation transitoire de l'amidon. Il n'en est rien. Des chercheurs israéliens viennent de montrer que la fructose kinase 1 de la tomate (FK1), codée par le gène LeFRK2, n'est pas nécessaire à l'accumulation transitoire d'amidon dans le fruit.

Les auteurs ont utilisé le gène homologue de la pomme de terre StFRK, sous les formes sens et antisens. Il y a réduction de FK1 dans les deux orientations chez les plantes recombinantes homozygotes, et surexpression chez les hémizygotes. Les fruits sans FK1 ont plus d'amidon que les normaux. N Dai et al.; Plant Science 162 (MAR02) 423-430.

26. La Rubisco (ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) carboxylase/oxygénase) donne deux molécules de phosphoglycérate par condensation du CO2 avec le RuBP au cours de la photosynthèse. Son activité dépend de l'intensité lumineuse qui fournit l'énergie nécessaire à la régénération du RuBP.

L'activité de la Rubisco dépend de la carbamoylation d'une lysine et de la fixation de Mg2+ au niveau du site actif. Cette activité dépend également d'une autre protéine, la Rubisco activase qui hydrolyse l'ATP et dissocie les sucres phosphates, inhibiteurs de la Rubisco. L'activase de la plupart des plantes (pas le tabac) possède deux isoformes issues d'un épissage alternatif.

Des Arabidopsis n'exprimant qu'une seule des isoformes permettent de distinguer l'effet de chacune de ces dernières. Avec la forme courte, l'activité à saturation lumineuse est aussi forte que pour les plantes normales, mais elle n'est pas réduite aux intensités lumineuses limites pour la photosynthèse. Avec la forme longue il y a dépression de l'activité dans ces conditions limitantes mais l'activité à de fortes intensités est moins prononcée et s'établit plus lentement. On retrouve les caractéristiques normales dans les produits d'un croisement entre les deux lignées. La régulation en faibles intensités dépend de l'extrémité C-terminale absente chez la forme courte, et elle est perdue avec une substitution d'une cystéine critique dans cette partie. La régulation dépend donc du statut redox du stroma chloroplastique perçu par cette cystéine. N Zhang et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (05MAR02) 3330-3334.

27. La ß-amylase des feuilles de blé possède au moins 5 isoformes distinctes (ßI-ßV). Un seul cDNA semble permettre la synthèse de toutes ces isoformes. Des chercheurs de Bayreuth et Münster ont isolé le précurseur ßN. La maturation post traductionnelle se fait dans l'ordre ßN> ßV > ßIV > ßIII > ßII > ßI. ßV, ßIII/II et ßI correspondent à des troncatures de la partie C-terminale de ßN de, respectivement, 8, 12 et pas plus de 14 amino acides. Toutes commencent par l'alanine 2 (déduite du cDNA) acétylée, quelques unes des ßI-ßIII commencent par la méthionine 5. On a donc ablation de la méthionine 1 puis acétylation de l'alanine 2 pour produire ßN. ßI-ßV dérivent de bN suivie par les troncatures décrites plus haut sauf dans le cas de certaines ßI-ßIII où l'ablation N-terminale porte sur 4 acides aminés au lieu d'un seul. L Zemanová et al.; Plant Physiology and Biochemistry 40 (FEB02) 101-119.

28. La germination d'Arabidopsis est stimulée par la gibberelline (GA). Les gènes GAI et RGA d'Arabidopsis codent des composants de la voie de signalisation régulant l'élongation de la tige. Deux autres gènes, RGL1 et RGL2 sont étroitement apparentés à GAI et RGA. RGL2 régule la germination en réponse à GA, ce que ne font pas RGL1, GAI et RGA. RGL2 est un régulateur négatif des réponses au GA, qui, en réalité, régule la germination en intégrant des signaux endogènes et du milieu, et non pas directement l'élongation de la tige. L'expression de RGL2 n'a lieu que dans les régions en élongation des radicelles au moment de l'émergence. RS Lee et al.; Genes & Development 16 (01MAR02) 646-658.

29. Les plantes ne produisant pas des brassinostéroïdes, ou qui n'y sont pas sensibles, ont un phénotype caractéristique avec une stature naine, une floraison différée et une sénescence prématurée, etc…  On n'a, jusqu'à présent, identifié qu'un seul gène dans cette voie, BRI1, qui code un composant d'un récepteur membranaire (voir les Bulletins d'Avril et de Décembre 2001 §18). La transmission du signal est donc à peu près inconnue. Le même groupe avait caractérisé le locus BRS1 (voir le Bulletin d'Août 2001 §31) mais la protéine correspondante n'a, à ma connaissance, pas été caractérisée. Un nouveau gène, BIN2 (BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2), vient d'être caractérisé par le même groupe, utilisant une stratégie de clonage cartographique sur le chromosompe IV d'Arabidopsis.

La séquence de trois gènes dans cette région chez des mutants bin2 indépendants a permis d'identifier le gène d'une sérine/thréonine kinase cytoplasmique, ASKeta. Son domaine catalytique ressemble à celui de la famille bien conservée GSK3/SHAGGY (GSK3b des mammifères, SHAGGY de la drosophile). Il existe dix gènes codant des protéines de ce type chez Arabidopsis. BIN2 est un régulateur négatif des signaux induits par les brassinostéroïdes. J Li et al.; Science 295 (15FEB02) 1299-1301.

30. On admet généralement que les réponses des plantes à la gravité et à la lumière sont liées à une distribution asymétrique de l'auxine. on admet également qu'il existe un système spécifique de transport  latéral de l'auxine . Mais aucun élément tangible de ce système n'a encore été identifié. Le gène PIN3 d'Arabidopsis code un régulateur de l'efflux de l'auxine.

PIN3 est exprimé dans les tissus sensibles à la gravité, et la protéine PIN3 s'accumule dans les membranes latérales des cellules et dans des vésicules recyclées. Dans la columelle racinaire, PIN3 est positionnée symétriquement mais se relocalise latéralement dès qu'un stimulus gravitaire intervient.  Elle fait partie du système de transport latéral de l'auxine. Elle est mobilisée par un système dépendant de l'actine. J Friml et al.; Nature 415 (14FEB02) 806-809.

31. Le premier échange de signaux entre les Rhizobium et les plantes qu'ils nodulent est une émission par la Légumineuse de flavonoïdes reconnus par la bactérie qui émet, à son tour, les facteurs Nod qui sont des lipochito-oligosaccharides. Ceci entraîne une courbure des poils absorbants et des divisions corticales dans la racine, face au site d'infection. Les racines du mutant non nodulant MN-1008 de la Luzerne Medicago sativa (Luzerne tétraploïde) ne subissent, ni cette courbure initiale des poils absorbants, ni la division corticale. La lésion génétique correspondante a été localisée par des chercheurs hongrois. Ceci devrait permettre, à l'avenir, d'établir la raison moléculaire de ce défaut. Ceci est d'autant plus intéressant que ces luzernes ne contractent également pas de symbioses mycorhiziennes. G Endre et al.; Molecular Genetics & Genomics 266, n°6 (FEB02) 1012-1019.

32. La variation de phase est typique de bactéries aux niches écologiques hétérogènes et subissant des changements brutaux de leur milieu. Cela leur permet de coloniser les différentes parties de ces niches. Elle résulte, en général, de réarrangements génomiques commandés, comme des inversions ou délétions engendrées par des recombinases site-spécifiques.

Lors de la colonisation de la rhizosphère de la luzerne, Pseudomonas fluorescens F113 présente une variation phénotypique marquée, portant sur la morphologie des colonies. Ces différentes formes morphologiques ont également des préférences pour certains sites racinaires lors de la colonisation. Les variants C ont des colonies semblables à la souche de départ, alors que les variants F et S ont des colonies translucides et diffuses. Ces derniers colonisent préférentiellement les pointes racinaires et se déplacent beaucoup plus énergiquement que le variant C. Ceci est lié à une surproduction de la flagelline régulée au niveau transcriptionnel, à un allongement des flagelles, mais pas à une hyperflagellation. Mais aucun des variants n'est plus compétitif que la souche F113.

Les variants F sont affectés dans de nombreux caractères liés à la colonisation. Les lipopolysaccharides sont différents de ceux des S et C. Ces derniers forment des biofilms, alors que F se multiplie de façon diffuse en milieu aqueux. Ce dernier surproduit le sidérophore pyoverdine en carence en fer, mais aussi en présence de cet ion. Là aussi la régulation est transcriptionnelle. La production des protéases et de cyanure est également modifiée. Toutes ces caractéristiques dépendent d'une mutation dans un système de capteur/transducteur gacS/gacA.

La recombinase site-spécifique impliquée est codée par le gène sss, dont on savait déjà qu'il intervient lors de la colonisation. M Sanchez-Contrera et al.; Journal of Bacteriology 184, n°6 (MAR02) 1587-1596.

33. Le "swarming" (déplacement en masse dans une direction d'une population de bactéries) s'observe, dans certaines conditions, chez Sinorhizobium meliloti GR4. La souche mutante QS77 induite sur milieu minimal semi-solide est, elle, hyperflagellée et ses flagelles sont également géants. La mutation porte sur un gène codant une protéine ressemblant beaucoup à la protéine FadD qui est une ligase d'acyl-CoA d'acides gras à longues chaînes. QS77 n'est pas capable de noduler. Des dérivés d'acides gras interviennent probablement dans les voies de transduction de signaux. MJ Soto et al.; Molecular Microbiology 43, n°2 (JAN02) 371-382.

34. Rhizobium leguminosarum bv.viciae semble utiliser plusieurs systèmes de capteurs de densité cellulaire (quorum-sensing) faisant intervenir plusieurs N-acyl-L-homosérine lactones (AHLs), correspondant à probablement quatre loci différents.

La séquence de Sinorhizobium meliloti récemment établie (http://sequence.toulouse.inra.fr/ meliloti.html), indique la présence d'au moins un gène d'AHL synthase et de plusieurs gènes régulateurs de type luxR, dont deux régulent probablement les gènes de motilité de la bactérie. Celle de Mesorhizobium loti (http://www.kazusa. et jp/rhizobase/index.html), inclue trois gènes codant  probablement des AHL synthases et de nombreux gènes de type régulateur. Chez Rhizobium etli on trouve au moins deux systèmes d'AHLs. Chez R.leguminosarum bv.viciae, on trouve deux loci de production d'AHLs probablement localisés sur le plasmide pRL1JI. L'un d'entre eux, traI, contribue à la production de plusieurs AHLs impliquée dans le transfert du plasmide alors que l'autre, rhiI, est directement impliqué dans la production d'AHLs impliquées dans l'activation des gènes rhiABC régulés par RhiR, lorsque la bactérie est présente dans la rhizosphère. On pense que ces gènes peuvent avoir un rôle dans la nodulation mais on n'en est pas sûr. Elle est autorégulée positivement par les N-hexanoyl-L-homosérine lactone (C6-HSL), N-heptanoyl-L-homosérine lactone (C7-HSL) et N-octanoyl-L-homosérine lactone (C8-HSL), toutes produites par RhiI.

Le groupe de Downie à Norwich a éliminé le plasmide pRL1JI pour analyser deux autres de ces gènes par mutation. Ce sont raiI et raiR intervenant dans la production des AHLs. Le gène raiIR est porté par un autre grand plasmide autochtone, et semble être un régulateur d'un récepteur classique à deux composants, et gouverne l'expression de raiI. Il est exprimé à bas niveau en permanence et son expression est stimulée par le promoteur de raiI situé en amont. Les mutations dans deux gènes, cinI ou cinR, réduisent son expression. Or le produit de CinI est la N-(3-hydroxy-7-cis tétradécenoyl) homosérine lactone, qui renforce l'action du produit de raiR sur l'expression de raiI. Le produit majeur de RaiI est la N-(3-hydroxyoctanoyl)-L-homosérine lactone (3OH,C8-HSL) avec de faibles quantités d'autres AHLs. Elle stimule sa propre production mais le gène est aussi activable par d'autres AHLs. Les gènes raiIR et cinIR font donc partie d'un réseau complexe de signalisation. F Wisniewski-Dyé et al.; Journal of Bacteriology 184, n°6 (MAR02) 1597-1606.

Notons, au passage, que la N-(3-hydroxy-7-cis-tétradécenoyl) homosérine-lactone est un message partagé avec Pseudomonas fluorescens F113 qui fréquente les mêmes milieux.

Ces AHLs de R.leguminosarum sont probablement impliquées dans la survie à l'état stationnaire et freinent la prolifération des bactéries au point qu'on a pensé un moment qu'elles jouaient le rôle de bactériocines

35. L'expression des gènes nod de Bradyrhizobium japonicum dépend de la densité des populations. Elle est stimulée à faible densité et freinée à forte densité. La répression fait intervenir NolA et NodD2 et un médiateur extra-cellulaire encore non identifié. On vient, par contre, d'identifier le système récepteur qui ressemble, encore une fois, à un système à deux composants qui agit sur l'expression de nolA et nodD2. J Loh et al.; Journal of Bacteriology 184, n°6 (MAR02) 1759-1766.

Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense

36. On trouvera dans U Bonas et al.; Current Opinion in Microbiology 5 (FEB02) 44–50, une revue sur la spécificité de reconnaissance lors des interactions entre plantes et pathogènes.

37. La bactérie phytopathogène Erwinia carotovora s'attaque à plusieurs végétaux comestibles comme la carotte, la pomme de terre et la betterave, entre autres. Elle produit ses facteurs de virulence, dont l'antibiotique carbapen-2-em-3-carboxylate, sous la commande d'un système de "quorum sensing" faisant intervenir la N-(3-oxohexanoyl)-L-homosérine lactone (OHHL), plus quelques autres AHLs mineures. Celle-ci s'accumule lors de la phase exponentielle de croissance, puis diminue lors de la phase stationnaire. L'attaque se déroule donc en deux phases, une première où les agresseurs se multiplient en essayant de ne pas irriter la plante cible, puis l'attaque en masse qui aboutit à une macération des tissus végétaux, l'antibiotique servant à éloigner du festin les invités indésirables.

On vient de montrer que la diminution de l'OHHL  au cours de cette phase n'est pas due à une séquestration cellulaire du ligand, mais à sa dégradation dans le milieu. Ce qui est intéressant est que cette dégradation est non-enzymatique et dépend du pH qui s'alcalinise de pH 7 à 8,5 en fin de croissance. Ceci est curieux car on s'attendrait à une régulation fine.

OHHL devient instable entre pH 7 et 8). Cette instabilité est accrue à hautes températures. Ceci est à mettre en relation avec l'existence d'un mécanisme de défense de la plante qui consiste à alcaliniser le milieu jusqu'à plus de 8,2. JT Byers et al.; Journal of Bacteriology 184, n°4 (FEB02) 1163-1171.

38. Ralstonia solanacearum (alias Pseudomonas solanacearum) cause une des maladies bactériennes des végétaux les plus répandues dans le monde. C'est un pathogène vasculaire qui  s'attaque, en effet, à des centaines d'espèces végétales, dont la pomme de de terre, la tomate ou le poivron, le bananier mais aussi à des arbres comme les Eucalyptus. 

On cherche à introduire des résistances par introgressions diverses, mais elles sont polygéniques chez la tomate, par exemple. Celle d'Arabidopsis est de nature différente de celle à d'autres bactéries des Crucifères, car elle ne fait pas intervenir de réaction hypersensible (nécrose localisée jugulant l''extension de l'infection). On vient de cloner le gène RRS1-R, conférant une résistance récessive à large spectre chez cette plante. Cette résistance est effectivement d'un type nouveau.

Deux allèles RRS1-S (dominant) et RRS1-R (récessf) codent deux protéines très semblables, mais de longueur différente, comportant une structure particullière avec des domaines observés chez les protéines de résistance avec la double caractéristique de LRR (répétitions riches en leucines) et TIR-NBS (Toll-IL-1 receptor-nucleotide binding site) ainsi qu'un motif WRKY caractéristique de certains facteurs de transcription végétaux. Pour simplifier la compréhension, défini génétiquement comme un allèle récessif, il commande une résistance dominante chez les plantes transgéniques !!!.

De nombreuses résistances à des oomycètes, des champignons et des virus sont conférées par des gènes récessifs, ce qui implique un mécanisme complexe.

C'est le cas du gène Mlo chez l'orge. La mutation récessive mlo confère un large spectre de résistance à des Erysiphe graminis f sp. Hordei. Mlo code une protéine membranaire, et c'est un régulateur négatif des défenses. Son absence entraîne une réponse de défense anormale, aussi bien en l'absence qu'en présence d'une infection. On connaît d'autres défenses dues à l'absence d'une protéine, mais elles ne sont pas causées par l'activation des défenses mais par l'absence de facteurs cellulaires indispensables à la croissance des populations de pathogènes, comme c'est le cas pour les mutants pmr d'A.thaliana résistants à Erysiphe cichoracearum.

L'analyse des gènes RRS1 dans deux recombinants intragéniques indique que plusieurs domaines du gène sont nécessaires à la résistance. Là encore, pour simplifier les choses, les données indiquent que la résistance est partiellement dépendante de l'acide salicylique et de la voie NDR1 impliquée dans les résistances spécifiques gène pour gène. Autrement dit cette résistance large partage des cibles et signaux intermédiaires avec les voies de résistance spécifiques. L Deslandes et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2404-2409.

39. L'observation directe, dans les cellules, du fonctionnement d'une voie métabolique ou de signalisation est un rêve qui est en train de s'accomplir lentement mais sûrement. Le groupe de Michnik à Montréal a développé un système utilisant la complémentation de fragments protéïques (voir notamment I Remy et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98 (03JUL01) 7678–7683). En gros on coupe, classiquement, la dihydrofolate réductase (mais on peut utiliser d'autres enzymes) en deux fragments (non fonctionnels) et on couple, comme dans le système à doubles hybrides, chacun des fragments à deux protéines qu'on suppose interagir et, quand elles le font, elles regroupent les deux fragments de la DHFR qui redevient fonctionnelle et la fixation de méthotrexate fluoresent visualise l'assemblage, même a très faibes concentrations. La fluorescence peut alors être suivie de différentes façons. R Subramaniam et al.; Nature Biotechnology. 19 (AUG01) 769–772, ont révélé in-situ les interactions entre protéines, l'étape suivante consistait à trouver un moyen de le faire dans une voie donnée et d'en suivre le déroulement spatial et temporel. Un commentaire intéressant de I Remy Trends in Biotechnology 20(FEB02) 47-49 revient sur ces techniques.

Subramanian a utilisé cette technique pour démontrer l'association de NPR1 (NON-EXPRESSOR OF PR GENES, appelée également NIM1 pour NON-INDUCIBLE IMMUNITY1, et régulateur des réponses de résistance systémique acquise (SAR) et induite (ISR) avec TGA2 (un facteur de transcription de type bZIP).

L'induction de la SAR est amorcée par la production d'acide salicylique (SA), qui joue apparemment le rôle de message d'alerte émis au site d'infection vers les autres tissus qui sont encore indemnes. Elle peut être induite artificiellement par l'acide 2,6-dichloroisonicotinique ou le benzothiadiazole (voir §18). En aval, on commence seulement à y voir plus clair. NPR1 est impliqué dans ces signaux aval. Ce qui est intéressant est que NPR1 partage quelques homologies avec l'inhibiteur IkB séquestrant le facteur de transcription NF-kB, le tout intervenant dans l'immunité innée des animaux. NPR1 est activé dans le cytoplasme ce qui lui permet d'interagir (probablement dans le noyau) avec certains des facteurs TGA. La technique utilisée a permis de visualiser et de confirmer le passage du signal dans le noyau, par exemple. Elle a, également, permis de détecter des différences entre tabac et pomme de terre  (ceci a, cependant, été réalisé dans des protoplastes et il faut toujours se méfier des protoplastes qui sont des cellules stressées).

40. Les interactions entre le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et son vecteur puceron sont régulées par la protéine virale P2 (appelée également ATF pour Aphid Transmission Factor). Celui-ci se fixe sur les stylets du puceron se nourrissant sur une plante infectée, ce qui permet le transport vers une plante saine grâce à l'interaction de P2 et d'une autre protéine virale P3 qui fixe, elle, le virion d'une part et P2 de l'autre. Utilisant P2 et P3 produites dans un système de baculovirus, des chercheurs de Montpellier (INRA, CNRS et Université) ont montré qu'il faut d'abord que P3 se fixe sur les virions. Ils montrent également que P2 et P3 interagissent, même en l'absence de virions, mais ne permettent pas la transmission du virus sous cette forme. Le complexe P2/P3/virion, ne se forme pas dans la plante, mais dans le vecteur, alors qu'on décrit le CaMV comme un virus transmis passivement par  le vecteur . M Drucker et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2422-2427.

41. L'expression de l'hévéine, la lectine de l'hévéa reconnaissant la chitine, dans des plantes transgéniques, devrait permettre de lutter contre les champignons pathogènes du genre Alternaria. Cela a été réalisé chez la moutarde indienne, Brassica juncea, par des chercheurs de Hyderabad contre Alternaria brassicae chez qui cela permet une tolérance plus grande mais pa s une immunité. S Kanrara et al.; Plant Science 162 (MAR02) 441-448.

Les Plantes recombinantes

42. Un article de chercheurs de Maxygen (RJ Keenan et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 215-216) comporte une réflexion sur les moyens d'exclure les séquences superflues, lors d'une transgenèse. On pense aux séquences des vecteurs, des marqueurs (notamment antibiotiques). Il pousse plus loin encore avec l'élimination du transgène lui-même, une fois l'effet souhaité obtenu. On sait déjà cibler l'expression vers des organes précis, mais les constructions même non exprimées ailleurs peuvent être considérées comme gênantes.

Le principe est celui de l'utilisation bien connue d'une recombinase site-spécifique comme Cre commandée par un promoteur inductible. On dispose de tels systèmes fonctionnant bien chez les plantes. De plus l'élimination des gènes marqueurs seulement utile lors de la phase de sélection a déjà été pratiquée (voir, par exemple, JR Zuo et al.; Nature Biotechnology 19 (FEB01) 157-161). Les auteurs proposent d'utiliser cette technique pour aller plus loin. Le principe reste le même, avec une cassete comportant un promoteur inductible chimiquement ou physiquement, commandant l'expression d'une recombinase site-spécifique, un autre promoteur commandant l'expression du transgène dans toute la plante ou un tissus spécifique, deux sites correspondant à la recombinase flanquant l'ensemble de la cassette. On peut envisager d'empiler les constructions entre les séquences d'excision. Il persiste cependant des séquences, d'une part parce que l'excision n'est pas efficace à 100% et, d'autre part, parce que les séquences d'excision (32 pb pour loxP) persistent. C'est assez long pour qu'un contrôleur puisse la détecter par PCR.

En effet si le système mis au point par le groupe de Chua (Zuo et al.) fonctionne bien sur Arabidopsis, il est soumis à des aléas dans plusieurs plantes de grande culture. Il faut donc l'optimiser. C'est là que Maxygen intervient en utilisant l'évolution dirigée par remaniement de l'ADN, pour adapter la recombinase à une plante donnée.

Comme la spécificité de telle recombinases est, par essence, très forte on peut lui suggérer de choisir plutôt des "pseudosites" c'est à dire des séquences naturelles, voisines de celle de loxP. Reste à ne pas faire de dégâts dans le génome.

Au delà, la persistence de la protéine recombinase peut être comme non désirable. Les mêmes techniques de Maxygen peuvent être utilisées pour rendre la recombinase instable dans des proportions à établir.

43. Le transfert par conjugaison des plasmides Ti des Agrobacterium est régulé par une hiérarchie de signaux. L'opine produite par les cellules déjà transformées entraîne la production d'une acyl-homosérine lactone constituant un signal de densité de population, appelée ici quormone, produit par la bactérie elle-même. Cette quormone active TraR, qui induit l'expression du régulon tra commandant le transfert du plasmide. Le gène traR fait partie d'un opéron régulé par l'opine.

Il existe des plasmides Ti commandés par deux groupes d'opines différents. C'est le cas du plasmide d'isolats d'Agrobacterium radiobacter K84. Ceci est lié à la présence de deux copies de traR, chacune associée à l'un de deux opérons tra induits indépendamment par l'une des opines. P Oger et al.; Journal of Bacteriology 184, n°4 (FEB02) 1121-1131.

44. On transforme classiquement l'orge par co-culture d'embryons immatures avec des Agrobacterium portant des vecteurs binaires. Le marqueur de sélection et le transgène sont localisés entre les répétitions directes de 25 pb des bordures droite et gauche du T-DNA. Le transfert est polaire et une bordure droite intacte est indispensable, la bordure gauche ayant beaucoup moins d'importance. C'est un simple brin du T-DNA qui est transféré après une coupure entre la troisième et la quatrième base des répétitions terminales.Cette extrémité est couverte à l'extrémité 5' par  la protéine VirE2, liée de façon covalente à la protéine VirD2. On constate chez le tabac et Arabidopsis de nombreuses modifications résultent d'évènements pré-insertionnels. L'intégration dans l'ADN de la plante utilise très vraisemblablement la réparation des cassures doubles-brins. Les cas de répétitions en tandem ont été étudiés par le groupe de Ditter von Wettstein en plaçant un gène reporteur sans promoteur à côté de la bordure droite d'un T-DNA et un promoteur 35S près de la bordure gauche ce qui révèlera, par une expression du reporteur, la présence d'un tandem. Cette technique permet d'identifier sans erreur le site d'insertion de vecteurs à simple et double cassette ainsi que leurs insertions en tandem chez l'orge. R Stahl et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2146-2151. Ils ont, de plus; exprimé sans conserver les gènes de sélection, cinq protéines humaines : antithrombine III humaine, a1-antitrypsine, lysozyme, sérum albumine et lactoferrine. La technique permet  de mesurer la fréqeunce de copies liées ou non des transgènes.

44. On trouvera dans RE Page et al.; Genetics 160 (FEB02) 375-379, une revue passionnante sur la génétique des hyménoptères envisagée dans ses aspects historiques avec les études réalisées ultérieurement sur les guêpes parasitoïdes Bracon hebetor puis Nasonia vitripennis et sur les abeilles. Il faut réaliser que la nature parthénogénétique des mâles de l'abeille a été indiquée en 1845 (Dzierzon, l'absence de spermatozoïdes dans les œufs mâles confirmée en 1856 par CT von Siebold, et la nature haploïde définitivement établie en 1913 par des études cytogénétiques de Nachtsheim.

Les études ont ensuite porté sur l'abeille avec une vue utilitaire: utiliser la vigueur hybride, qu'a essayé de pratiquer Mendel qui s'est découragé, car le pilotage des croisements dans un vol nuptial est ardu. On a donc rapidement utilisé la fécondation artificielle, mais avec des résultats décevants. Celle-ci a été pratiquée probablement pour la première fois par le naturaliste aveugle suisse François Huber. On s'est heurté à de très grandes difficultés résultant de l'ignorance du déterminisme du sexe. De plus la biologie très particulière de cet insecte social, l'effet désastreux de l'inbreeding sur la viabilité des populations, limitent les possibilités d'études génétiques.

Les efforts sur les guêpes parasites de PW Whiting ont permis de tourner les difficultés. D'abord parce que l'élevage est simple, avec un temps de génération court (15 jours pour N.vitripennis), ce qui est une situation favorable pour les études génétiques et, de plus, ces guêpes s'accouplent en captivité. De plus, et contrairement à ce qui se passe pour l'abeille, la construction de lignées inbred, points de départ pour des études génétiques, est possible contrairement à ce qui se passe pour l'abeille.

Il a pu énoncer, dès 1933, le principe de la détermination des sexes : les femelles sont obligatoirement hétérozygotes et les mâles haploïdes ou diploïdes homozygotes. Il existe en effet des mâles diploïdes apparaissant dans certaines conditions, comme dans des colonies fortement inbred. On montra ensuite que les mâles homozygotes sont extraits de leur loge par les ouvrières, et consommés en apéritif par ces dernières. Si une reine partage avec un mâle un des allèles de ce locus, la moitié des descendants sont mâles et exterminés.

Le locus unique CSD (Complementary Sex Determination) responsable de ce déterminisme a été identifié en 1994 puis retrouvé dans d'autres hyménoptères. Une cartographie sommaire du génome a permis de montrer l'existence de deux marqueurs flanquant ce locus et de le caractériser.

Une des découvertes faites à ce propos est importante. On observe, en effet, au niveau de ce locus, chez l'abeille, un taux de recombinaison phénoménal, le plus fort de tous les eucaryotes supérieurs, 52 kb/cM (19 cM/Mb). Malgré de nombreuses hypothèses, toutes rapidement controuvées, on n'a aucune idée de la signification de ce taux de recombinaison.

Bien que le clonage se soit révélé très difficile, à cause d'une instabilité des clones, on a pu montrer l'existence d'un seul gène de 1,5kb codant une protéine, voisine des protéines d'épissage de la Drosophile, se fixant sur les ARNs. La détermination du sexe doit donc s'opérer comme chez la Drosophile par des épissages différentiels.

Malheureusement ce système simple n'est pas général chez les hyménoptères car, chez Nasonia vitripennis on a une situation multigénique. Ceci a facilité la construction de lignées inbred.

Nasonia ressemble beaucoup à la Drosophile sur le plan génétique. Les cartes génétiques par RAPD ont rapidement été élaborées pour divers hyménoptères, l'abeille Apis mellifera, Bombus terrestris, Bracon hebetor, Bracon near hebetor, N. vitripennis x N. giraulti et Trichogramma brassicae.

Des QTLs (Quantitative Trait Locis) pour différents caractères, morphologiques et comportementaux, ont été identifiés.

45. La mobilisation du transposon mariner  de 1286 pb nécessite au moins 7 séquences internes qui ne recouvrent pas les répétitions terminales. C'est un explication des anomalies de mobilisation associées aux délétions souvent observées sur les produits de transposition. Il s'agit probablement d'un problème d'espacement correct des sites de fixation de la transposase. Mais ceci est en contradiction avec le fait que des minitransposons avec seulement 43 pb entre les répétitons terminales peuvent transposer efficacement in vitro. AR Lohe et al.; Genetics 160 (FEB02) 519-526  et ER Lozovsky et al.; p. 527-535.  Ceci handicape le montage de vecteurs.Les auteurs ont d'ailleurs construit des vecteurs comportant deux mariner complets flanquant le transgène mais apparemment avec des fréquences d'excision très faibles.

46. La température module la taille des cellules épidermiques de la Drosophile et donc des organes correspondants. Plus la température est basse plus la taille est accrue. RBR Azevedo et al.; Journal of Insect Physiology 48 (FEB02) 231-237. C'est un phénomène assez général chez les animaux dits ectothermiques.

47. Perdre leur montre handicape la compétitivité des mâles de Drosophile. LM Beaver et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2134-2139. On a toujours eu du mal à démontrer que l'horloge circadienne confère une adaptativité (fitness) particulière. La mesure la plus simple de cette dernière est la production de la descendance pour un individu ou au sein d'une population. Les auteurs ont muté les gènes period (per),  timeless (tim), cycle (cyc) et Clock (Clk). Cela réduit de 40% la descendance. Ce sont la production d'œufs, ainsi que le taux de fécondation qui sont affectés. La contribution des mâles à ce phénotype est démontrée par le croisement de mâles déficients avec des femelles normales. Ils sont surtout affectés dans la quantité de sperme produite. Voir, par ailleurs,  l'article de A Klarsfeld; La Recherche 351 (MAR02) 44-47.

48. Des chercheurs d'Amiens montrent que des gènes marqueurs comme nptII gene codant la néomycine phosphotransférase II et uid A (gus)  codant la  b-glucuronidase, à eux seuls, affectent le développement et la survie du doryphore sur des pommes de terre (Désirée une pomme de terre "industrielle"). S De Turck et al.; Plant Science 162 (MAR02) 373-380

49. Les coléoptères phyllophages tropicaux Platyphora sont des spécialistes de certaines espèces végétales qui ont toujours intéressé les curieux du fait de leur couleurs vives et de leur protection chimique contre les prédateurs. Ce sont aussi des modèles intéressants car ces toxines sont des métabolites secondaires prélevés sur les plantes qu'ils consomment et qu'ils convertissent, puis stockent dans des glandes spécialisées. Ils ne se nourrissent que parmi cinq familles de plantes. Ces toxines sont des saponines à base de triterpènes pentacycliques produites à partir d'amyrines issues des plantes consommées. Beaucoup de Platyphora utilisent, en outre, des alcaloïdes pyrolyzidine du type lycopsamine, également prélevés sur les plantes. Ainsi, Platyphora boucardi séquestre les alcaloïdes pyrolyzidine de leur plante hôte Prestonia portobellensis (une liane Apocynacée) et synthétisent leurs propres alacaloïdes à partir de rétronecine et d'acides 2-hydroxy aliphatiques importés. T Hartmann et al.; Insect Biochemistry & Molecular Biology 31 (OCT01) 1041-1056

Des chercheurs bruxellois ont reconstruit l'évolution de ces espèces, et ont comparé leurs techniques de protection. A Termonia et al.; Proceedings of the Royal Society, London, B Biological Sciences 269 (07JAN02) 1-6. Leur analyse montre que la possession d'un tel système double permet une évolution à l'abri des aggressions, pendant qu'une des deux toxines est perdue on peut changer de plante nourricière et chercher une toxine de substitution à celle qu'on ne peut plus emprunter, le tout en restant un phyllophage spécialisé. Il a du y avoir six changements de ce type au cours de l'évolution. Voir également le commentaire de N Williams; Current Biology 12 (19FEB02) R124.

50. On connaît actuellement sept types de peptides antimicrobiens inductibles chez la Drosophile.Une double mutation dans la voie imd (immunodeficient)  et Toll (via l'inactivation de la production de Spätzle, le ligand initial de la voie) entraîne une disparition totale de la production des peptides antimicrobiens et une grande sensibilité aux infections microbiennes. On peut compenser cette immunodéficence en exprimant, sous la commande du système UAS/GAL4, l'une quelconque des peptides antimicrobiens et on montre, alors, qu'un seul de ces peptides est déjà bien efficace. P Tzou et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2152-2157.

Les Biopesticides

51. La guêpe parasitoïde Encarsia formosa est utilisée pour limiter les populations d'aleurodes dans les serres. Comme souvent, le problème est de les élever commodément en grand nombre et à un prix raisonnable. On vient de montrer qu'il vaut mieux les élever sur le troisème et le quatrième stade larvaire de la proie, où les larves poussent plus vite et où les premiers stades larvaires de la guêpe sont accélérés et mieux synchronisés. De plus les adultes ont une vie prolongée. La dernière mue de la guêpe dépend de la dernière mue de la larve proie. JS Hus et al.; Archives of Insect Biochemistry and Physiology 49 (MAR02) 125-136.

Les Productions animales

Les génomes

52. Une analyse du génome humain indique que 40-60% des gènes présentent un épissage alternatif. Il reste, cependant, un effort à faire pour exploiter ces données sur le plan fonctionnel. B Modrek et al.; Nature Genetics 30 (JAN02) 13-19.

53. Le taux de recombinaison meïotique  n'est pas le même chez les mâles et les femelles et, dans les années 20s, on avait montré que la recombinaison est diminuée chez le sexe hétérogamétique. Ainsi le ratio des recombinaisons, en moyenne sur tout le génome, entre mâles et femelles humains est de 1,0:1,6, chez le porc de 1,0 : 1,4 et chez la souris de 1,0 : 1,25.

Le groupe de Postlethwait a créé des embryons haploïdes androgénétique chez le poisson zèbre (Danio rerio) et a mesuré le polymorphisme génétique. Il a ainsi pu montrer que le taux de recombinaison chez ces embryons est très inférieur à ce que l'on mesure usuellement chez les femelles, ou même la moyenne femelle-mâle, spécialement au voisinage du centromère. Ceci indique que la carte génétique et la carte physique sont "équivalentes" chez les femelles et que cela facilitera les clonages positionnels. Pour certaines analyses, le faible taux de recombinaison du mâle peut, par contre être intéressant. A Singer et al.; Genetics 160 (FEB02) 649-657.

La transformation des cellules animales

54. Les vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus) sont souvent utilisés malgré leur faible capacité d'emport. On admet généralement qu'ils son non pathogènes et, incapables de réplication en l'absence d'un adénovirus auxiliaire. L'AAV2 s'insère préférentiellement dans un site précis (AAVS1) sur le chromosome 19 humain grâce à ses répétitions inversées terminales et la protéine Rep78/68. Ceci évite (théoriquement) les insertions aléatoires éventuellement mutagènes.

On vient de montrer que les provirus vecteurs intégrés sont, quand même, associés à des délétions et autres réarrangements au site d'insertion. Plus, le site d'insertion est beaucoup plus aléatoire que celui du virus lui-même, tout en restant limité au chromosome 19. DG Miller et al.; Nature Genetics 30 (FEB02) 147-148. Les auteurs propose que le vecteur puisse s'insérer lors d'une réparation double-brin sans dépendance d'homologie entraînant des délétions terminales. L'insertion au site 19q13 pourrait indiquer une grande fréquence de ces cassures (induites ou préexistantes? Ceci est encore indéterminé, mais l'effet positif d'agents génotoxiques fait pencher pour la dernière hypothèse). Les auteurs font remarquer que leurs travaux ayant été effectués surune lignée cellulaire, il faudrait vérifier qu'il en est de même chez l'animal.

55. La barrière des endo- et épithéliums est encore un obstacle à bien des transferts dans les organismes. Cela se comprend bien, compte tenu de leur fonction ancestrale. 

Les caveolae constituent un système de transit trans-cellulaire intéressant, mais pas exploré. On vient d'utiliser un anticorps monoclonal contre les caveolae du poumon de rat. Il transite des capillaires vers la surface aérienne des alvéoles pulmonaires. On peut le conjuguer à une substance active. DP McIntosh et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 1996-2001.

56. VL Waters; Nature Genetics  29 (DEC01) 375–376, ont récemment présenté des arguments  en faveur d'un transfert d'ADN d'Escherichia  coli dans une lignée cellulaire de mammifères (cellules CHO K1). Ils ont, ainsi transféré et exprimé des gènes marqueurs portés par un plasmide navette.

57. La transduction de gènes dans les cellules souches embryonnaires ou les jeunes embryons pré-implantaires est un outil précieux d'analyse. Certains vecteurs s'y prêtent mieux que d'autres. Les vecteurs rétroviraux simples sont, eux, affligés par des phénomènes de "silencing" des transgènes et nécessitent une cible mitotique. On vient, cependant, de montrer que les vecteurs lentiviraux (rétrovirus complexes comprenant le HIV-1) ne donnent pas lieu à cette répression de l'expression des transgènes dans les cellules ES et dans les animaux mosaïques dérivant d'une implantation de ces cellules dans des blastocystes selon la technique classique ou d'une infection au stade pré-implantaire. A Pfeifer et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2140-2145. Les vecteurs basés sur le lentivirus ont d'autres qualités comme la capacité d'infecter des cellules différenciées et ne se divisant pas. Voir la revue de M Federico; Current Opinion in Biotechnology 10 (OCT99) 448-453 pour un survol plus général de ces vecteurs.

L'expression des gènes

58. On sait que le gène Xist du chromosome X des mammifères intervient lors de l'amorçage de l'inactivation de ce chromosome. Il est transcrit en un ARN non codant qui s'associe spécifiquement au chromosome X dans les cellules femelles. On vient de déterminer les séquences de l'ARN Xist nécessaires à la fixation sur le chromosome et à son inactivation. L'inactivation est liée à une séquence de l'extrémité 5' (amont). En effet, sa suppression permet l'association et sa propagation le long du chromosome, mais pas l'inactivation. La fixation fait intervenir des séquences redondantes sur tout le gène, mais ne présentant aucun homologie entre elles. A Wutz et al.; Nature Genetics 30 (FEB02) 167-174.

59. Les composants Jun et JunB du facteur de transcription AP-1 (tout simplement Activator Protein-1) ont des fonctions antagonistes. JunB est moins actif que Jun mais peut se substituer à Jun au cours du développement de la souris en cas d'absence de ce dernier chez la souris. JunB restaure l'expression des gènes régulés par Jun/Fos, mais pas ceux régulés par Jun/ATF. E Passegue et al.; Nature Genetics 30 (FEB02) 128-129.

Le développement

60. La voie de transmission intracellulaire du signal Wnt est conservée sur le plan évolutif, mais elle semble effroyablement compliquée (voir par exemple le Bulletin de Décembre 2001 §63). Elle règle la prolifération, la morphologie, la motilité et la détermination des cellules. Elle intervient également dans la formations des axes de l'organisme, ainsi que dans l'organogenèse. Dans le schéma actuellement admis, la sérine/thréonine kinase GSK-3ß1 phosphoryle la ß-caténine, ce qui la cible vers une dégradation, en l'absence de Wnt. Les niveaux cytoplasmiques de ß-caténine sont donc faibles. L'axine forme un complexe avec GSKß, ß-caténine, APC (Adenomatous Polyposis Coli, un suppresseur de tumeur) et la protéine phosphatase 2A. Elle régule une série de phosphorylations par GSKß dans ce complexe. L'axine secomporte comme un régulateur négatif des la voie Wnt qui déprime les niveaux de ß-caténine. Le récepteur de Wnt est la protéine périphérique Frizzled. Celle-ci entraîne la production de la protéine Dvl (Dishevelled) qui s'oppose à l'action de GSK-3b.

La réduction de la phosphorylation de la ß-caténine permet sa dissociation du complexe et son accumulation. La ß-caténine est alors transportée dans le noyau où ele se lie à des facteurs de transcription et stimule l'expression d'une batterie de gènes. Grossièrement, le signal Wnt stabilise la ß-caténine, ce qui régule l'expression de nombreux gènes.

Une autre interférence est celle de la dupline. La dupline se lie à la b-caténine et inhibe, ainsi les signaux Wnt. Dans les formes délétées de la région 500-584, la dupline se lie normalement à la ß-caténine, mais le complexe reste cytoplasmique. Elle se lie en effet, également et par ailleurs, à l'importine a par la région 500-584. Kobayashi et al.; Journal of. Biological Chemistry 277 (22FEB02) 5816-5822.

61. Sry est au départ de la cascade entraînant le développement mâle des mammifères. Une revue sur son fonctionnement est parue avec CA Canning et al.; Trends in Genetics 18 (MAR02) 111-113. Il code un facteur de transcription dont la HMG box lie et courbe l'ADN. Ce qui pourrait lui conférer un rôle dans la structure de la chromatine.

Une brève poussée de transcription (quelques heures) suffit à assurer son rôle. La question qui se posait était celle de savoir s'il agissait sur une ou plusieurs cibles en aval. Les données récentes indiquent que Sox9 est la seule cible aval importante. Encore faut-il être méfiant car, chez la Drosophile, Sx1 qui a la même place hiérarchique que Sry, possède plusieurs cibles aval.

62. Le poisson zèbre est un modèle intéressant pour l'étude du développement du système circulatoire car, d'une part l'embryon est transparent, et d'autre part il tolère l'absence de circulation, l'oxygénation se faisant tout à fait normalement par simple diffusion. On a ainsi pu montrer qu'une mutation dans un exon impliqué dans l'épissage alternatif du messager de la titine cause un difficulté contractile dans le cœur. La titine est la plus grosse protéine connue, et elle s'étend au travers du demi-sarcomère du disque Z à la ligne M des muscles squelettiques et cardiaque. Sa fonction n'est pas encore bien délimitée, mais on pense qu'elle joue un rôle dans l'assemblage des filaments fins et épais du sarcomère et qu'elle assure l'élasticité du muscle. X Xu et al.; Nature Genetics 30 (FEB02) 205-209. Pour ceux que ce problème intéresse on trouvera un article sur la cardiopathie correspondante dans B Gerull et al.; p.201-204.

63. Le gène vasa (vas) est indispensable à la formation de la lignée germinale chez Drosophila melanogaster. Il code une protéine à  DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box, ce qui indique une hélicase potentielle. Il est exprimé dans les cellules polaires qui vont donner cette lignée, et avant, lors de l'ovogenèse, où son expression est observée dans le pôle où vont s'individualiser les cellules polaires avant de migrer vers les gonades. La protéine VAS est présente en permanence dans les cellules germinales. La région régulatrice responsable de cette localisation de l'expression vient d'être identifiée. H Sanoa et al.; Mechanisms of Development 111 (MAR02) 129-139. Un élément de 40pb commandant cette expression au cours de l'ovogenèse, mais aussi au cours de l'embryogenèse a été caractérisé.

64. La restriction topographique des déterminants du développement germinal en une zone précise de l'embryon est un mécanisme important de cette différenciation. Si le messager du gène vasa du poisson zèbre est bien localisé dans le cytoplasme polaire, la protéine Vasa correspondante est distribuée uniformément dans l'embryon et ce n'est que plus tard qu'elle se localise dans les cellules germinales primordiales.

On vient de montrer que plusieurs mécanismes participent à la localisation de cette expression. U Wolke et al.; Current Biology 12 (19FEB02) 289-294.

Les messagers codés par la mère et stockés dans les ovocytes sont rapidement dégradés dans les cellules somatiques de l'embryon, alors qu'ils sont stabilisés dans les cellules de la lignée germinale. Cette stabilisation dépend de  séquences fonctionnant en cis (sur le même messager). La protéine elle-même est très instable dans les cellules somatiques, mais pas dans la lignée germinale. Des séquences de la protéine sont également impliquées dans ce mécanisme de stabilisation.

65. Il existe deux isoformes du messager vasa et de la protéine qu'il code le Tilapia (Oreochromis niloticus). Vas-s présente une extrémité N-terminale tronquée de 16 aminoacides par rapport à la forme longue Vas. Les deux isoformes sont exprimées depuis les ovocytes jusqu'au stade où les cellules germinales primordiales vont migrer dans le mésoderme latéral. Aprsè l'implantation des cellules primodiales dans les crêtes génitales, l'expression de vas-s s'accroît, et celle de vas disparaît.  On retrouve une expression des deux isoformes au cours de la différenciation morphologique des deux types de gonades indépendamment du sexe génotypique. Dans l'ovaire, vas-s s'exprime de façon prédominante pendant toute l'ovogenèse. Dans le testicule, c'est surtout vas qui s'exprime.

66. La symétrie radiale des cœlentérés cnidaires comme l'hydre d'eau douce est supposée être celle des premiers métazoaires avant que la symétrie bilatérale ne s'établisse. Il semble que le corps de l'hydre est ce qui a donné la tête des métazoaires et que le tronc s'est surajouté à partir d'une zone étroite située entre le blastopore et les tentacules. Si cela est vrai le pied de l'hydre correspond à la partie antérieure du corps (cerveau et cœur). Une revue sur l'acquisition de la bilatéralité à partir du schéma primitif est parue dans H Meinhardt; BioEssays 24 (FEB02)185‑191.

67. La coordination des développements de l'ovocyte et des cellules somatiques du follicule est indispensable au développement de l'ovocyte proprement dit, mais qui fait quoi est encore un problème à résoudre. Des chercheurs du Jackson Laboratory ont implanté des ovocytes des follicules secondaires dans des follicules primaires pour voir ce qui se passe. Cela accélère le développement des follicules primaires. L'ovocyte des mammifères régule apparemment le développement des follicules ovariens. JJ Eppig et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (05MAR02) 2890-2894.

La Physiologie

68. Les PPARs (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors) sont des facteurs de transcription appartenant à la super famille des récepteurs nucléaires. (Voir également  le §71). Ils interviennent dans la transcription sous la forme d'hétérodimères avec le récepteur de l'acide 9-cis-rétinoïque. Quand ils ne sont pas liés à ce récepteur, ils le sont à un co-répresseur. Contrairement à ces derniers, ils sont assez éclectiques pour leurs ligands. Les acides gras polyinsaturés et les eicosanoides peuvent activer les trois types de PPARs, d'autres ligands sont plus spécifiques.

On en connaît trois types. PPARa est exprimé à assez haut niveau dans les tissus utilisant les acides gras comme substrat énergétique comme les hépatocytes, le muscle cardiaque et certaines cellules des tubules rénaux. PPARg est surtout exprimé dans les adipocytes et un peu dans la muqueuse du colon. PPARd (alias PPARß) est ubiquitaire, avec une forte expression dans le placenta, le cerveau et le gros intestin.

Les trois isoformes sont des régulateurs importants de l'homéostasie des lipides. PPARa est activé par une variété d'acides gras à chaînes moyenne ou longues. Et stimule le métabolisme des lipides en induisant la b-oxydation peroxysomale et l'w-hydroxylation des acides gras. PPARg joue un rôle activateur important dans l'adipogenèse.

Mais si PPARa et PPARg ont été pas mal étudiés, les fonctions de PPARd sont plus obscures. Dans des expériences de co-transfection, PPARd se révèle être un puissant antagoniste de PPARa et PPARg. PPARd se lie aux PPREs (Peroxisome Proliferator Response Element) des régions régulatrices des gènes cibles. Quand PPARd est dépourvu de ligand, il s'associe avec des co-répresseurs comme SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid hormone receptors), SHARP (SMRT and Histone deacetylase-Associated Repressor Protein). Ces co-répresseurs permettent l'action répresseur des PPARs dépourvus de ligands en occupant les PPREs et en permettant le recrutement d'histones désacétylases (voir le §71 également).

PPARd inhibe l'expression des cibles de PPARa tandis qu'un mutant de PPARd n'interagissant pas avec SMRT ne réprime plus l'expression des gènes cibles de PPARa. Compte tenu de l'expression ubiquiste de PPAR∂ et celle, plus spécifique, de PPARa et PPARg, PPARd, il doit être un intégrateur et un modulateur des réponses à PPARa et PPARg. Y Shi et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (05MAR02) 2613-2618.

69. Les gènes de la famille Notch codent des récepteurs transmembranaires intervenant dans la détermination cellulaire au cours du développement. Il existe de multiples homologues (Notch1 à Notch4) de Notch chez les mammifères. Ils sont synthétisés sous la forme d'un précurseur de 300kDa qui est ensuite clivé dans le Golgi en une sous-unité extra-cellulaire avec 29–36 répétitions de type EGF (Epidermal Growth Factor) et trois copies d'un motif appelé Lin-12/Notch/Glp, une sous-unité transmembranaire avec une courte extrémité extra-cellulaire et un domaine intra-cellulaire avec des répétitions de type cdc10/ankyrine et un domaine contenant le motif PEST (Pro-Glu-Ser-Thr dont la phosphorylation cible usuellement la protéine vers une dégradation). Les sous-unités se réassemblent dans le réseau transgolgien sous forme hétérodimérique dans la membrane, stabilisée par les répétitions lin-12/Notch interagissant avec le domaine transmembranaire.

La fixation du  ligand (Delta ou Serrate) sur la partie extra-cellulaire entraîne le clivage du domaine intra-cellulaire et son transfert dans le noyau. On soupçonne également un clivage supplémentaire de la partie extra-cellulaire. Le rôle des formes solubles de Delta est controversé. Sur des cellules en culture, elles se comportent comme des agonistes de Notch. In vivo elles se comportent comme des antagonistes.

On vient de montrer que l'activité transductrice du signal des formes solubles de Delta-like-1 (sD1) sur le récepteur Notch2 (N2) est beaucoup plus faible que celle de la forme longue, et que cette forme soluble est en fait un agoniste partiel de sD1. SD1 déclenche le clivage de l'extension extra-cellulaire du domaine transmembranaire de N2, mais ne stimule que très faiblement celle du domaine cytoplasmique à ciblage nucléaire. Ceci indique que si le domaine extra-cellulaire du ligand de Notch suffit au clivage extra-cellulaire de Notch, le clivage du domaine cytoplasmique de Notch exige des éléments de la partie intracellulaire du ligand. K Shimizu et al.; The EMBO Journal 21 (01FEB02) 294-302.

 Le système immunitaire

70. La voie Notch des mammifères (voir le §69) comporte au moins quatre récepteurs (Notch1-Notch4) et une foule de ligands (Jagged1-Jagged2 et la famille Delta). Lors de l'interaction entre récepteur et ligand la protéine Notch est clivée et libère le domaine intra-cellulaire NICD qui migre vers le noyau et se lie par ses domaines RAM et ankyrine au régulateur négatif de la transcription CSL (du CBF1 humain, Supressor of hairless Su(H) de la drosophile et Lag-1 de Caenorhabditis). Associé à CSL il convertit ce dernier en activateur de l'expression de répresseurs transcriptionnels, les protéines Hes qui modulent des facteurs de transcription tissus-spécifiques, etc….Vous y êtes? Chez la drosophile plusieurs gènes sont des cibles directes du complexe NICD/CSL, c'est quand même plus simple. On retrouve la même chose chez la souris, mais les cibles tissus-spécifiques connues sont encore rares chez cette dernière.

On a démontré un  rôle important et non redondant du récepteur Notch1 dans la différenciation des lymphocytes T dans le thymus.  Ainsi la disruption de Notch11 ou de Hes1 en aval bloque cette différenciation à un stade précoce. Il est fort probable, de plus, que Notch soit impliqué dans la spécification du récepteur des cellules Tab par rapport aux cellules Tgd.

On a récemment démontré que le gène pTa codant le précurseur de la chaîne a est une cible transcriptionnelle de Notch. La protéine codée est transmembranaire et s'apparie avec une chaîne b nouvellement réarrangée pour donner le précurseur du récepteur de la cellule T (TCR). Le gène pTa est exprimé dans les cellules T immatures et sa stimulation correspond à la détermination définitive de la cellule T. La stimulation de l'expression de pTa par la voie Notch vient d'être analysée. L'enhancer de pTa possède des sites reconnus par CSL. Leur mutation abolit l'induction par Notch. B Reizis et al.; Genes & Development 16 (01FEB02) 295-300. Il y a donc une induction directe.

71. Les ligands de PPARa et PPARg ont une action anti-inflammatoire dans les macrophages en réprimant l'expression de plusieurs gènes. PPARg  est exprimé dans les lymphocytes T. Il y joue probablement un rôle dans la production des cytokines et dans la susceptibilité à l'apoptose. En fait les lymphocytes B comme T expriment PPARa. PPARg est prédominant dans les cellules de la lignée myéloïde (macrophages et granulocytes). L'expression de PPARa est déprimée après activation des cellules T, alors que c'est l'inverse pour PPARg.  On pense que les facteurs du milieu jouent un rôle dans ces régulations car les cellules T des plaques de Peyer (foyers immunitaires dans l'intestin), surexpriment PPARa par rapport aux cellules T périphériques. PPARa régule bien des gènes, mais il faut, pour cela, inhiber les histones désacétylases, car les co-activateurs réorganisent la chromatine. L'activation de PPARa dans les lymphocytes s'oppose à plusieurs voies de signalisation impliquées dans l'inflammation (NF-kB, STATs, et AP-1).

Les animaux âgés possèdent un NF-kB actif dans les deux lignées lymphocytaire et myéloïde de la rate et des organes lymphoïdes périphériques. On peut réduire le niveau d'activité de NF-kB par des activateurs de PPARa. DC Jones et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (01MAR02) 6838-6845.

72. Current Opinion in Immunology 14 (FEB02) est consacrée à une mise au point sur la présentation des antigènes. Grossièrement les MHC classe I se lient à et exposent des peptides dérivant de parasites intracellulaires (en particulier des virus) tandis que les MHC classe II lient et exposent des peptides derivant de microorganismes extracellulaires et leur produits qui ont été internalisés et découpés dans la cellule. Les MHCs chargés de peptides sont reconnus par des acteurs différents: les MHC classe I sont reconnus par les cellules T cytotoxiques (exprimant CD8) qui détruisent directement les cellules infectées ainsi désignées, tandis que les MHC classe II sont reconnus par les cellules Th (T helpers exprimant CD4) qui interviennent indirectement en activant les lymphocytes B producteurs d'anticorps circulants et les macrophages qui détruisent les bactéries. Quatre articles sont consacrés à la présentation par les MHC II. AM Lennon-Duménil et al.; 15-21, traitent des activités protéolytiques impliquées dans le traitement des antigènes en peptides utilisables par les molécules du MHC II pour une présentation aux cellules T. On a, ainsi, mis beaucoup de temps pour identifier les protéases concernées.

P Brocke et al.; p. 22-29 discutent les rôles de deux nouveaux acteurs de la voie des MHC-II pathway, HLA-DM, et HLA-DO (HLA étant les MHC humaines). DM facilitent l'ablation de la chaîne invariante des molécules MHC classe II. Je rappelle que les molécules MHC-II sont constituées par un dimère ab  qui s'insère dans la membrane du reticulum puis migre, par continuité, dans les endosomes dont il vérifie le contenu. Ce dimère est très précocément associé à ce que l'on appelle la chaîne invariante dont le clivage protéolytique est indispensable au démasquage du site de fixation des peptides. DM permet la formation d'un pool de MHC-II chargées avec les peptides ayant la plus grande affinité. Cette stabilité du complexe laisse assez de temps pour que la réaction des cellules T ait le temps de s'établir (encore que des données récentes signalent que l'activation des cellules T est plus rapide qu'on ne le pensait (voir §73). DO a un rôle beaucoup plus énigmatique et les auteurs esssayent de montrer qu'elle facilite l'interaction des cellules B avec des T helpers CD4+ .

Le problème confus des déplacements intracellulaires des molécules de MHC-II est traité par E Hiltbold et al.; p.30-35. Le trajet des complexes MHC-II-chaîne invariante au travers de la voie sécrétoire endosomes/lysosomes est l'objet de controverses, et il en est de même pour le trajet du complexe chargé avec le peptide antigénique vers la membrane de la cellule présentatrice. Un peu d'ordre ferait du bien, et les auteurs en conviennent.

La revue de EJ Sundberg et al.; p. 36-44, traite des superantigènes. Ce sont des ligands particuliers des TCRs qui stimulent les cellules T de façon non spécifique et donc concernent une large population de cellules T qui doivent seulement exhiber des régions variables spécifiques dans leur seule chaîne Vb du récepteur (au lieu des séquences Vb, Db, Jb, Va et Ja qui doivent toutes reconnaître l'antigène dans le cadre classique de la présentation par le MHC). Non seulement la réponse est importante (jusqu'à 20% des cellules T, mais le seuil de mise en action est extraordinairement faible, de l'ordre de 10-12g/ml d'antigène). L'explosion de cette population est suivie, normalement par une anergie et une délétion. Ces antigènes sont des produits de rétrovirus mais surtout des toxines bactériennes (Staphylocoques et Streptocoques) qui déclenchent le syndrome du choc toxique.

La présentation croisée (cross-presentation) est traitée par Z Li et al.; p.45-51. Il existe un paradoxe concernant les cellules dendritiques. Comment les cellules dendritiques, présentatrices professionnelles, à moins d'être infectées par un virus, peuvent elles contribuer à l'activation des cellules T CD8+ par les peptides liés aux MHC classe I.

Le "cross-priming" implique la présentation par les MHC classe I, d'antigènes exogènes et pas intracellulaires constitue une réponse possible. Plus curieux est l'intervention des protéines heat shock (HSPs). La revue discute de la capture de l'antigène, son internalisation par les HSPs. Ceci implique l'existence de récepteurs pour ces HSPs. Ils existent et sont spécifiques. Ce mécanisme concerne les cellules en décrépitude ou carrément mortes. Ces protéines ont, par ailleurs, un rôle adjuvant pour la cellule présentatrice d'antigènes donc stimulant sa fonction immunitaire. Comme souvent cette vue un peu révolutionnaire n'a pas encore convaincu tout le monde.

L'activation des cellules T fait l'objet de trois revues. MG Rudolph et al.; p.52-65 traitent de la spécificité des interactions entre TCR et MHC chargé. Elle discute surtout des bases structurales de l'interaction des récepteurs a/b TCRs. Ils analysent le rôle de la flexibilité de la molécule du récepteur. On ne comprend toujours pas comment de petits changements de la structure du peptide peuvent modifier profondément la réponse des cellules T. les données structurales actuelles obtenues sur cristaux ne sont d'aucune aide.

MF Krummel et al.; p.66-74 analysent la synapse et sa formation (voir également le §73). Les auteurs font le point sur les mouvements des protéines clés CD4 et TCRz, le rôle du cytosquelette ainsi que sur celui des combinaisons hétérodoxes de MHC avec les peptides à la surface des présentatrices du complexe peptide-MHC dans l'engagement des TCRs et le déclenchement des signaux dans les cellules T.

Les récepteurs TCRs sont associés aux co-récepteurs CD8 ou CD4. R König; p.75-83 tente de mettre d'accord la cinétique des interactions TCR/ligand et la réorganisation de la synapse  avec ce qui est connue de la liaison respective entre co-récepteurs CD8 et CD4 et MHCs classe I et II. Dans le cas de CD4 et des MHC classe II, on pense qu'ils pourraient concentrer les MHC II au voisinage du TCR dans la synapse. Mais…

73. La synapse immunologique est la zone de contact entre une cellule T et une cellule présentatrice d'antigène (APC). La synapse est organisée en cercles concentriques. Pendant les 30 premières secondes, les cellules T s'immobilisent, et l'on voit se former un cercle des complexes peptides-MHC (attachés alors à leur récepteur TCR sur la cellule T) autour des molécules d'adhésion ICAM-1 regroupées au centre, ou c-SMAC. L'activation des cellules T est alors visualisable par les flux d'ions calcium dans la cellule. Dans les 15 minutes suivantes, la topographie s'inverse avec les complexes peptides-MHC-TCR se regroupant au centre, tandis que les ICAM-1 parcourent le chemin inverse vers la zone périphérique ou p-SMAC avec une intégrine, LFA-1. On admettait qu'elle permet le regroupement des récepteurs, des complexes MHC-peptides des APCs, des radeaux lipidiques, etc… et le déclenchement de l'activité de la cellule T qui va durer plusieurs heures, ce que permet la stabilité de cette structure. On vient de montrer qu'en réalité, la voie d'activation déclenchée par la tyrosine kinase se déclenche à la périphérie, avant la formation de la synapse et a déjà beaucoup décliné lors de la formation de la synapse. Ceci signifie que le rôle admis de la synapse dans le décelenchement des signaux dans la cellule T est loin d'être clair KH Lee et al.; Science 295 (22FEB02) 1539-1542.

74. Les cellules T portent deux types de récepteurs. Environ 90% portent les récepteurs ab, et ce sont les classiques cellules T circulantes (CD8+) qui reconnaissent et détruisent les cellules infectées. La fonction de celles portant le récepteur gd étaient encore inconnue. On réalise, maintenant, que les cellules gd des épithéliums répondent directement à des MHC (complexe majeur d'histocompatibilité), sans que ces protéines soient associées à un peptide.

L'activation des cellules T ab est modulée par l'interaction des molécules du MHC-I avec des récepteurs activateurs ou inhibiteurs. Ces récepteurs ont d'abord été identifiés chez les cellules NK (Natural Killer), mais sont présents (KIRs pour Killer cell Ig-like Receptors) sur diverses cellules T. Ceux de ces récepteurs qui sont inhibiteurs accroissent le seuil d'activation de la cellule, ce qui limite une activation chronique détestable. On connaît moins bien le rôle des récepteurs activateurs.

Des molécules parents éloignés des molécules du MHC-I, appelées MIC-A et MIC-B, qui n'ont pas de rôle dans la présentation des antigènes, mais fonctionnent comme des signaux de détresse dans la cellule, interagissent avec un complexe récepteur activateur, NKG2D–DAP10, qui active les cellules NK, stimule la prolifération et les fonctions des cellules Tab et gd et joue donc un rôle important dans l'immunité innée.

DAP10 intervient par le biais d'une activation par phosphorylation d'une phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). MICA et MICB ne sont exprimées que dans les fibroblastes et les cellules épithéliales. Elles ne répondent pas aux interférons  mais sont induites par des chocs thermiques grâce à des heat shock elements présents en amont de leurs gènes.

Elles sont, normalement exprimées dans l'épithélium intestinal. On vient de montrer que l'adhésine AfaE d'E.coli se fixe sur CD55 (alias decay-accelerating factor une protéine ancrée par le glycosylphosphatidylinositol à la surface de l'épithélium intestinal. Ceci déclenche très rapidement une réponse de stress avec expression de MIC-A à la surface et production d'interféron g. V Tieng et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (05MAR02) 2977-2982. Voir également le commentaire de T Spies; p. 2584-2586.

Les lymphocytes intestinaux constituent une énorme population (un sixième des entérocytes). Ce sont surtout des cellules T CD8+ ab, dont beaucoup portent des homodimères CD8aa que l'on ne retrouve pas dans les cellules T circulantes, quelques CD4-CD8-ab peu communes et des cellules Tgd également atypiques, car exprimant des récepteurs Vd1. Ces cellules sont continuellement exposées à MIC, répondent à des cellules exprimant MIC et sont donc en permanence sur le qui-vive. Elles expriment donc faiblement NKG2D. Les cellules intestinales produisent l'interleukine IL-15 lors d'une infection, et l'expression de NKG2D est relancée par cette interleukine.

En fait les cellules T Vd1 gd reconnaissent les auto-antigènes probablement libérés lors d'une agression et leur récepteur NKG2D est réprimé pour éviter une réaction autoimmune.

75. La première ligne de défense des Vertébrés contre les pathogènes microbiens est la voie des récepteurs Toll-like (TLRs) présents sur les cellules présentatrices d'antigènes. Dix TLRs ont été identifiés chez les mammifères. Cinq (TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 et TLR9) répondent, comme c'est le cas pour toute la défense innée, à des patrons généraux communs aux pathogènes, mais absents dans l'animal, comme les îlots CpG ou les lipopolysaccharides bactériens (LPS), par exemple. Ces TLRs possèdent de multiples répétitions riches en leucine (LRRs) à l'extérieur de la cellule et un domaine TIR (Toll-IL-1-receptor) cytoplasmique. La stimulation de TLR2 et TLR4 entraîne le recrutement d'un adaptateur, MyD88 et de la IL–1-receptor-associated kinase (IRAK, une sérine kinase) Cette kinase déclenche une voie de signalisation vers le noyau. MyD88 et IRAK sont deux composants qui, avec TRAF-6 (un des multiples Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factors) vont activer le facteur de transcription NF-kB, important dans le système immunitaire.

On connait, chez les plantes, de nombreux gènes de résistance. On en  distingue cinq classes : des protéines kinases intracellulaires; des protéines kinases de type récepteur avec  un domaine extra-cellulaire de type LRR; des protéines intracellulaires à LRR associée à un site NBS fixant les nucléotides (Nucleotide Binding Sites) et un motif leucine zipper, des protéines intracellulaires NBS-LRR avec un domaine TIR (Toll and Interleukin-1 Receptor); et, enfin, des protéines LRR extracellulaires ancrées dans la membrane. Les plus nombreuses sont les cytosoliques à domaine NBS flanqué par un domaine TIR N-terminal et un domaine LRR C-terminal.

On ne connaît pas de contreparties des protéines à NBS-LRR chez les mammifères, mais les cellules peuvent reconnaître un lipopolysaccharide (LPS) bactérien dans le cytosol et plusieurs protéines ayant des analogies structurales ont été détectées récemment. Ce sont les protéines dites Nod. Une revue sur ces protéines est parue avec N Inohara et al.; Current Opinion in Microbiology 5 (FEB02) 76–80.

Ces protéines dont deux sont connues, Nod1 et Nod2, sont des facteurs cytosoliques apparentés au régulateur de l'apoptose Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1). Elles permettent de répondre à la présence de LPS et interagissent avec la kinase RICK (alias RIP2 ou CARDIAK). Des anomalies de Nod1 et Nod2 entraîneraient des inflammations du tube digestif. Les auteurs ont fait un effort pour faire un pont avec l'immunité chez les plantes mais on serait heureux si les auteurs n'utilisaient pas de sigles à eux (NBD pour NBS par exemple), le terme de Nod existe mais prête à confusion, etc….

76. Les récepteurs Toll-like (TLRs) sont essentiels pour l'immunité innée. La liaison avec le récepteur provoque un regroupement rapide de protéines (IL-1RI et IL-1RAcP, l'adaptateur MyD88, la sérine/thréonine kinase IRAK et la protéine Tollip. Tollip s'associe à TLR2 et TLR4 et réprime l'activation cellulaire via celle d'IRAK après activation du TLR.On vient de montrer que Tollip est un substrat d'IRAK qui la phosphoryle après stimulation par des lipopolysaccharides ou l'interleukine-1 (IL-1). C'est un autre moyen de limiter la production des susbtances pro-inflammatoires. IL-1 est, en effet, une cytokine pro-inflammatoire à effets multiples. Elle agit sur les facteurs de transcription NF-kB et AP-1. En l'absence d'IL-1b, Tollip est associée à IRAK, et le recrutement de Tollip-IRAK vers le récepteur dépend de l'association de Tollip à IL-1RAcP. MyD88 provoque alors l'autophosphorylation d'IRAK qui libère IRAK de Tollip et des IL-1Rs. G Zhang et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (01MAR02) 7059-7065. Pour Tollip voir K Burns et al.; Nature Cell Biology 2 (JUN00) 346-351.

Les Pathogènes

77. La protéine HET-s de Podospora anserina est un prion fongique découvert par des chercheurs de Bordeaux. Elle peut, en effet, être transmise horizontalement et donne lieu à des agrégats sous sa forme prion. Elle présente une différence notable par rapport aux prions de la levure, celle de causer un arrêt de la croissance et la mort cellulaire lorsqu'elle est co-exprimée avec la protéine HET-S dont elle diffère par 13 acides aminés sur 289. Cette pathogénicité la rapproche donc beaucoup aux prions animaux.

Ce prion régule un processus classique de reconnaissance cellulaire appelé incompatibilité hétérocaryotique. La co-expression de HET-s et HET-S dans la même cellule entraîne la mort cellulaire. Les souches het-s et het-S sont dites incompatibles. Il existe néammoins, deux phénotypes alternatifs, [Het-s*] et [Het-s] de HET-s. Les souches [Het-s] sont incompatibles avec les het-S, tandis que les [Het-s*] sont neutres. Une souche [Het-s*] est convertie en la forme réaactive [Het-s] par contact avec une autre souche [Het-s]. L'élément [Het-s] se répand alors dans tout le mycelium à une vitesse de plusieurs mm par heure. Les souches [Het-s*] peuvent acquérir spontanément le phénotype [Het-s] et, de fait, l'infection se généralise avec le temps.

L'équipe vient d'exprimer la protéine dans Escherichia coli et montre que l'autoagrégation est démontrable in-vitro et donne des fibrilles. Un fragment de 7kDa de cette forme agrégée est résistant à la protéinase K, comme les prions animaux et on retrouve le réarrangement en feuillets ß antiparallèles. On a probablement là un modèle particulièrement intéressant des prions animaux.

78. Les fonctions présomptives de la protéine PrP font l'objet d'une revue de VR Martins et al.; FEBS Letters 512 (13FEB02) 25-58.

C'est une protéine de la membrane plasmique des neurones (mais aussi d'autres types cellulaires), ancrée par un glycosyphosphatidylinositol. On ne cesse d'accumuler des rôles probables du cuivre qui se fixe sur la protéine et entraîne une protection contre les stress oxydatifs. La protéine intervient également sur l'adhésion et la survie cellulaire, la différenciation, et sur les signaux cellulaires. Cette pleïotropie donne une impression d'importance biologique mais ne permet pas de définir un mécanisme.

La revue discute de la régulation de l'expression de la protéine et de sa localisation. Puis elle discute des interactions avec la glycoprotéine de matrice extra-cellulaire appelée laminine.

Le gène Prn-p codant la protéine PrPc contient trois exons chez le rat et la souris et deux chez le hamster et l'homme, dont le dernier code la protéine. Deux peptides signal de ciblage membranaire sont présents. L'un est N-terminal, partie clivée lors de la synthèse dans le reticulum, et le second est C-terminal, tpermettant la fixation sur l'ancre membranaire glycosyphosphatidylinositol. T

Comme la transcription est permanente chez l'adulte, on en a conclu qu'il s'agissait d'un gène "de ménage", mais son expression est étroitement régulée au cours du développement. Le promoteur de Prn-p a été identifié chez la souris, le rat, le hamster, les bovins évidemment, et chez l'homme. Il ne possède pas de TATA box et contient des motifs riches en GC qui pourraient être des sites reconnus par les facteurs de transcription Sp-1,  AP-1 (Activator Protein) et AP-2. Mais il est difficile d'admettre que ces facteurs ubiquistes puissent intervenir dans une expression spécifique. Il y a, en réalité, plusieurs autres régions régulatrices et, de plus, il semble bien que la structure de la chromatine ait son importance. .

PrPc a une forte affinité pour la laminine avec un décapeptide responsable situé vers l'extrémité C-terminale de la chaîne Q1. Cette interaction  joue un rôle dans l'adhésion et l'entretien des neurones. Elle interagit également avec le récepteur de la laminine. De cette interaction dépendent 20 à 50% de l'internalisation de PrPc. En effet la protéine est régulièrement recyclée sans être détruite. Mais ce pourcentage indique que d'autres éléments interviennent dans le recyclage. Par ailleurs, c'est le même site du récepteur qui interagit avec la laminine et PrPc, ce qui entraîne une exclusion réciproque. La signification de cette observation reste à établir.

La protection contre les stress oxydatifs, etc… est liée au complexe associant PrPc chargée en cuivre, un ligand récemment décrit, (p66), et la laminine.

79. Un système de sécrétion de type IV du type VirB d'Agrobacterium est présent chez les Brucella suis. Il est codé par un opéron de 12 gènes induit dans les macrophages 3 heures après l'infection. ML Boschiroli et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (05FEB02) 1544-1549.

80. On a essayé d'immuniser des poulets contre des formes intestinales colonisatrices de Campylobacter jejuni avec des mutants de dnaJ et de cadF non colonisateurs. L'effet proecteur est nul. RL Ziprin et al.; Current Microbiology 44, n°4 (MAR02) 221-223.

81. On trouvera dans GK Schoolnik; Current Opinion in Microbiology 5 (FEB02) 20-26, une revue touffue sur la génomique fonctionnelle et comparative des bactéries pathogènes. Elle est évidemment basée sur l'utilisation des techniques récentes comme les microréseaux d'expression, ou ceux d'analyse de la teneur des génomes. Elle est plus particulièrement consacrée aux profils d'expression différentiels face aux signaux de l'hôte.

On peut ainsi analyser l'expression des gènes qui permettent l'adaptation à l'hôte et ceux qui sont impliqués dans la virulence. On peut comparer ces deux types de profils entre deux bactéries.

Un des grands problèmes rencontrés est le très faible pourcentage des messagers issus du pathogène noyés parmi ceux des tissus infectés. On extrapole donc à partir de bactéries cultivées in-vitro avec des présupposés à vérifier. On commande, dans ce cas, la virulence par des facteurs du milieu. L'exemple de ce qui se passe lors d'une carence en fer (ce qui se passe dans l'hôte) pour Pasteurella multocida est analysé. Les réponses sont manifestement pleïotropiques et il n'est pas très facile de distinguer ce qui est directement une réponse à la carence.

L'auteur fait ensuite le point sur la tolérance à l'acidité. Il utilise l'exemple des Shigella et des biotypes entérohémorrhagiques et entéroinvasifs d'E.coli . Tous  doivent franchir la barrière stomacale très acide. On sait que la croissance d'E.coli en présence d'acétate améliore la tolérance aux pHs acides. On a donc analysé ce qui se passe dans ce cas en comparant avec la souche classique de laboratoire K12. On s'est concentré sur les 1387 ORFs présents chez les pathogènes et absents de K12. On a retrouvé parmi les 26 gènes surexprimés 6 connus pour intervenir dans le maintien du pH intracellulaire.

Helicobacter pylori, lui, ne traverse pas les pHs ultracides de l'estomac, il y persiste pendant des décades. Un profil d'expression indique que sur la quasi-totalité des gènes de la bactérie, 80 sont surexprimés par un pH acide dont 16 étaient connus pour répondre, soit chez Campylobacter, soit chez d'autres bactéries, et 43 autres déjà annotés fonctionnellement ne l'étaient pas. L'interprétation de ces résultats est rendue difficile par les conditions de mesure (milieu solide avec ses problèmes de diffusion, stimulus prolongé qui risque d'entraîner un nouvel équilibre plutôt qu'une adapation en cours).

On a également pu étudier les effets du "quorum sensing" sur Streptococcus pneumoniae (et la transformation) ou sur Bacillus subtilis (et la sporulation).

Une oxygénation relance la prolifération de Mycobacterium tuberculosis après de longues périodes de latence. On a étudié les effets de l'hypoxie sur les bactéries actives. On a identifié, parmi les 3924 ORFs, 47 qui sont surexprimées au cours de l'établissement de l'hypoxie. Mais les deux tiers sont de fonctions inconnues. Quelques uns sont connus comme intervenant dans ces conditions, comme le gène acr de l'a-crystalline, une chaperone de14 kDa.

Deux des trois gènes d'un opéron code un récepteur classique à deux composants. La disruption du gène du régulateur empêche l'adaptation aux faibles taux d'oxygène.

Malgré les difficultés liées au fait que, pour la génomique comparative, on ne dispose généralement que d'un seul organisme complètement  séquencé, ce qui fait qu'on ne peut repérer les gènes absents de la séquence de référence, la technique permet d'obtenir des informations précieuses sur la diversité des souches. On peut détecter des réarrangements, des délétions dans des séquences répétées, et des différences dans le nombre des gènes multicopies. On a ainsi pu comparer la souche de référence H37Rv de M. tuberculosis avec la souche pathogène M.bovis et la souche vaccinale BCG qui a été obtenue par cultures in-vitro en série entre 1908 et 1921. On a aisni pu montrer que les souches "atténuées" ont perdu un grand nombre d'ORFs, notamment de facteurs de transcription, mais que ces délétions dépendent des souches vaccinales utilisées. Il en est de même pur les souches d'Helicobacter pylori dont l'atténuation de la virulence correspond à des pertes de gènes, notamment dans l'îlot de pathogénicité cag.

82. Des chercheurs du Kansas ont mesuré les contaminations bactériennes des aérosols de deux bâtiments d'élevage porcin à aération naturelle ou forcée. On y trouve Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Listeria, Enterococcus, Nocardia, Lactobacillus et Penicillium à raison de 1 à 3 104 CFU/m3 en moyenne au total. Les auteurs comparent deux méthodes pour la quantification. BZ Predicala et al.; Current Microbiology 44 (FEB02) 136-140.

83. On sait que le pH bas et la présence de nombreux acides gras volatils observés lors d'une alimentation riche en céréales limitent sérieusement les population des E.coli O157:H7, pathogènes humains, dans le rumen. On pense donc que les populations observées sont transitoires. Mais le rumen est quand même un réservoir réalimentant la flore intestinale, alors qu'on cherche à réduire la dissémination de la bactérie. Le simple fait de passer d'une alimentation riche en amidon comme le maïs, à une autre pauvre comme le fourrage de luzerne diminue déjà ce portage des bactéries. Travaillant sur un rumen artificiel des chercheurs du Nebraska montrent que l'adjonction de sucres prébiotiques (sorbitol) à l'alimentation bovine permet une exclusion des E.coli O157:H7 par une sélection de bactéries capables d'une compétition plus grande dans la flore ruminale. A de Vaux et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (FEB02) 519-524.

84. Les Entamoeba sont des amibes du tube digestif causant des amibiases pénibles pour le porteur. Elles sont véhiculées sous forme de cellules enkystées. On a montré que le développement des kystes d'Entamoeba invadens nécessite des molécules couvertes de galactose comme les mucines. On suppose que des lectines sont impliquées et regroupent des molécules membranaires qui lancent un signal intracellulaire à caractériser. Or on vient de montrer que l'on peut obtenir l'enkystement sans galactose quand on ajoute des catécholamines (épinéphrine et norépinéphrine) à des doses micromolaires. Seuls les agonistes de récepteurs adrénergiques b1 sont efficaces mais pas ceux des récepteurs a ou  b2. Les antagonistes ont l'effet inverse attendu. Les amibes contiennent des catécholamines et au moins une est sécrétée quand les ligands à galactose sont présents.

Le récepteur amibien des catécholamines fonctionne donc en aval des lectines à galactose et en amont de l'adénylyl cyclase. A Coppi et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (08MAR02) 8083-8090.

Les animaux transgéniques

85. La santé et la longévité de souris clonées font l'objet d'un article du groupe de A Ogura : N Ogonuki  et al.; Nature Genetics 30 (MAR02) 253-254.

Les chercheurs du même groupe d'Ogura avaient cloné 12 souris entre Mars et Septembre 1999 à partir de noyaux de cellules de Sertoli immatures. (voir A Ogura et al.; Biology of Reproduction  62 (JUN00) 1579-1584). Elles ont ensuite été suivies en permanence. Ils soulignent que la durée de vie des animaux est plus faible que celle d'animaux normaux de la souche utilisée, et que cela résulte le plus souvent de pneumonies et de déficiences hépatiques. Les nécroses du foie étaient responsable du fort taux de LDH ainsi que d'ammmonium sérique observé chez certaines de souris. De plus la production des anticorps est affaiblie, dès 4 à 5 mois, comme chez les bovins et caprins issus des mêmes techniques.

Les souris ont commencé à mourir après 311 jours et 10 d'entre elles étaient mortes à 800 jours. Deux clones ont bien survécu et pourraient probablement avoir une durée de vie normale.

Le groupe avait également participé à une série de clonage en cascade et avait remarqué que le pourcentage de succès baissait à chaque clonage et que les derniers clones (le sixième) avaient été annihilés par cannibalisme des mères (T Wakayama  et al.; Nature 407 (21SEP00) 318-319).

Voir le commentaire de chercheurs d'Advanced Cell Technology dont Teruhiko Wakayama (ACF Perry  et al.; Nature Genetics 30 (MAR02) 243-244).

86. Un nouveau commentaire sur les porcs transgéniques rendus immunologiquement compatibles (?) avec l'homme par inactivation du gène de la 1,3-galactosyltransférase, l'enzyme majeure de modification des antigènes entraînant le rejet de greffe est paru dans Nature Biotechnology 20 (MAR02) 203. Il s'agit des porcs déjà évoqués de PPL Therapeutics et de Immerge BioTherapeutics (voir le Bulletin de Février §85). L'article de PPL Therapeutics décrivant la technique est paru avec Y Dai et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 251-255. Voir également le commentaire de JL Platt; p.231-232.

Le commentaire souligne que le pionnier Imutran (maintenant défunt) prédisait il y a 7 ans que les organes seraient disponibles en 2002. Or il reste encore beaucoup de choses à faire et notamment éliminer plusieurs autres gènes et, face aux réticences des autorités réglementaires qui ne disposent d'aucun moyen fiable de détecter des rétrovirus éventuels pouvant se multiplier chez les transplantés et se répandre dans la population après adapatation, les chances de réussite économique se font de plus en plus faibles. L'auteur du commentaire souligne que d'ici là d'autres techniques pourraient émerger et rendre obsolète cette approche. Cela me fait penser au tube à grille des téléviseurs qui devait être beaucoup plus lumineux, mais qui a mis tellement de temps pour sa mise au point que les bons vieux tubes à masque se sont améliorés au point que le tube à grille en est mort à ma connaissance.

87. Le génome de Schizosaccharomyces pombe vient d'être séquencé par un consortium européen comportant essentiellement le Wellcome Trust Sanger Institute et Cancer Research U.K.  aidé par un contrat de la Communauté de 6,9 millions d'Euros.

Ce qu'il y a de remarquable c'est qu'il ne comporterait que 4 824 séquences codant des protéines, nombre le plus faible pour un eucaryote. Il reste à voir s'il n'utilise pas ces sé<uences de diverses façons. On n'a, en effet, identifié, par d'autres méthodes qu'une cinquantaine de gènes. Genetic Engineering News (15MAR02).

88. Pour tout ceux qui, comme moi, souhaitent savoir de quelle "bête" il peut bien s'agir quand un nom est énoncé, la revue de JFT Spencer et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 58 (JAN02) 147–156, sur les levures non conventionnelles peut être utile. Elle traite d'une dizaines d'entre elles avec leurs caractéristiques biologiques et leurs utilisations actuelles ou potentielles, avec les techniques de modifications génétiques disponibles.

89. On trouvera dans OA Koksharova et al. (de l'Institut Vavilov); Applied Microbiology & Biotechnology 58 (JAN02) 123–137, une revue très complète sur les outils génétiques utilisables pour les cyanobactéries.

90. Les éléments mobiles des procaryotes codent souvent une intégrase permettant une intégration site-spécifique dans le chrompsome de l'hôte. .

Quand le site d'intégration  (attB) réside dans un gène, l'élément intégratif porte, normalement dans son propre site d'intégration (attP), le même segment du gène qu'il déplace. De la sorte, et bien qu'il interrompt la séquence du gène dans lequel il s'insère, il remplace la séquence déplacée et l'activité est aussitôt restaurée. Dans tous les cas connus, c'est la partie aval (3') du gène qui est capturée dans attP.

On a avancé plusieurs explications pour la capture d'une séquence 3' plutôt qu'une séquence amont (5'). Aucune n'est donc pleinement satisfaisante. En gros, les éléments régulateurs amont sont beaucoup plus diffficiles à remplacer sans erreurs. On vient, cependant, de caractériser chez Mesorhizobium loti  un élément qui ne fait pas comme les autres et emmène un segment 5'.

Pour la majorité des intégrases classiques (tyrosine recombinases) un gène de tARN est le site d'intégration. Le gène de l'intégrase et le site attP sont normalement adjacents ce qui facilite  leur co-évolution. Dans la moitié des cas le gène de l'intégrase, int, est situé au voisinage du gène intact du tARN dans l'élément intégré.On peut donc détecter de tels évènements dans les génomes maintenant séquencés. Il y en a deux bien visibles dans le chromosome de Mesorhizobium loti . Les gènes intacts de tARN contenant attL sont orientés vers l'élément, comme c'est le cas lors d'une stratégie 3'.

Un autre élément cryptique est voisin du gène du tARN sérine, mais il est orienté en sens inverse. C'est très probablement un prophage, mais dont on ne retrouve aucun autre gène. Cette orientation pose plusieurs problèmes, ne serait-ce que le fragment de gène persistant dans attL devrait être exprimé, mais est-ce bien gênant.

Le tARN-Ser codé dans attR de l'élément doit, par contre être exprimé, étant le seul de son espèce pour les codons UCA. On retrouve exactement la même situation chez Bradyrhizobium japonicum. S Zhao et al.; Journal of Bacteriology 184, n°3 (FEB02) 859-860.

91. Les chromosomes des Streptomyces sont linéaires. Leurs télomères contiennent de longues répétitions terminales inversées et des protéines terminales liées de façon covalente au chromosome. On vient de décrire  une protéine de 20 kDa, et un dérivé protéolysé de 10 kDa. Le gène codant cette  protéine, tpgC, a été cloné. Il est voisin des télomères, ce qui favorise probablement leur co-ségrégation et leur co-évolution. La protéine indique des particularités de structure qui permettrait éventuellement une liaison avec la membrane. On retrouve, par ailleurs, des pseudogènes. CC Yang et al.; Molecular Microbiology 43, n°1 (JAN02), 297-305.

92. On vient de décrire encore un nouveau (à ma connaissance) mécanisme d'intégration dans le chromosome,  au nom d'ailleurs paradoxal : recombinaison illégitime facilitée par homologie. En principe l'intégration se fait, soit par recombinaison homologue soit par recombinaison illégitime, quand aucune homologie n'est utilisée. Cette dernière permet l'intégration à faible fréquence d'ADNs non apparentés, la première fonctionnant au sein d'une espèce.

Acinetobacter est une bactérie Gram- qui peut incorporer des ADNs homologues ou étrangers. L'intégration d'ADN étranger est, cependant,  rare (10-9 fois plus faible que pour les ADNs homologues). La fréquence d'intégration augmente de 5 ordres de grandeur quand on  joint à une des extrémités une séquence homologue (pas aux deux qui permettrait une intégration par homologie).  L'examen des sites d'insertion montre la présence de courtes séquences (3-8 bp) identiques entre ADN introduit et ADN autochtone, ce qui indique ue recombinaison illégitime. L'ADN homologue semble servir d'ancre laissant le temps à une recombinaison illégitime de fonctionner sur la même molécule. Des séquences homologues d'environ 200 pb semblent suffire pour constituer une ancre.

 Les brins pénètrent dans le sens 3' vers 5' et les deux brins sont incorporés de la même façon. On peut avoir intégration de milliers de pb, et une quantité équivalente est délétée dans le génome d'accueil. J de Vries et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2094-2099.

93. Le compte rendu du colloque intitulé "Cell-Cell Communication in Bacteria" qui s'est tenu à Snowbird, Utah, en Juillet 2001 est paru sous SC Winans et al.; Journal of Bacteriology 184 (15FEB02)  873–883.  Il s'agit du "quorum sensing".

Les bactéries Gram+ échangent classiquement des oligopeptides issus du clivage d'un précurseur. Le signal est transmis par un récepteur à deux composants et une phosphorylation par une kinase initiale.  Chez les  protéobactéries  ce sont des acyl-homosérine lactones (acyl-HSLs). Certaines bactéries sont plus élaborées et utilisent plusieurs types de molécules dans leurs communications réciproques. Les voies sont souvent compliquées avec une hiérarchie entre elles.

La fonction exacte (s'il y en a une seule) du quorum sensing reste quand même à établir. On en a des idées anthropomorphiques. L'existence, chez plusieurs microorganismes de plusiurs mécanismes plaide en faveur de rôles multiples. L'un des participants a plaidé pour une multiplicité des fonctions, avec notammment la détection d'une probabilité de conjugaisons heureuses.

Chez Bacillus subtilis le signal est oligopeptidique et les signaux sont ceux échangés lors du déclenchement de la sporulation. La formation de l'endospore est l'aboutissement d'une série de manifestations physiologiques qui sont le produit de systèmes de transduction de signaux où interviennent au moins cinq histidine kinases (KinA, KinB, KinC, KinD et KinE). Un régulateur intermédiaire, Spo0F, une phosphotransférase, Spo0B, et un régulateur global de la réponse, Spo0A, participent à la cascade. Spo0F-phosphate (Spo0F-P) peut être déphosphorylé pat trois phosphatases (RapA, RapB et RapE), et ce sont ces phosphatases qui sont commandées par les deux peptides diffusibles PhrA et PhrE.

 PhrA and PhrE sont des inhibiteurs spécifiques respectifs de RapA et RapE. Les précurseurs sont des peptides de 44 aminoacides exportés via le système de sécrétion général.de la bactérie. Ils sont clivés lors de la sécrétion, et ce sont deux pentapeptides C-terminaux qui sont émis dans le milieu.

Les pentapeptides sont enregistrés et importés par une perméase spécifique. Les pentapeptides Phr se fixent sur et inhibe la phosphatase correspondante. On constate une interaction directe entre RapA et sa cible, Spo0F-P, et ce complexe est dissocié lors de la déphosphorylation ou la fixation du pentapeptide PhrA. Comme on a détecté au moins neuf autres systèmes analogues potentiels dans le génome de B.subtilis, cela ouvre des perspectives de raffinement du circuit.

Le compte-rendu couvre évidemment plusieurs autres cas de communication chez les bactéries pathogènes, dont Agrobacterium, ainsi que le système modèle des Vibrio lumineux avec V. fischeri symbiotiques des calmars et V.harveyi qui ne l'est pas. On commence d'ailleurs à effectuer des analyses génétiques sur les régulations de ce phénomène au delà du gène luxR, mais aussi de la symbiose avec Euprymna scolopes.

Le quorum sensing chez Rhizobium leguminosarum a également été abordée, avec le système CinI/CinR (voir le §34).

La situation particulière des échanges dans les biofilms a été traitée. Le système le plus connu est celui de Pseudomonas aeruginosa. Ce qu'il ya d'intéresssant, c'est que les biofilms ne sont pas forcément monospécifiques, bien au contraire. Ce sont de véritables HLMs avec des escaliers et des ascenseurs pour faire monter les nutriments dans des colonnes aqueues et des vide-ordures pour éliminer les déchets. Le comportement des bactéries est différenciés selon les sites du biofilms, ce qui accentue l'impression d'organisation de la communauté. Les systèmes de quorum sensing sont indispensables à cette organisation. Le signal semble partir du rez de chaussée du biofilm et on peut suivre le cheminement du signal en parallèle avec le flot des nutriments.

Dans des biofilms comprenant Burkholderia cepacia et P.aeruginosa les autoinducteurs de P.aeruginosa induisent des gènes de virulence chez Burkholderia.

Le cas des Streptomyces illustre le rôle des signaux dans la régulation des métabolites secondaires. Des échanges de communications entre cellules sont nécessaires à la production d'antibiotiques. Ces bactéries émettent différentes g-butyrolactones apparentées qui stimulent la production des antibiotiques, entre autres, mais aussi la production des spores. Les g-butyrolactones ressemblent beaucoup aux acyl-homosérine lactones classiques des Gram-. ChezStreptomyces griseus, le facteur A est une 2-iso-capryloyl-3R-hydroxyméthyl-g-butyrolactone. Sa synthèse fait intervenir le gène afsA qui, exprimé chez E.coli, permet sa production dans cette bactérie. Comme dans le cas de la synthase de LuxI, sa synthèse utilise des éléments de celle des acides gras, ici probablement du glycérol.

Le facteur A agit sur la protéine ArpA. Si celle-ci est absente, la production de streptomycine est continue. C'est donc un régulateur négatif de la production des antibiotiques. C'est une protéine cytoplasmique.

On trouve un système homologue chez le Streptomyces modèle, S.coelicolor, avec une g-butyrolactone ressemblant au facteur A qui stimule la production d'antibiotique, mais n'agit pas, dans ce cas, sur la sporulation. Des gènes correspondant à cette régulation ont pu être caractérisés.

Cette signalisation par les g-butyrolactones n'est pas limitée aux Gram+, car on la retrouve chez Xanthomonas campestris, une protéobactérie.

Les dialogues interspécifiques ont été révélés avecV.harveyi qui, bien qu'apparenté à V.fischeri n'est pas symbiotique. V, harveyi utilise, lui, deux inducteurs différents AI-1 qui est une acyl-homosérine lactone typique, tandis que AI-2  est une molécule apparemment destinée aux échanges interspécifiques. Chacun des signaux est reconnu par une kinase particulière, LuxN pour AI-1  et LuxQ pour AI-2. AI-2 est reconnue par une protéase périplasmique qui ressemble aux protéines liant le ribose, AI-2 ressemblant au ribose. On commence d'ailleurs à caractériser les évènements en aval dans la cascade, d'une part, et la synthèse de AI-2 de l'autre, avec le rôle de luxS.

Tout ce que l'on observe indique que AI-2 est commun à de nombreuses bactéries (une quarantaine actuellement possèdent luxS) et qu'il s'agit donc d'un signal compréhensible par toutes. 

Un autre aspect du quorum sensing est le fait qu'un certain nombre de bactéries savent brouiller le signal d'autres bactéries en détruisant leur message. Un Bacillus produit une enzyme, AiiA qui détruit les acyl-homosérine lactones. Elle a été utilisée sur des Erwinia carotovora et l'empêche de sécréter les enzymes hydrolysant les parois de plantes. A mon avis, ceci devrait être recherché chez les Bacillus que l'on utilise comme biopesticides pour protéger les fruits, et notamment les agrumes. P.aeruginosa exprimant AiiA n'est pas capable de former des biofilms. Variovorax paradoxus est plus prosaïque et utilise les acyl-homosérine lactones  comme substrats énergétique et azoté.

94. Yarrowia lipolytica est une levure intelligente, car elle ne sécrète, en carences nutritionnelles diverses (C, N ou S), et seulement en présence de protéines, l'une de deux protéases aux pHopt différents, l'une acide (Axp), l'autre alcaline (Aep), en fonction du pH ambiant.

 La production de la protéase alcaline dépend de l'action de la voie de signalisation constituée par les protéines Rim101p, Rim8p/PalF et Rim21p/YlPalH. Des chercheurs de Grignon ont systématiquement recherché, par mutation insertionnelle, tous les gènes pouvant intervenir dans ces régulations. Quatre des mutations n'affectent que la protéase alcaline, 89 les deux protéases, et dix gènes ont ainsi été identifiés. Dont l'homologue de SIN3 de Saccharomyces cerevisiae. Cinq de ces gènes appartiennent à la voie conservée de Rim qui intervient, comme chez les autres Ascomycètes, dans les régulations dépendant de pHs alcalins. du milieu. Les résultats indiquent, néammoins, que cette voie est, ici, également active aux pHs acides, et nécessaire à l'induction du gène AXP1. Cinq autres gènes régulent l'expression mais ne sont pas impliqués dans le captage du signal pH. CI Gonzalez-Lopez et al.; Genetics 160 (FEB02) 417-427.

95. Le glucose inactive le transporteur de galactose Gal2p et fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) chez Saccharomyces cerevisiae par un mécanisme appelé "catabolite-induced inactivation" qui dégrade les deux protéines. On sait que le glucose provoque l'internalisation de Gal2p et sa destruction dans la vacuole, tandis que la FBPase est expédiée dans le protéasome 26 S. On vient de montrer que ces deux voies apparemment séparées utilisent le même système de détection pour leur déclenchement. J Horak et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (08MAR02) 8248-8254.

Les bactéries lactiques fermentent le glucose, soit de façon homofermentaire (voie d'Embden-Meyerhoff-Parnas) avec deux lactates produits et 2ATPs rechargés pour chaque molécule de glucose, soit hétérofermentaire, avec une molécule de lactate, une d'acétate ou d'éthanol et une de CO2 (ce qui crée des bulles), mais surtout une seule recharge d'ATP.

Dans ce dernier cas, les bactéries hétérofermentaires comme Lactobacillus pentosus, utilisent une autre voie hétérofermentaire, celle de la phosphocétolase, où le glucose 6-phosphate est converti en 6-phosphogluconate, qui est décarboxylé, puis en ribulose 5-phosphate, puis en xylulose 5-phosphate (X5P) qui est clivé, étape clé réalisée par la xylulose 5-phosphate phosphocétolase (PKP), en acétylphosphate et en 3-phosphoglycéraldéhyde qui va suivre la voie normale vers le pyruvate puis lactate en rechargeant le seul ATP.

La première partie de cette voie est donc commune avec celle des pentoses phosphates, dont elle est une variante. La partie propre est celle assurée par la PKP. Cette voie est donc utilisable pour le catabolisme des pentoses comme le xylose via le X5P. C'est ce qui fait l'intérêt de cette voie. On vient de cloner le gène XpkA codant la PKP (CC Posthuma et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (FEB02) 831-837).

La PKP, d'abord découverte chez ces bactéries lactiques hétérofermentaires, existe en réalité dans plusieurs autres bactéries (Acetobacter xylinum, Butyrivibrio fibrisolvens, Fibrobacter succinogenes et F.intestinalis) et même chez la levure.

Le xylose entre dans la cellule de L.pentosus via le système de phosphotransférase (PTS) du mannose. Le X5P est produit grâce à l'action de deux gènes d'une xylose isomérase et d'une xylulose kinase, qui sont induits par le xylose et réprimés par le glucose via la voie générale utilisant la protéine CcpA (carbon catabolite protein A).

La protéine ressemble beaucoup à celle de Bifidobacterium lactis dont le gène a récemment été cloné. Cette bactérie en possède deux, l'une spécifique du fructose 6-phosphate (F6P) et l'autre bispécifique pour F6P et X5P. C'est cette dernière dont le gène a été cloné.

97. M Thiry et al. (d'Eurogentec); Trends in Biotechnology 20 (MAR02) 103-105, ont écrit une revue sur l'optimisation du "scale-up" (quelqu'un peut-il me donner l'équivalent en français ?) des fermentations. Plus on augmente le volume du fermenteur, plus son contenu devient hétérogène.

Les effets d'échelle affectent évidemment les transferts de chaleur (donc la cinétique des réactions et la stérilisation) et de substances (les régulations par le substrat et le produit) ainsi que le pH. Des dispositif d'agitation bien conçus peuvent aider mais agiter trop fort ne plait pas toujours à l'organisme utilisé et il faut passer par des injections contrôlées des produits (comme l'oxygène par exemple). .

Lees auteurs insistent sur un autre point : la stabilité des souches utilisées. Plusieurs paramètres affectent la stabilité des plasmides. La taille de l'insert est souvent un facteur important, plus l'insert est grand, moins le plasmide porteur est stable. La perte des plasmides est importante lors de la phase post-exponentielle de la culture, et curieusement cette instabilité augmente lors de la période d'expression.

On peut augmenter cette stabilité en utilisant une sélection par un antibiotique, mais ceci est en régression du fait des réglementations.

On utilise plutôt la correction d'une auxotrophie de l'hôte (incapacité à synthétiser un produit essentiel pour la cellule) par le plasmide, les cellules ayant perdu leur plasmide disparaissent, bouches inutiles, du fermenteur. Mais la préparation des milieux pour auxotrophes n'est pas une mince affaire, car imposant une stricte sélection des milieux utilisés.

L'utilisation des systèmes à toxine–immunité associées qui tuent les bactéries dépourvues d'un plasmide protecteur (locus parB (hok/sok)  est une autre possibilité.

Mais le moyen le plus simple est d'intégrer la cassette d'expression dans le chromosome de l'hôte. C'est ce qui est fait le plus généralement chez un hôte comme la levure Pichia pastoris. Malheureusement on perd  sur le plan du niveau d'expression.

Ces problèmes réglés il faut optimiser le protocole de fermentation. En effet, tous les organismes ont plusieurs débouchés pour un substrat donné, dont un principal, celui qui intéresse l'utilisateur, plus plusieurs produits secondaires, dont il n'a que faire et qui vont compliquer les traitements ultérieurs (downstream processing). Lors de la production d'une protéine cela peut affecter la forme soluble ou non du produit, ce qui a des conséquences considérables pour la purification. Ainsi une surexpression mal maitrisée peut, en effet, conduire à une déplétion de facteurs affectant la conformation.

Les fermentations peuvent être conduites sous trois formes (avec des variantes) : en continu, en batch, ou en fedbatch.

Les fermentations en continu ne sont pas très pratiquées, car les problèmes de stabilité génétique sont exacerbés et, surtout, les contaminations. C'est donc peu recommandé dans l'industrie pharmaceutique et des essais de fermentation de brasserie ont été abandonnés. La fermentation en batch est réalisée dans un bioréacteur où on laisse l'organisme se débrouiller avec le substrat qu'on lui a confié. Les paramètres sont alors évolutifs, mais des capteurs permettent de maîtriser un certain nombre de paramètres physiques. C'est un moyen rustique (et souvent éprouvé) de procéder. Le fed-batch est un compromis où on travaille dans un bioréacteur en corrigeant la composition du milieu en retirant le produit pendant qu'on injecte du substrat, par exemple. C'est le seul moyen d'obtenir une forte densité cellulaire. Son intérêt est de mieux maîtriser le métabolisme de l'organisme utilisé.

Dans le cas de Saccharomyces cerevisiae, si on donne trop de glucose on voit apparaître l'effet Crabtree : même en forte oxygénation la levure devient paresseuse et utilise le glucose de façon fermentaire (c'est à dire peu économe) même en présence d'oxygène abondant. Cela va si on veut de l'éthanol, mais pas pour d'autres productions. Si on veut  rester en métabolisme respiratoire (plus rentable vis à vis du substrat) il faut travailler dans des conditions limites pour le glucose (quasiment indétectable, aussitôt injecté, aussitôt consommé). C'est également ce que l'on fait pour éviter la production d'acétate par E.coli  qui réduit la production de biomasse et les niveaux d'expression. Pour les levures méthylotrophes, un métabolisme respiratoire est indispensable car le susbtrat méthanol est toxique et il faut absolument le consommer rapidement.

Compte tenu des préférences d'une souche donnée, le choix de la source de carbone est essentielle, le compromis étant celui entre l'économie (prix du susbtrat) et les facéties métaboliques de l'organisme producteur. Ainsi, et du fait de la sensibilité d'E.coli à la concentration en glucose, le glycérol est un meilleur substrat. Mais il doit, cependant, être évité dans certains cas, car il perturbe certaines régulations. C'est le cas pour Pichia pastoris dont il inhibe (entre autres) le promoteur de l'alcool oxydase.

98. On utilise l'acide citrique dans de très nombreux produits alimentaires, notamment dans les produits marins, comme les crustacés en boite ou congelés, qui sont trempés dans des solutions doliuées qui chélatent les ions métalliques et inhibent les enzymes, évitant ainsi le brunissement et le développement de mauvaises odeurs.

Dans les produits lipidiques on en ajoute 0,005-0,02% pour chélater les ions pouvant intervenir dans les oxydations.

La première production industrielle d'acide citrique par Aspergillus niger  a été réalisée dès 1923 par la firme Pfizer. Le procédé initial utilisait la fermentation en surface du mycelium sur des claies métalliques. Actuellement, on n'utilise pratiquement plus que des cultures en supension, avec des mélasses comme substrat. Plus récemment on s'est orienté vers l'utilisation des sirops de glucose du maïs, qui est pratiquée par les grands de la transformation de l'amidon.

Le champignon utilise le glucose selon la voie de la glycolyse classique (voie d'Embden Meyerhoff Parnas) et l'entrée dans le cycle tricarboxylique de Krebs est, en principe, à l'origine de la production de l'acide citrique : le pyruvate donne de l'acéto-coenzyme A (après décarboxylation) et l'acéto-CoA se condense avec l'oxaloacétate pour donner l'acide citrique.

La production d'acide citrique par Aspergillus niger est assez fantasque, car les conditions physiologiques du mycelium, comme la composition fine du milieu ont une importance considérable. La présence de traces de divers métaux  doit être soigneusement maîtrisée. On a ainsi montré que la présence d'ions fer au-delà de traces entraine une diminution de la production. Le manganèse, le molybdène, le zinc, le cuivre doivent également être soigneusement maîtrisés. C'est cette manipulation, sous différentes formes, des concentrations d'ions métalliques qui est à la base des divers brevets pris avant et après la deuxième guerre mondiale. Une anecdote rapporte qu'une firme autrichienne se contentait de laisser corroder ses fermenteurs (ce qui est fréquent pour cette production très agressive) pour ajuster le niveau de fer. Ce rôle du fer se comprend mieux si on sait que l'aconitate hydratase qui transforme l'acide citrique en cisaconitate), a besoin de fer pour fonctionner.

L'effet du glucose sur le métabolisme d'Aspergillus niger, lors de la production d'acide citrique, vient d'être étudié par des chercheurs viennois. On avait déjà beaucoup de données, mais elles sont parfois contradictoires.

Les auteurs montrent qu'en fortes concentrations de glucose (14%, w/v), le carbone marqué se retrouve aux emplacements C-2/C-4, ce qui est attendu à la suite d'une intervention de la pyruvate carboxylase. On le trouve également en C-1/C-5, ce qui est plus difficile à expliquer, probablement à la suite d'un recyclage du glycérol et de l'érythritol.

Au début de la fermentation, le champignon produit également des quantités appréciables de tréhalose et du mannitol, et une anaplérose de l'oxaloacétate vers pyruvate puis cette production disparaît. Aux faibles concentrations de glucose (2%) on a une réduction sensible de la production d'acide citrique et c'est surtout en marquage en C-1/C-5 qui est observé, et la formation anaplérotique de pyruvate est fortement augmentée. La régulation est assurée au niveau du fructose-6-phosphate. En fortes concentrations de glucose, la régulation bascule au niveau de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase.

99. Des chercheurs chinois décrivent la production d'acide linolénique par Mortierella isabellina sur octodécanol 2%. M Xiang et al.; Current Microbiology 44 (FEB02) 141-144. Ce champignon peut accumuler jusqu'à 50% de lipides par rapport à son poids sec. Mais il faut lui fournir pas mal d'extrait de levure.

100. Pseudomonas corrugata est capable de produire des polyhydroxyalcanoates (PHA). À chaînes acyles de longueurs moyennes. Une production sur glucose ou acide oléique est connue. On vient de décrire une production sur des graisses animales solides fluidisées à 37° dans DKY Solaiman et al.; Current Microbiology 44, n°4 (2002) 189-195. La taille et la polydispersité des polymères est plus grande qu'avec les autres Pseudomonas. Sa transformation avec un gène de lipase permet une production sur triacylglycérols sans avoir à les hydrolyser. Les auteurs ont alors utilisé des graisses animales comme le lard et le suif dont on ne sait quoi faire et cela marche correctement, même à 37° (ce qui n'est pas le cas pour les autres Pseudomonas).

Les Protéines et les Enzymes

101. Une revue sur les a-amylases par les chercheurs de Groningen et du TNO est parue avec MJEC van der Maarel et al.; Journal of Biotechnology  94 (28MAR02) 137–155.Ces enzymes partagent une structure commune, et la formation ou l'hydrolyse de liaisons glycosidiques en a (ce n'est pas de là que vient leur nom, mais du fait que ce sont des endoamylases par opposition aux b-amylases qui les égrènent par leur extrémité, ou exoamylases). Elles partagent également les acides aminés du site actif. Elles sont capables d'au moins 21 réactions différentes et leurs spécificités sont variables.

Le domaine le plus conservé chez ces amylases est le domaine dit A avec un barillet de 8 feuillets b entouré de huit hélices a (structure (b/a)8 ou TIM barrel pour Triose phosphate IsoMérase, la première structure décrite). Le domaine catalytique ainsi que ceux de fixation du substrat sont localisés dans des boucles de la partie C-terminale des feuillets ß de ce domaine.

Le domaine B de 44 à 133 aminoacides se projette entre le feuillet b et l'a-hélice n°3, et joue un rôle dans la reconnaissance du substrat et la fixation du Ca++.

On trouve, entre les domaines A et B, neuf autres domaines. Une seconde protrusion du domaine A (domaines 2 et 7) est présente chez les enzymes qui hydrolysent des liaisons a1-6 interne (pullulanases).

Les autres domaines situé en avant ou en arrière du domaine A sont les domaines C à I. La fonction du domaine C est inconnue, mais paraît nécessaire à l'activité catalytique.

Le domaine C des cyclodextrines glycosyltransférase contient un domaine liant le maltose qui leur permet d'attaquer l'amidon brut. Chez ces dernières, comme chez les amylases maltogéniques (qui donnent du maltose), le domaine C est suivi par le domaine D dont la fonction est inconnue. Le domaine E est également responsable, chez certaines des enzymes, de la fixation de l'amidon brut. Un tableau résume la structure de toutes les principales enzymes de ce point de vue.

L'utilisation des amylases est traitée. Le glucose peut être obtenu par hydrolyse acide d'amidons comme l'avait montré, dès 1811 le chimiste russe Kirchoff et le genevois de Saussure. De tels sirops contenant 42% de glucose (plus exactement contenant 42% en équivalent réducteur du glucose) ont été produits selon ce procédé jusqu'en 1950. Un brevet déposé en 1940 a démontré que l'on pouvait l'obtenir dans des conditions encore meilleures par hydrolyse enzymatique. En effet on évitait, ainsi, la production, entre autres, des sous produits amers. En 1950 on a vu se généraliser le jet cooking (mise en solution par injection de vapeur à 100-175° pendant quelques secondes). L'hydrolyse acide a été progressivement abandonnée, les enzymes ayant été commercialement introduites. L'introduction parallèle du jet cooking a entraîné l'utilisation d'enzymes thermophiles. Les enzymes peuvent, alors, être injectées dès le départ, du fait du court temps de chauffage, et on peut maintenir ensuite la température à 95-105° pendant 90 minutes pour obtenir un hydrolysat d'amidon. Ce sont les a-amylases d'abord de Bacillus amyloliquefaciens (maintenant abandonnée), puis de Bacillus stearothermophilus ou Bacillus licheniformis qui ont été commercialisées.

B.licheniformis, en effet, peut produire une a-amylase résistante à des températures supérieures à 100°. Il existe des a-amylases alcalines provenant de Bacillus alcalophiles,  mais elles ne sont pas thermostables. Des amylases fonctionnant entre 90° et 145° ont été isolées d'archées hyperthermophiles (dont l'optimum de température se situe vers 100°) comme Pyrococcus furiosus qui sécrète une a-amylase prometteuse, car active jusqu'à 130° en l'absence d'ions métalliques (mais c'est quand même un problème).

Les premières productions significatives de glucose cristallin (à 95%) ont eu lieu en 1960. Les défauts des enzymes actuellement utilisées est leur absence d'activité au-dessous de pH 5,9 aux températures élevées, or le pH naturel de l'amidon gélatinisé est de 4,5. Il faut donc une opération que l'on souhaiterait supprimer, le réglage du pH. Il faut également veiller à la présence de Ca++.

La saccharification, c'est-à-dire l'hydrolyse jusqu'au glucose (en général à 95%) à partir de l'extrémité non réductrice des oligosaccharides est l'affaire des glucoamylases. Ce sont surtout celles d'Aspergillus niger ou d'espèces voisines qui sont utilisées. Cette glucoamylase a un pHopt de 4,2 et résiste à 60°, ce qui impose de refroidir les substrats sortant de l'hydrolyse précédente. Cela coûte de l'argent pour deux raisons : c'est une manipulation de plus et la réaction n'ayant lieu qu'à 60–62 °C, elle dure 12 à 96 h, ce qui représente du temps d'immobilisation d'installations très coûteuses. Enfin il reste à cliver les liaisons a1-6 des maltodextrines. C'est le rôle des pullulanases, mais il vaudrait mieux que ces enzymes acceptassent de fonctionner au même pH et températures que l'opération précédente. Autre difficulté: les raisons économiques poussent à travailler avec un substrat aussi concentré que possible pour limiter la taille des installations, et donc leur coût. Or, dans ces conditions, la glucoamylase se met à faire ce que l'on ne souhaite pas, remonter du maltose et de l'isomaltose à partir du glucose. On joue alors en équilibrant la quantité d'enzyme, la température et le temps de traitement.

102. Les protéines sont normalement linéaires, mais il existe des formes cyclisées après traduction par formation d'une liaison peptidique entre les deux extrémités C et N terminales. Ceci leur confère une thermostabilité exceptionnelle. Ceci serait intéressant pour des enzymes industrielles. On peut réaliser cette opération en utilisant des intéines. Ce sont des domaines protéiques qui subissent un épissage au sein d'une protéine naissante. Il se forme une nouvelle liaison peptidique joignant ce que l'on appelle les extéines (par extension à partir de l'épissage des prémessagers). Les intéines peuvent être clivées en intéine côté N (intN) et intéine côté C (IntC) qui redeviennent actives quand on les ressoude. Dans ces conditions on peut faire cycliser en trans (à partir de deux fragments protéiques séparés) au lieu du processus normal (sur la molécule elle-même, c'est-à-dire en cis). Si on construit un montage IntC-extéine-IntN avec une intéine permutée circulairement, on peut obtenir une cyclisation in vivo chez E.coli.

Il reste cependant à bien choisir les intéines pour une protéine donnée. Parmi les intéines, qui ont été utilisées avec succès, il y a celle de DnaE d'un Synechocystis. On a également utilisé une intéine de Pyrococcus furiosus. Mais dans tous les cas on a beaucoup de sous-produits, intermédiaires de cyclisation.

On vient de monter une mini-intéine synthétique de DnaB du même Synechocystis pour mieux l'adapter aux usages d'E.coli. L'opération est résumée par des schémas clairs. NK Williams et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (08MAR02) 7790–7798.

L'Agroalimentaire

103. Une revue intéressante de chercheurs néo-zélandais fait le point sur ce qui a pu être publié sur l'analyse comparative des aliments conventionnels par rapport à ceux d'origine "biologique" D Bourn et al.; Critical Reviews in Food Sciences & Nutrition 42 (JAN02) 1-34. Les auteurs se sont intéressés à la valeur nutritionnelle, aux qualités organoleptiques et à la sécurité des aliments. Ils en concluent que des études sérieuses sont indispensables, car les données actuellement recueillies ne sont pas assez solides pour se faire une opinion rationnelle. Mise à part la présence de nitrates, il n'y a aucune étude sérieuse démontrant une différence de composition entre ces deux types d'aliments. Il n'y a que très peu de choses sur la biodisponibilité des composants nutritionnels ou pas entre les deux. La qualité organoleptique des produits est particulièrement mal traitée dans littérature et une dimension est omise, celle de la technique de récolte et de la voie de commercialisation. Un produit frais est généralement meilleur qu'un produit un peu décati. Or, actuellement, la production "biologique" bénéficie le plus souvent de circuits courts mais, avec son extension, elle risque de perdre cet avantage. Par contre, il ne semble pas que les produits "biologiques " soient plus sensibles aux contaminations microbiennes. Très peu d'études ont été consacrées à la teneur en pesticides des aliments "biologiques" et une étude précise des niveaux de contamination, pourtant réglementés, manque.

102. Les chercheurs d'Unilever et de ProteoSys à Mainz ont produit de l'amidon de pomme de terre résistant aux congélations/décongélations. Ils ont inhibé, par antisens, trois gènes d'amidon-synthases. SA Jobling et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 295-299.

L'innovation est intéressante car l'amidon non modifié résiste très mal à ce traitement. On a une modification de la texture. La congélation entraîne une syneresis (séparation de l'eau et du gel) due à la réassociation des chaînes glucanes, un peu comme dans le rassissement du pain. Industriellement on limite ce défaut par des transformations chimiques qu'on peut ne pas souhaiter.

Les auteurs ont éliminé l'amylose (c'est donc un amidon de type waxy) et réduit la longueur des ramifications  de l'amylopectine.

On avait déjà construit des pommes de terre waxy en inhibant la GBSS (Granule-Bound Starch Synthase). La réduction des ramifications nécessite l'inhibition des deux isoformes SBE-A (Starch Branching Enzyme) et SBE-B des tubercules.

103. La bière ne supporte pas bien, à la lumière, la présence de riboflavine provenant du malt,  la levure ou le houblon n'étant que des contributeurs très minoritaires. Elle cause des flaveurs indésirables. C'est pourquoi les bouteilles sont toujours sombres. Des chercheurs hollandais ont mis au point une méthode de détection ne nécessitant pas de traitements spéciaux et basées sur la protéine liant l'aporiboflavine du blanc d'œuf. Son seuil de détection est de 10nM de riboflavine. Ils suggèrent, parallèlement d'utiliser cette protéine pour éliminer cette vitamine. MG Duyvis et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 50 (13MAR02) 1548-1552.

104. Beaucoup de phages tempérés maintiennent leur prophage (intégré au génome de la bactérie hôte) par des systèmes ressemblant au répresseur CI du bactériophage l. D'autres provoquent l'exclusion de bactériophages par un système différent, car il ne participe pas au maintien de l'état lysogène, et ne sont pas spécifiques des seuls phages apparentés. L'exclusion des superinfections empêche un phage d'entrer dans la cellule en bloquant l'entrée de l'ADN des intrus. Quant aux infections abortives, elles consistent à tuer prématurément la cellule, avant que le phage se soit répliqué, il n'y a donc pas amplification de la population de phages.

Le gène sie2009 localisé entre ceux de l'intégrase et celui du répresseur dans le module de lysogénie du phage tempéré de Lactococcus Tuc2009, induit une résistance de Lactococcus lactis à plusieurs phages.  La protéine qu'il code est associée à la membrane et son expression permet l'adsorption du phage, la transfection et la transformation par plasmides, mais elle interfère avec une transduction plasmidique et la réplication des phages. Cette résistance bloque l'injection de l'ADN. On retrouve des résistances de ce type chez d'autres prophages des Lactococcus. S McGrath et al.; Molecular Microbiology 43, n°2 (JAN02) 509-520.

105. L'utilisation de la cyclodextrine glucanotransférase de Bacillus stearothermophilus ET1  pour limiter le rassissement du pain à partir du maltose formé lors de la panification a déjà été proposée, plutôt d'ailleurs sous la forme d'une utilisation directe des cyclodextrines (mais leur coût empêche la généralisation du procédé).Il faut pour cela réduire l'activité cyclisante. La réduction de la cyclisation a été obtenue par deux substitutions Phe191Gly ou Phe255Ileu respectivement, qui réduisent la thermostabilité de l'enzyme, mais augmente l'activité de la première des deux enzymes, ce qui fait qu les enzymes son inactivées avec les autres enzymes de la pâte entre 55 et 70° pendant la montée en température dans le four. L'effet sur la durée de vie du pain est sensible. SH Lee et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 50 (13MAR02) 1411-1415.

106. Deux souches antioxydatives de Lactobacillus fermentum, E-3 et E-18, ont été isolées par des chercheurs estoniens de l'intestin d'un enfant en bonne santé. Ces bactéries résistent bien aux stress oxydatifs de toutes sortes. Ces souches présentent un taux particulièrement élevé de glutathione, et de superoxyde dismutase à manganèse qui militent la peroxydation des lipides et permettant un dégagement de peroxyde d'hydrogène auquel elles résistent bien. T Kullisaar  et al.; International Journal of Food Microbiology 72 (05FEB02) 215-224. On pourrait les utiliser comme producteurs de ce peroxyde désinfectant.

Les Pré- et Probiotiques

107. Des chercheurs de Kyodo Milk Industry ont étudié l'adhésion de nombreuses bactéries sur les mucines intestinales (Bifidobacterium longum, B.breve, B. bifidum, B. adolescentis, B.infantis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides distasonis, Eubacterium aerofaciens, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, etc…). Bifidobacterium lactis LKM512 est celui qui présente l'adhésion la plus forte. L'adhésion de B.lactis LKM512 exclue celle de C.perfringens. C'est donc un probiotique potentiel. Les très jeunes enfants présentent une adhésion différente de celle des jeunes et des adultes. M Matsumoto et al.; Current Microbiology 44, n°4 (2002) 212-215.

108. La souche YIT9029 de Lactobacillus casei Shirota a été découverte en 1930 dans l'intestin d'un enfant par la firme japonaise Yakult qui l'exploite depuis longtemps, en particulier pour minimiser les effets des diarrhées à rotavirus chez les enfants. On a, cependant, mais on a mis en doute ses effets sur l'appareil immunitaire. Elle semble coloniser facilement l'intestin et on vient de montrer que sa présence dans l'intestin limite les infections par Listeria monocytogenes dans l'estomac, l'appendice, la rate et le foie. Elle n'a aucun effet dans les ganglions lymphatiques. Il semble, d'après une nouvelle étude de chercheurs d'Utrecht (de Waard et al.; International Journal of Food Microbiology 73 (25FEB02) 93-100) qu'un certain effet sur le système immunitaire est détectable par une hypersensibilité retardée à L.cytogenes. Il s'agirait d'une immunité cellulaire.

109. Une revue sur les fibres alimentaires à base d'inuline, et plus généralement de fructose, issues de la racine de chicorée est parue avec G Flamm et al.; Critical Reviews in Food Sciences & Nutrition 41 (JUL01) 353-362.

Inuline et oligofructoses ne sont pas digérés dans la partie supérieure du tube digestif et ils sont métabolisés par la flore du colon pour donner des acides gras de faible longueur et permettent la croissance des bifidobactéries. Ils ont donc un effet fibre.

110. Les enveloppes du grain d'avoine contiennent pas mal d'acide férulique, et cela gêne leur digestion par les ruminants. L'utilisation d'estérases féruliques d'Aspergillus, associée à une xylanase de Trichoderma (qui dégage la lignine) permet de les rendre plus digestibles. P Yu et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 50 (13MAR02) 1625-1630.

111. Le sarrasin est originaire de l'Asie du Nord et de l'Est, où il est cultivé en Chine depuis 1000 ans av.JC. Il est maintenant répandu dans toutes les régions tempérées du fait de sa très grande adaptabilité aux mauvaises conditions de culture et de sa durée de culture très courte.

C'est essentiellement Fagopyrum esculentum qui est cultivé, mais on trouve également Fagopyrum tartaricum dans les régions montagneuses. Ils contiennent pas mal de substances de type nutraceutiques. Des chercheurs canadiens ont compilé les données abondantes sur la production existante ou potentielle d'aliments fonctionnels à base de sarrasin. SQ Li et al.; Critical Reviews in Food Sciences & Nutrition 41 (SEP01) 451-464.

La sécurité alimentaire

112. Comme me le disait, il y a un certain temps, une collègue microbiologiste étrangère, la viande à surface visqueuse et verte que l'on considère comme "pourrie" n'est pas forcément contaminée par des pathogènes, mais protégée contre eux, car ce sont très souvent des bactéries lactiques qui en sont la cause. Un article traite de ce sujet : CK Yoste et al.; International Journal of Food Microbiology 72 (30JAN02) 97-105. Ces chercheurs d'Agri-Food Canada, étudiant des viandes de bœufs empaquetées sous vide, ont analysé le développement de la flore pendant six semaines. La population gagne 4 log pendant ces six semaines, mais si on détecte, au début, des Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei et Leuconostoc, au bout de six semaines on ne trouve plus que Leuconostoc gelidum qui élimine non seulement ses collègues lactiques, mais également Escherichia coli O157:H7 et Listeria monocytogenes. J'ai vérifié la non-toxicité, mais je ne suis pas sujet aux allergies.

113. Etudiant les blés et farines du sud-ouest de l'Allemagne, des chercheurs de Hohenheim ont recherché les toxines de Fusarium présentes durant la première moitié de 1999. Ils en ont trouvé pas mal, avec essentiellement du désoxyvalénol. On ne trouve, cependant pas de fusarénone X, ni de zéaralénols. Comme on en trouve moins dans les farines à faible teneur en cendres (type 45), elles doivent provenir des enveloppes du grain. On en trouve significativement plus dans les blés conventionnels que dans les blés "biologiques". M Schollenberger et al.; International Journal of Food Microbiology 72 (30JAN02) 85-89.

114. Des chercheurs finlandais ont recherché la présence de spores de Clostridium botulinum types A (neurotoxique) et B (protéolytique) qui sont les souches dont la toxine est active chez l'homme. La bactérie est présente partout dans le sol. Le miel a un effet antibiotique sur beaucoup de bactéries et les spores des Cl.botulinum ne peuvent y germer (il faut, cependant, se méfier chez les enfants, car ils permettent une croissance bactérienne dans leur intestin et une infection génératrice de toxines, alors que les adultes deviennent réfractaires et ne sont sensibles qu'à la toxine antérieurement produite dans les conserves). Les spores ont été détectées dans 7% des miels finlandais et 16% des miels importés. Ce n'est pas négligeable, d'autant qu'on repère parfois les deux souches simultanément. M Nevas et al.; International Journal of Food Microbiology 72 (30JAN02) 45-52.

115. Des chercheurs de Grenoble ont analysé les raisins et le moût de vin d'une région à production de vins rouges, pour y détecter la présence d'ochratoxine A. En effet ces chercheurs ont remarqué une présence anormale de cette mycotoxine dans les échantillons de sang de la région. Ils ont également recherché les principaux producteurs (Penicillium chrysogenum et Aspergillus carbonarius), et ont observé une très bonne concordance entre leur présence et celle de la toxine sur le raisin et dans le moût. Toutes les souches isolées d'A.carbonarius étaient productrices de l'ochratoxine A en culture. L Sage et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 50 (27FEB02) 1306-1311.

116. L'hydridation interspécifique de la pomme de terre cultivée "Désirée" et de S. commersonii une espèce sauvage, entraîne une accumulation de glycoalcaloïdes qu'il faut absolument éliminer. Heureusement ce caractère est très variable, et on peut donc rapidement sélectionner des espèces n'en contenant pas plus que l'espèce cultivée. La comparaison de pommes de terre transgéniques de la variété "Désirée" exprimant l'endochitinase ech42 et celle d'origine montre que les voies métaboliques sont indistinguables, et donc que le profil des alcaloïdes est strictement le même. F Esposito et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 50 (13MAR02) 1553-1561.

117. L'allergène majeur du tubercule de la pomme de terre (il y aurait donc eu de multiples raisons d'embastiller Parmentier) est la patatine qui est une protéine très abondante. Son caractère allergène (stimulation des IgE) disparaît, heureusement avec la cuisson.

Cette neutralisation de l'effet allergène de la patatine vient d'être analysé par des chercheurs du TNO hollandais ; SJ Koppelman et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 50 (13MAR02) 1562-1568. La chaleur provoque une agrégation de la patatine avec d'autres protéines de la pomme de terre, qui déprime l'affinité pour les IgE, plutôt que par sa dénaturation à l'état isolé.

L'Environnement

118. Les Myxobactéries sont des d-protéobactéries classiquement considérées comme des aérobies strictes alors que, phylogénétiquement, elles devraient être anaérobies, mais dépendant de respirations diverses. Plusieurs souches de Myxobactéries capables de respirer grâce à un accepteur d'électrons comme le 2-chlorophénol (2-CPh) viennent d'être caractérisées. RA Sanford et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (FEB02) 893-900. La bactérie pousse également sur 2,6-dichlorophénol, 2,5-dichlorophénol, 2-bromophénol, nitrate, fumarate et, classiquement, sur oxygène comme accepteurs terminaux d'électrons. Elle préfère même le 2-CPh au nitrate. Elle oxyde acétate, H2, succinate, pyruvate, formate et lactate pour se procurer de l'énergie. Elle est voisine des Myxococcus et a été dénommée Anaeromyxobacter dehalogenans.

La sécurité génétique

119. Un article de chercheurs du Scottish Crop Research Institute à Invergowrie montre que la fragmentation des forêts tropicales n'est peut-être pas aussi destructrice qu'on ne le pensait, au moins pour les angiospermes. On avait déjà quelques études qui montrait que les flux de pollens peuvent porter sur des distances relativement considérables, et que des arbres ou des bosquets isolés peuvent communiquer génétiquement avec d'autres. En suivant les génotypes moléculaires (microsatellites) de Swietenia humilis (un arbre voisin du Mahogany, une Méliacée néotropicale), chez qui on avait affirmé que la fragmentation de l'habitat avait un effet destructeur, les auteurs ont repéré une dispersion du pollen sur des distances 10 fois supérieures à celles qui ont été utilisées dans les modèles. Ils estiment que de considérer les arbres isolés comme des morts-vivants est une idée reçue plus qu'une réalité dans beaucoup de cas . GM White et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2038-2042. On peut, cependant, lire à propos du Mahogany lui-même, Swietenia macrophylla, une étude du même type avec AC Gillies et al.; Heredity 83 (DEC99) 722-732, avec des conclusions sur l'effet de la collecte des individus sur la variabilité génétique dans toute l'Amérique centrale où elle diminue. L'étude avait été réalisée avec des RAPD.

120. Le roseau Phragmites australis,a subi une expansion considérable au cours des 150 dernières années aux Etats-Unis. Celle-ci est, en réalité liée à l'invasion génétique par une espèce cryptique exotique. K Saltonstall ; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2445-2449.L'auteur de Yale a uanalysé les marqueurs chloroplastiques pour en arriver à cette conclusion.

Le génotype originel, décrit comme rare au début du 19° siècle, a complètement disparu en Nouvelle Angleterre et doit être en train de le faire dans le reste du Continent. On avait accusé l'homme d'être responsable de l'expansion par ses activités industrielles. C'est vrai mais pas pour cette raison. C'est son goût de la collection qui en est la cause.

Il faut souligner que 50 000 espèces exotiques (dont 5000 plantes) qui se sont échappées dans la nature (naturalisées), ont été introduites aux Etats-Unis, sans compter celles, cryptiques, qu'on ne reconnaît pas au premier coup d'œil.

121. Ne voilà-t-il pas que les données sur la diffusion incontrôlée des constructions des maïs transgéniques au sein des populations naturelles de maïs dans l'état d'Oaxaca au Mexique est mise en doute!!! Il s'agit, pourtant d'une question importante car le maïs est originaire de la région.

L'alerte avait été donnée par la découverte du promoteur 35S dans de très nombreuses accessions de maïs autochtones dans l'Oaxaca par des chercheurs de Berkeley et avait donné lieu à beaucoup de bruit médiatique. L'International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT) a précipitamment analysé les collections récentes de ses maïs, particulièrement dans la région indiquée, et n'a trouvé aucun cas de contamination (http://www.cimmyt.org/ whatiscimmyt/init-test.htm). Par contre des biologistes de laboratoires gouvernementaux mexicains confirment certaines des découvertes du groupe de Berkeley. La publication de Novembre dans Nature indiquait également avoir trouvé des constructions transgéniques dans les régions montagneuses isolées du pays. Il est vraisemblable que de telles introgressions existent ou vont avoir lieu.

Les maïs autochtones, dits maïs créoles évoluent sans arrêt du fait de la fécondation croisée de cette plante et de la sélection par les planteurs locaux. Les fermiers utilisent ces croisements pour maintenir la vigueur hybride.

Tout le problème est de savoir ce que cela change quand c'est un transgène. D'une chose l'une, ou il apporte un plus et le fermier le répandra, ou il n'apporte rien ou est nuisible, et le fermier l'éliminera, comme il l'a toujours fait. Les chercheurs de Berkeley à l'origine de cette tourmente développe bien cette constatation et affirme que si le gène est bénéfique les variétés locales vont être complètement submergée par lui. Or c'est ce qui peut arriver pour tous les autres gènes sélectionnés, et c'est la culture et la sélection qui sont en cause, pas le transgène par lui-même (ou bien c'est avouer que le transgène est bigrement utile aux paysans), cause à la quelle il faut ajouter la conquête du paysage par les champs cultivés. Pour l'instant on n'a aucune indication d'une perte de la variabilité depuis la culture du maïs.   J Hodgson;  Nature Biotechnology 20 (JAN02) 3-4 et Nature Biotechnology 20 (FEB02) 106-107.

Les recommandations aux autorités mexicaines sont de faire procéder à cette analyse par plusieurs équipes indépendantes et de confronter les résultats. Une cause possible d'erreurs réside, en effet, dans la technique, celle de la "PCR", utilisée par le groupe qui, malgré ce que l'on peut penser, présenter parfois des faux positifs qu'il aurait fallu vérifier. Les auteurs de la publication contestée n'ont pas répondu aux demandes du CIMMYT de communication de leur matériel. Des étudiants de Berkeley ont maintenant entre les mains les résultats et sont chargés de les analyser et d'essayer de reproduire ceux-ci à des fins de vérification des techniques.

 La technique préconisée de chauffer le maïs en grains destiné à la consommation pour empêcher sa germination n'est pas efficace, car 80 à 90% des grains ainsi traités germent encore.

Il semble que le gouvernement mexicain attende des données solides pour statuer.

La Vie des Sociétés

122. On trouvera dans A Bouchie; Nature Biotechnology 20 (JAN02) une analyse du marché des microréseaux et des firmes qui s'y consacrent. Si Affymetrix détient une position forte (80%) sur le marché des microréseaux à haute densité (400 000 spots sur 1,64 cm2, mais 40 millions sont possibles), celui des densités plus faibles, utiles pour des analyses ciblées, est plus largement distribué (environ 25 firmes). Après la première vague d'exploration de génomes entiers on se dirige vers le repérage de gènes connus comme intervenant dans un mécanisme (pathologique ou pas) et à examiner le plus possible de génomes individuels pour ces seuls gènes.

Le succès d'Affymetrix est lié à son utilisation exclusive de la photolithographie sur plaques de verre. Elle est la seule firme à pouvoir déposer la totalité du génome humain sur une seule plaque. Hyseq est la seule firme pouvant utiliser une partie du savoir faire d'Affymetrix via N-Mer, une joint-venture formée à la suite d'un règlement à l'amiable d'un différent entre les deux firmes sur la propriété industrielle (voir le Bulletin de Novembre 2001 §123). Cette filiale commune construit des plaques pour séquençage.

Les techniques d'Agilent et de Motorola, utilisant des dépôts de micro-gouttes limitent la densité. La densité obtenue par Agilent devrait permettre des plaques avec 100 000 spots sur les mêmes 1,64 cm2, mais actuellement la firme ne commercialise que des plaques avec 27 000 spots sur 19,35 cm2.

Incyte Genomics après avoir eu des différents avec Affymetrix, a abandonné ses microréseaux exploitant ses bibliothèques de cDNA (voir les Bulletins de Novembre 2001 §123 Décembre 2001 §141 et Janvier §145), Corning a abandonné tous ses développements de plaques en nid d'abeille, non pas à cause d'échec technique, mais du coût du développement et d'une entrée trop tardive sur le marché (en 2000).

Agilent, commercialise en sus des ses plaques à haute densité des microréseaux à faible densité sur mesure pour la recherche. CombiMatrix devrait également exploiter ce marché avec sa technique propre de dépôt électrochimique permettant le montage des sondes directement sur la plaque. Affymetrix (35% du marché), Apogent (21%) et GeneMachines (17% du marché), vendent des machines permettant de construire ses réseaux personnels.

Les utilisations changent également Nanogen (microfluidique) et Motorola abandonnent les microréseaux d'expression pour l'analyse du polymorphisme pour le profilage pharmacologique ou le diagnostic.

123. Affymetrix et Monsanto ont signé un accord de fourniture des microréseaux pour étudier le développement des plantes et les pathologies. L'un des réseaux est celui couvrant tout le génome d'Arabidopsis. Selon Monsanto, la firme préfère acheter ses réseaux plutôt que de les monter elle-même. PRNewswire (26MAR02).

124. Archer Daniels Midland annonce le lancement d'une étude de faisabilité pour la production de carburant biodiesel à partir de soja. Ceci est réalisé à la suite de la décision du Minnesota de soutenir la production de ce carburant. L'étude sera faite autour de l'usine de trituration de Mankato de la firme. ADM a également des installations en Europe. ADM Press Release (02APR02 et http://www.admworld.com.

Archer Daniels Midland et Nutraceutix ont signé un accord de licence exclusif sur l'utilisation de la technique d'enrobage dans des matrices de Nutraceutix pour la libération contrôlée de suppléments alimentaires (Controlled Delivery Technology™). ADM Press Release (29MAR02).

Le premier supplément commercialisé consiste en isoflavones de soja (phytoœstrogènes) en doses journalières.

125. Cargill construit dans l'Ohio une installation de traitement des protéines de soja pour en éliminer le goût désagréable. Cargill Press Release (19MAR02).

Cargill commercialise une glucosamine (sous forme de chlorure) qui ne provient pas de Mollusques. En effet, la très grande majorité des producteurs utilisent cette source, mais elle est source d'allergies. Cargill Press Release (08MAR02). La glucosamine est utilisée pour prévenir l'ostéoarthrose. Il faut cependant remarquer que NIH est seulement en train de vérifier ces assertions. Je n'ai pas trouvé de brevet concernant cette technique et aucune demande déposée n'est actuellement publiée. Il est probable que la glucosamine est extraite de cartilages. Usuellement utilisée sous forme de sulfates, elle est alors moins concentrée que sous la forme de chlorures. Une autre forme utilisable est la poly-N-acétyl-D-glucosamine qui disparaît moins rapidement dans le sang.(voir la demande de brevet 20010014671 (16AUG01).

126. Diversa a obtenu les US Patents 6 361 974 (26MAR02) et 6 352 842 (19MAR02) sur sa technique dite "Exo-mediated Fragment Hybridization evolution technology".

Le premier brevet porte sur une technique utilisant une recombinaison au hasard de polynucléotides et un réassemblage par une exonucléase qui permet des raboutissages difficiles à réaliser dans des chimères. Elle augmente beaucoup la diversité génétique potentielle en multipliant les crossing-overs lors de l'assemblage. .

Elle complète la technique Tunable GeneReassembly™, qui pilote les crossing-overs sans faire appel à  la recombinaison au hasard ainsi que sa technique Gene Site Saturation Mutagenesis™ qui permet de changer n'importe quel nucléotide dans la séquence.

L'US Patent 6 358 709 (19MAR02) couvre cette technique d'évolution GeneReassembly™ qui complète les techniques DirectEvolution™ de la firme et permet une reconstitution faisant appel à des mutations et des réassemblages non aléatoires.

127. DuPont (via sa filiale Pioneer Hi-Bred International) et Monsanto se sont mis d'accord sur un certain nombre de points. Pioneer détiendra une licence des nouveaux montages Roundup Ready™ de Monsanto pour le maïs et le soja et paiera des redevances sur ces produits. Il en sera de même sur les résistances aux insectes de nouvelle génération. L'accord antérieur sur l'événement MON810 YieldGard™ (relativement ancien) sera aménagé pour une plus grande couverture géographique et des termes financiers plus favorables. Les accords sur la commercialisation du glyphosate sont également aménagés. Les querelles sur les germplasmes seraient résolues (?). DuPont Press Release (02APR02).

128. Genoptera, une filiale commune de Bayer et Exelixis fondée en 2000, a identifié plus de 90% des gènes d'Heliothis virescens. Bayer a consacré plus de 200 millions d'Euros dans des collaborations avec des firmes américaines depuis 1998. Bayer Press Release 03APR02).

129. Genzyme Transgenics est en train de réorganiser ses finances et, manifestement, son indépendance. La firme produit plusieurs protéines hétérologues dans du lait de mammifères. La firme vient de racheter 2,82 millions d'actions de Genzyme General division de Genzyme Corporation qui détenait 18% de Genzyme Transgenics. Genzyme Transgenics Press Release (05APR02).

130. Martek Biosciences va acquérir OmegaTech, une firme du Colorado produisant de l'acide docosohexaènoïque (DHA). PRNewswire (26MAR02). Cette firme lui permettra d'avoir un plus large accès aux marchés des boissons et aliments.

C'est un échange d'actions qui est utilisé, avec les défauts de ce genre d'acquisition. Des actions supplémentaires, équivalant à 40 millions de dollars sur deux ans, dépendent de quatre étapes, deux dans l'obtention des autorisations réglementaires, et deux des volumes commercialisés et des bénéfices réalisés. OmegaTech opère depuis 1987 et a plus d'une centaine de brevets acquis ou en examen sur l'utilisation du DHA (voir par exemple l'US Patent n°6 177 108 (23JAN01) pour une incorporation dans le lait). Elle utilise la production des DHAs par Thraustochytrium et Schizochytrium, (des Labyrinthulomycotes pour ceux qui savent apprécier, ce sont des champignons (ou des algues non-photosynthétiques avec un thalle de quelques cellules et des exigences tout particulièrement fastidieuses) alors que Martek utilise Crypthecodinium cohnii (une Dinophycée) et Phaeodactylum tricornutum (une diatomée) sur une grande échelle. Voir le Bulletin de Mars §119.

131. Maxygen et Eli Lilly ont fait évoluer très rapidement la production de tylosine par Streptomyces fradiae, en utilisant les techniques MolecularBreeding™ de recombinaisons généralisées du génome entier de la bactérie avec un financement du National Institute of Standards and Technology Advanced Technology Program. YX Zhang et al.; Nature 415 (07FEB02) 644-646.

Cette technique est couverte par les U.S.Patents 6 117 679, 6 287, 861, 6 287 862, 6 335 198 et 6 309 883, ainsi que le brevet européen EPO 934999B1, que l'on peut consulter pour les détails.

132. Monsanto et Ceres annoncent une collaboration destinée à améliorer le développement de produits destinés à l'agriculture. C'est la génomique de Ceres que Monsanto veut utiliser et qu'il payera, tandis que les capacités de développement et de production de Monsanto complètent le dispositif

L'accord prévoit que les résultats pourraient, dans certains cas, bénéficier aux pays en développement ainsi qu'aux organisations humanitaires pour des cultures de subsistance. Monsanto Press Release (03APR02).

La croissance des surfaces cultivées avec des OGMs continue à s'accroître dans le monde selon une mise au point du National Agricultural Statistics Service américain cité par Monsanto. Cette année ce sont 14% de surfaces en plus qui sont consacrées aux cultures développées par la seule firme Monsanto, soit 48 millions d'hectares au total. [Monsanto Press Release (28MAR02)]. L'Indian Genetic Engineering Approval Committee du gouvernement indien vient d'autoriser les cotons transgéniques de Monsanto commercialisés par Maharashtra Hybrid Seeds. [Monsanto Press Release (27MAR02)]. Selon Monsanto, l'utilisation d'insecticides a baissé de 800 000 tonnes en une seule année sur les cultures de cotons transgéniques Bollgard™. Ces cultures sont maintenant commercialisées dans 7 pays Etats-Unis, Chine, Mexique, Australie, Argentine, Afrique du Sud et Indonésie. Ces cotons couvrent 6,8 millions d'hectares pour 5,3 en 2000.

Inversement, le Saskatchewan Organic Directorate de Saskatoon, une organisation représentant un millier de fermiers "biologiques " attaque la firme Monsanto et Aventis Cropscience Canada et demande des compensations pour des pertes de revenus liés à la contamination de cultures "biologiques" de colza par des OGM résistants au glyphosate. Elle voudrait également interdire les essais de blés transgéniques Roundup Ready™ en cours. Les producteurs auaient perdu un marché de 500 tonnes de canolas "biologiques" vers les pays de l'Est. Les blés "biologiques" représentent, eux, la moitié des revenus des revenus des fermiers "biologiques". Ces fermiers n'ont pas reçu de consignes de la part des deux firmes pour éviter ces incidents. Monsanto renvoye les plaignants vers leurs vendeurs de semences, car la firme ne vend rien directement !!!. Un lawyer du Saskatchewan fait, d'ailleurs, une remarque judicieuse en soulevant le cas bien connu  Schmeiser v. Monsanto où un cultivateur de canola du Saskatchewan a été condamné pour avoir utilisé des semences Roundup Ready™ sans autorisation de Monsanto. Si ces semences appartiennent à Monsanto la firme doit payer les dédommagements correspondants à ce type de semences. Les industriels rétorquent que les fermiers "biologiques" n'ont qu'à se  prendre à eux-mêmes, puisque c'est à leur demande que les OGMs ont été exclus des règles gouvernant les productions "biologiques".

Le danger ne provient pas tant des fermiers "biologiques" que des fermiers ordinaires pratiquant des cultures conventionnelles qui sont beaucoup plus nombreux. L'un de ces derniers a d'ailleurs été condamné pour avoir pulvériser des pesticides par inadvertance sur les champs d'un fermier "biologique". Voilà un belle bagarre. Les avocats admettent que ce n'est pas d'un danger pour la santé mais pour les portefeuilles qu'il s'agit. A Bouchie; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 210.

A un plus haut niveau les industriels accusent les pays de violer les accords de l'organisation  internationale du commerce qui stipule que les interdictions ne doivent porter que pour des raisons scientifiquement prouvées. Tout ceci est bien compliqué. La pollution génétique est facile à prouver, mais pas les dangers pour la santé que moins en moins de gens avancent.

133. Nestlé a développé un moyen d'enrichir en fer des aliments contenant des lipides sans encourager les oxydations des susdits lipides. Food Ingredient News (01MAR02).

134. Genzyme Transgenics est en train de réorganiser ses finances et, manifestement, son indépendance. La firme produit plusieurs protéines hétérologues dans du lait de mammifères. La firme vient de racheter 2,82 millions d'actions de Genzyme General division de Genzyme Corporation qui détenait 18% de Genzyme Transgenics. Genzyme Transgenics Press Release (05APR02).

135. Sigma-Aldrich vient d'ouvrir le Sigma-Aldrich Life Science and High Technology Center. Il hébergera jusqu'à 240 scientifiques. Genetic Engineering News (15MAR02).

136. Sub-Surface Waste Management, une filiale d'U.S.Microbics, annonce qu'elle va poursuivre plusieurs firmes pour avoir enfreint l'US Patent 5 334 533 (02AUG94) en affirmant qu'elle détient tous les droits sur la minéralisation de tout composant organique sous la surface du sol!!! Il y a de quoi arrêter bien des entreprises de bioremédiation si les termes d'une licence sont abusifs. Il y a, rien qu'aux Etats-Unis, 110 000 sites à dépolluer et le tarif est, en moyenne, de 250 000 dollars par site. US Microbics Press Release (28MAR02).

La Politique

 

137. Une publication qui mérite réflexion est celle de B Barrett; Nature Biotechnology 20 (FEB02) 191-193, sur l'utilisation des publications pour empêcher la prise de brevets par des concurrents. Cet article part de l'exemple de l'IBM Technical Disclosure Bulletin. Si on met dans le domaine public certaines inventions, on oblige les concurrents à rendre plus étroites les revendications d'un brevet concurrent potentiel. Il analyse les cas où cette stratégie peut être payante, mais met en garde contre le fait qu'on peut, par une erreur dans la rédaction, "se tirer dans les pieds". Bien sûr cette stratégie de publications défensives vise à protéger les intérêts industriels. On peut cependant lire le texte de façon inverse. Prenons le cas des biotechnologies, et surtout des brevets sur le vivant, qui ont parfaitement illustré le fait que ce n'est pas le bien-être de l'humanité et des scientifiques en particulier qui est visé. On pourrait très bien envisager une telle utilisation des données scientifiques par les organismes publics de recherche, si on veut empêcher, à priori, le brevetage des gènes eux-mêmes. Il reste cependant de nombreuses précautions à prendre avant de se lancer dans cette direction, car elle est, en principe, irréversible pour les organismes de recherche qui la pratiquerait.

138. Le charbon n'est pas très contagieux entre humains, et la panique qui a suivi les premiers cas de charbon volontairement disséminés était certainement plus dangereuse que l'agression elle-même. La prise préventive pendant des semaines de l'antibiotique recommandé dans ce cas (et des autres antibiotiques) est contre-indiquée à cause des effets secondaires. VV Demidov; Trends in Biotechnology 20 (MAR02) 97. L'auteur indique qu'il faut pendre des précautions, comme avant de traverser une route et il n'y aucun raison de paniquer. Il cite son propre exemple en Russie où les gens vivaient au voisinage d'une installation de destruction de bovins atteints de charbon, sans qu'aucun cas de contamination humaine n'ait été constaté. Il ne devait pas habiter à Sverdlovsk en 1979 (mais dans ce cas c'est carrément d'un aérosol qu'il s'agissait.

139. L'Open Society Institute (OSI) du financier spéculateur devenu philanthrope sur ses vieux jours, George Soros, a lancé à Budapest une initiative intéressante en faveur de la publication libre des données scientifiques par  des moyens électroniques sans passer par les éditeurs, avec une donation de 3 millions de dollars. Cette somme sera destinée à des bibliothèques gratuites d'articles scientifiques, les logiciels de recherche étant déjà libres de redevances sur le Net. Il s'agit maintenant de persuader les organisations de recherche de contribuer à cette initiative.

Plusieurs universités sont maintenant dans le coup aux Etat-Unis. Cette initiative a le même objectif que la Public Library of Science, mais plutôt que de contraindre les éditeurs à réviser leur position commerciale qui étrangle la recherche par des prix d'abonnements que celle-ci ne peut plus assumer, l'initiative vise à convaincre les chercheurs de la communauté publique d'alimenter ces banques de données. Les organismes pourraient favoriser l'initiative en rendant obligatoire, pour tous les détenteurs de financements contractuels, le dépôt de leurs résultats dans ces banques, et amener les scientifiques à jouer, en faveur de ces bibliothèques, leur rôle d'éditeurs et de lecteurs des "manuscrits". D Butler; Nature 415 (14FEB02) 721. Noter que cela est paru dans une revue privée.

140. On trouvera dans Nature 415 (14FEB02) 726-729, quatre lettres à l'éditeur ou articles dénonçant chacune une ou plusieurs façons de faire un mauvais usage des nombres de citations issues de ISI.

141. Comment exploiter ses propriétés intellectuelles entre licences et collaborations fait l'objet d'un article de P Duxbury et al.; Nature Biotechnology 20 (FEB02) 91-92.

Les apports mutuels de droits dans une collaboration ou une licence constitue une propriété intellectuelle (IP) d'arrière plan ("background IP") c'est-à-dire ce que l'on possède au moment de l'accord. Il faut les définir clairement dès le départ, pour pouvoir établir celle qui se développera au cours de la collaboration, c'est-à-dire l'"improvement" ou "foreground  IP". Le problème réside alors dans le savoir faire, qui n'est pas codifié dans les mêmes termes et c'est souvent l'excuse utilisée pour laisser les choses dans le vague. Les résultats de la collaboration peuvent être des suites de la "background IP"  ou complètement indépendante. Les droits sur les résultats doivent être, donc, être définis précisément. Dans un accord de licence, le détenteur de l'IP tend à conserver tous les acquis nouveaux développés par le licencié. Le problème pour les vendeurs de licences sont les infractions à la liberté de compétition vues par les lois européennes. En effet, les brevets sont, par essence, anticompétitifs. Il existe des biais pour résoudre ces problèmes comme les "Technology Transfer Block  Exemption" édictés par le règlement 96/240/EC de la Commission qui exclue spécifiquement tout accord obligeant le licencié à céder automatiquement au détenteur du brevet l'IP sur les améliorations de la technologie couverte par l'accord de licence et qui sont le fait du licencié. Les conséquences pratiques de ces finesses du concept sont difficiles à analyser et pourtant peuvent annuler un accord de licence. 

Les vraies collaborations comporte un partage de l'IP, mais cela nécessite de bien rédiger les textes correspondants. Le problème résulte le plus souvent du fait que les lois gouvernant ces accords varient d'un pays à l'autre. En Grande-Bretagneles lois stipulent que l'accord des deux parties est généralement nécessaire et ceux-ci ont peu de marges de manœuvre. Il en va tout autrement aux Etats-Unis. Les droits d'utilisation commerciale de chacun des partenaires sont usuellement définis soit par aire géographique ou par usage. Il faut cependant bien définir de quels droits dispose chacune des parties pour exploiter la nouvelle IP, et de quels accords de licence elles doivent disposer pour utiliser chacune la "background IP" de l'autre. Le problème reste relativement simple pour une collaboration entre une industrie et une institution de recherche. On constate souvent que l'IP reste acquise à la partie industrielle avec une licence pour l'institution de recherche en vue de la poursuite de la recherche (c'est tout bénéfice pour l'industrie).

En ce qui concerne la "background IP", son détenteur est, usuellement, obligé de la défendre pour protéger les deux partenaires. S'il ne le fait pas, il doit offrir cette propriété au partenaire en première option, à charge pour ce dernier de la défendre. Le cas de la "foreground  IP" est plus délicat. Il y a d'abord le problème du dépôt de brevet, en quel nom, et qui doit défendre ces droits. Cette dernière clause est importante car un procès coûte horriblement cher, surtout s'il faut étendre la protection au monde entier. A priori c'est au détenteur de l'IP de déclarer ce qu'il veut faire pour la défense, et s'il y renonce c'est au licencié d'entrer en jeu. Le licencié doit chercher à obtenir que le détenteur de l'IP soit responsable des brevets objets de la licence contre une contestation par une tierce partie. Cette assurance peut être limitée à ce que peut savoir le détenteur des brevets ou être absolue. Les détenteurs de l'IP sont extrêmement réticents à donner ces garanties. De toute façon, il faut prévoir le remboursement de toutes sommes versées au titre de la licence, si celle-ci n'est plus exploitable. Cela a été, par exemple le cas pour l'accord de licence sur la technique RACHITT d'Enchira Biotechnology avec Genencor International qui a dû être annulé lorsqu'Enchira a perdu son procès avec Maxygen (voir le Bulletin de Décembre 2001 §138 et 143).   

Un problème traité est celui de déterminer ce qui se passera si la commercialisation d'un produit va nécessiter plusieurs licences de partenaires différents. Il est évident qu'une accumulation de licences va entraîner une addition de redevances qui ne doit pas détruire tout l'intérêt commercial du montage. Les termes du contrat sont particulièrement difficiles à élaborer dans ces conditions.

On ne pense usuellement pas à prévoir au départ, dans les termes d'un accord, à ce que l'on doit faire si la collaboration capote. C'est pourtant un point souvent décisif pour la répartition des droits sur la "foreground  IP".

 

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