Concepts et Techniques

1. La revue de H Nishitani et al.; Gene to Cells 7 (MAY02) 523-534 revient sur les mécanismes d'autorisation de la réplication au cours du cycle cellulaire (voir également le Bulletin de Septembre 2001 §1, avec la revue de BA Edgar et al.; Cell 105 (04MAY01) 297‑306 qui traite de l'endoréplication et donc du contournement de cette régulation).

Les CDKs (Cyclin Dependent Kinases) sont les régulateurs principaux du cycle cellulaire, avec les protéines d'initiation de la réplication comme ORC (Origin Recognition Complex), Cdc6/18 (6 pour S.cerevisiae et 18 pour Sch.pombe), Cdt1 ( (Cdc10 dependent transcript 1) et le complexe MCM (Mini-Chromosome Maintenance) qui sont conservés de la levure aux mammifères.

A la fin de la mitose, MCM est chargé sur la chromatine grâce à ORC, Cdc6/18 et Cdt1; ceci autorise la réplication. ORC est composé de six sous-unités (Orc1 à -6). Il permet la fixation de Cdc18 et Cdt1. Cdc6/Cdc18 s'accumule à la fin de la mitose et disparaît au début de la réplication. Elle semble jouer un rôle dans l'inactivation des CDKs mitotiques et intervient donc dans le point de contrôle S vers M. Cdt1 s'accumule au cours de G1 et disparaît également dès le début de la réplication. Chez S.cerevisiae elle est expulsée du noyau au cours de la même transition.

Cdc18 et Cdt1 ont un rôle clé dans l'autorisation de la réplication. Ces deux protéines se fixent indépendamment, mais agissent de façon synergique lors de la charge de MCM sur l'ADN. Cdc6/18 (et probablement Cdt1) ne sont plus utiles après cette étape.

 MCM est un complexe pré-réplicatif de 6 protéines (MCM2 à 7) présentant une séquence conservée de 240 acides aminés rassemblée dans une structure hexamérique stoichiométrique présentant une activité ATPasique. Le MCM marque l'ADN non répliqué, et doit être déplacé pour que la réplication ait lieu. Il se déplace, en effet, avec la fourche de réplication, fonctionnant comme une hélicase (du fait d'un changement conformationnel concomitant) et retire, au passage, l'autorisation de fonctionner aux origines de réplication dès le passage de G1 (avant réplication) à la suite du cycle.

Les CDKs, avec la kinase Cdc7, permettent le recrutement du complexe de réplication, mais participent aussi au blocage des origines de réplication, et c'est leur dépression en fin de cycle qui octroie le visa à répliquer.

Chez certains organismes, comme le Xénope et les Mammifères, vient se superposer un second mécanisme faisant intervenir la géminine qui, présente en phase S (réplication) et G2 (après réplication), réprime Cdt1, actif seulement en G1 et S, empêchant ainsi une seconde réplication avant la mitose.

Des points de contrôle permettent de vérifier que tout est en ordre avant de permettre la progression du cycle, et notamment la mitose. Tout incident au niveau de l'ADN entraîne le blocage de la protéine kinase mitotique Cdc2 (kinase unique connue sous différents noms chez les levures). Celle-ci est maintenue à un niveau intermitotique par phosphorylation d'une tyrosine. Chez les mammifères, Cdk2, 4 et 6 sont actives au début de la phase S, et agissent sur les cyclines spécifiques de la phase S, tandis que Cdk1 (la Cdc2) est nécessaire à l'initiation de la phase M. La commande de la phase M est essentielle, car elle est dominante sur les autres. Des cellules à d'autres phases partent en mitose quand on les fusionne avec des cellules en phase M.

Les origines de réplication les mieux connues sont celles de la levure, avec les ARS (Autonomous Replicating Sequences). Elles sont courtes (100–200 pb) avec une séquence consensus de 11 pb. Celles des autres eucaryotes sont plus complexes, et l'on n'y décèle aucune séquence consensus.

2. On sait que les activités isolatrices de la chromatine (chromatin boundary activities ou BAs) sont liées à des domaines de la chromatine qui, quand ils flanquent un gène que l'on insère dans le site réprimé HML du type sexuel de Saccharomyces cerevisiae, lui évitent d'être également réprimé.

On sait également, que plusieurs protéines impliquées dans les échanges nucléo-cytoplasmiques comme les exportines Cse1p, Mex67p et Los1p, ont le même effet. Ces protéines de transport empêchent l'expansion de l'hétérochromatine en scotchant le locus HML sur le récepteur Nup2p du complexe du pore nucléaire. La délétion du gène NUP2 supprime cette protection. Inversement, en fixant la protéine Nup2p sur les éléments bordant le gène, on restaure l'activité protectrice. K Ishii et al.; Cell 109 (31MAY02) 551-562.

3. Une revue de plus sur les microréseaux d'ADN fait le point sur les avancées récentes dans ce domaine par des chercheurs de Rosetta Inpharmatics: DD Shoemaker et al.; Current Opinion in Microbiology 5 (JUN02) 334-337.Celle-ci se concentre sur les avancées techniques et quelques utilisations marquantes.

Parmi les avancées récentes, les auteurs signalent qu'Affymetrix a utilisé la séquence humaine pour optimiser les sondes et diminuer le nombre de paires de sondes nécessaires pour caractériser chacun des 39 000 transcrits humains. L'allongement des sondes, sans compromettre les performances (60 nucléotides, voire des cDNAs complets), commencent à être disponibles, ce qui permet de tourner la difficulté causée par la construction de trop nombreux cDNAs.

L'utilisation de ces réseaux d'expression pour l'analyse de voies métaboliques est en train de se généraliser.

L'une des utilisations intéressantes mentionnées est celle de la réaction de l'intestin de souris germ-free à une colonisation par une faune commensale (LV Hooper et al.; Science 291 (12JAN01) 881-884).

Rosetta Inpharmatics est en train de valider, grâce à des réseaux d'expression, les prédictions de gènes dans le génome humain.

On s'en sert également pour identifier les séquences codant les petits ARNs régulateurs dont on parle abondamment ces temps-ci, et qui sont difficilement identifiables au sein de la séquence génomique complète.

Le repérage des épissages alternatifs est maintenant possible. C'est intéressant dans la mesure où ces épissages interviennent, apparemment, pour 40% des gènes humains (et probablement chez les autres mammifères).

On a également récemment la technique pour analyser la réplication d'un chromosome de Saccharomyces cerevisiae et caractériser le schéma temporel d'utilisation des origines de réplication.

4. L'interférence entre gènes et éléments régulateurs est inévitable chez les eucaryotes aux génomes condensés comme la levure Saccharomyces cerevisiae. Les séquences d'arrêt de transcription sont souvent très proches de celles d'initiation. Ceci cause des encombrements stériques gênant la ARN polymérase II, et probablement d'autres intervenants.

On sait que, pour les gènes en tandem GAL10 et GAL7, la terminaison de la transcription est inefficace pour le gène en amont, de sorte que l'initiation de celle du gène aval est inhibée. En réalité, on vient de montrer que le phénomène existe également quand les deux gènes sont convergents. L'initiation se fait bien, mais le chaos s'installe quand les deux transcrits commencent à se recouvrir. Ce n'est pas une interférence ARN liée à la convergence. Dans les deux cas, la terminaison doit se faire efficacement pour que les polymèrases ne viennent pas se gêner. EM Prescott et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8796-8801.

5. On a récemment achevé la délétion ciblée de tous les gènes non essentiels chez la levure Saccharomyces cerevisiae.  On a pu, ainsi, analyser ce qui se passe lors d'un fait imprévu, comme une lésion de l'ADN. La sagesse populaire voudrait faire dire que l'on doit, dans ce cas, s'attendre à voir induire tous les gènes de réparation. C'est d'ailleurs le postulat de base des réseaux d'expression globale. Il n'en est rien, aucun des gènes surexprimés n'appartient à la famille connue des gènes de réparation. Les protéines correspondantes sont donc en quantité suffisante dans la cellule. Il faut donc faire très attention à ce que l'on fait dire aux profils de transcription. GW Birrell et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8778-8783.

6. Le principe de la perception d'un gradient quelconque est une répartition initiale uniforme des récepteurs de la substance et des G-protéine trimériques associées, élicitant un comportement chimiotactique, suivi d'un regroupement des récepteurs et des transmetteurs en avant des cellules quand elles ont perçu le signal. La réponse est une réorganisation du cytosquelette avec polymérisation de l'actine F. C'est ce qui se passe chez Dictyostelium discoideum et les leucocytes des mammifères. Les gradients, même faibles, de chimioattractants perçus provoquent un regroupement  localisé des domaines dits PH qui se fixent sur les phospho-inositides. C'est le cas de celui du régulateur cytosolique de l'adénylylcyclase (Crac) de D.discoideum qui se porte en avant des cellules en migration chimiotactique. Si la concentration est uniforme. Les phosphoinositides PI(3,4,5)P3 et PI(3,4)P2 sont impliqués dans ces regroupements. Les kinases correspondantes (phosphatidylinositol 3-kinases ou PI3K) ont un rôle  plein de contradiction selon les types cellulaires auxquels on s'adresse et au phénotype que l'on mesure, que ce soit avec des mutations dans le gène de l'enzyme ou sous l'action d'inhibiteurs. M Iijima et al.; Cell 109 (17MAY02) 599-610 et S Funamoto et al.; p.611-623 montrent que la PI3K se localise de façon transitoire en avant de la cellule en réponse à la présence d'un chimioattractant. La voie de signalisation correspondante est activée sur les faces latérales de la cellule par rapport au gradient. Un autre régulateur, la PI 3-phosphatase PTEN caractérisée initialement comme un  suppresseur de tumeurs, se déplace dans l'autre sens.

7. Le centrosome, avec ses deux centrioles, est le principal organisateur des microtubules dans les cellules animales. Le nombre des ces organites et leur organisation est l'objet de régulations avec un cycle organisé par des phosphorylations réversibles et des protéolyses qui sont analysées dans la revue de P Meraldi et al.; FEBS Letters 521 (JUN06) 9-13, qui est essentiellement entrée sur le centrosome des Vertébrés.

Les deux centrioles ne sont pas équivalents et, curieusement, il se passe un cycle cellulaire et demi avant que le centriole ait acquis sa structure définitive. C'est la réplication et cette maturation qui sont analysées, en particulier.

La kinase cycline dépendante Cdk2 est impliquée à la fois dans la réplication de l'ADN et la duplication du centrosome, mais la cycline partenaire semble pouvoir être différente dans ces deux cas car c'est la cycline E qui intervient pour le centrosome (au moins chez Xenopus) et la cycline A chez les cellules somatiques des Mammifères. Mais comme on ne connaît pas très bien cet aspect, il se pourrait que les deux cyclines jouent de façon séquentielle. La cible de cette kinase est également inconnue et l'une d'entre elles pourrait être la protéine kinase mMps1p de la levure et ses homologues chez les mammifères, avec des contradictions encore difficiles à résoudre. On constate les mêmes difficultés avec un autre substrat potentiel, la chaperone nucléophosmine/B23.

Deux autres protéines kinases sont impliquées dans la duplication du centrosome. L'une est la ZYG-1 kinase de Caenorhabditis qui est indispensable pour la duplication du centrosome, mais n'a pas de rôle dans la progression du cycle cellulaire, et la CaMKII  (calcium-calmoduline kinase II). Cette dernière observation souligne un rôle du calcium dans cette duplication, d'autant plus que la calmoduline et la protéine liant le calcium, centrine/Cdc31 est impliquée dans la duplication de l'équivalent du centrosome chez la levure.

Enfin la protéolyse via l'ubiquitine semble intervenir dans la régulation de la duplication. L'un des points sur lesquels la protéolyse aurait un effet serait le changement d'orientation des centrioles l'un par rapport à l'autre avant la duplication.

Il reste donc beaucoup de choses à élucider dans le mécanisme. L'étude des anomalies de cette duplication apporte plutôt une certaine confusion car de très nombreuses protéines aux fonctions disparates sont identifiées lors d'anomalies de la duplication, et l'on se creuse la tête pour comprendre comment elles peuvent intervenir.

La maturation du centrosome porte surtout sur le montage de la matrice péricentriolaire avec le recrutement d'une batterie de protéines. Elle est accompagnée par un accroissement sensible de la quantité de la g-tubuline, et on voit apparaître les marqueurs de maturation que sont les ninéine et cenexine/Odf2. Là encore on a des kinases, mais on ne connaît pas leurs substrats, sauf chez la Drosophile où une protéine a été identifiée sous le nom suggestif de Asp (Abnormal spindle) qui interviendrait dans le couplage des microtubules au centrosome. Elle est phosphorylée par la kinase Polo.

La séparation des centrioles ancrés par la protéine C-Nap1 (alias Cep250) sur un complexe protéique qui les lie est régulée par des phosphorylations/déphosphorylations dont les enzymes ont été identifiées. Tant que la kinase et la phosphorylase sont actives,elles se neutralisent mais, à la mitose, la phosphatase est éliminée probablement sous l'action de la kinase Cdk1 et les deux centrioles sont libres de dériver sous l'action des microtubules.

Une acquisition relativement récente est que la formation du fuseau est en réalité indépendante du centrosome, ce qui réconcilie les observations faites chez les plantes qui n'ont pas de centrosome, ou même les œufs des animaux, mais qui semble vraie pour les cellules somatiques animales. Le centrosome intervient pour accélérer la formation du fuseau, et assurer une plus grande fidélité de la ségrégation des chromosomes. Une observation aussi intéressante est le fait que la suppression du centrosome par microchirugie n'empêche pas un bon nombre de cellules de se diviser mais que ces cellules ne peuvent plus réinitier un cycle de réplication de leur ADN.

8. Une revue sur les antisens est parue avec E Gerhart et al.; Trends in Genetics 18 (MAY02) 223-226. Elle insiste sur le fait que de nombreux mécanismes naturels impliquent des antisens. Les petits ARNs interférants (RNAi) en font partie. On suppose généralement que les deux mécanismes interviennent par une interférence liée aux ARNs doubles brins.

L'utilisation des antisens et de la co-suppression (par des ARNs sens) est bien connue chez les plantes. On s'est servi depuis de nombreuses années des antisens chez Escherichia coli, mais l'efficacité de ces derniers est souvent très variable et une amélioration rationnelle s'est révélée illusoire pour des raisons qui restent à établir. Il semble que les résultats soient plus constants chez Staphyloccocus aureus. Y Ji et al.; Science 293 (21SEP01) 2266–2269.

On connaît plus de 100 ARNs antisens qui régulent des éléments génétiques indépendants des bactéries (plasmides, phages et transposons). Dans ces cas, ce sont des mécanismes fonctionnant le plus souvent en cis, c'est-à-dire que les ARNs sens (cible) et antisens sont directement transcrits en sens inverse sur la même séquence. Dans le cas de régulation de séquences chromosomiques (mais on n'en connaît que quelques-unes) les séquences antisens fonctionnent en trans, (c.a.d. que l'antisens est transcrit à partir d'une séquence différente sur le chromosome). Ceci a pour conséquence que la complémentarité n'est pas parfaite. On a, par ailleurs, décrit un régulateur pleïotrope d'E.coli, Hfq, qui forme un complexe avec des ARNs en se liant aux séquences riches en AU et qui facilite l'hybridation entre les sRNAs et leur cible dans le cas d'une complémentarité approximative. 

Les mécanismes de régulation sont très divers. On connaît la destruction des ARNs homologues, mais il y a également l'obstruction lors de la traduction, ou inversement la stimulation par démasquage d'un site de fixation des ribosomes,  la terminaison prématurée de la transcription.

9. LC Lazzeroni  et al.;  Trends in Genetics 18 (JUN02) 283-284, font un compte rendu du  "Keystone Symposium on Genotype to Phenotype: Focus on Disease" qui s'est tenu en Février. Si le symposium a été l'occasion de démonstrations de modèles murins d'une foule de maladies disparates, les auteurs insistent sur le fait qu'il y a bien des choses qui s'interposent entre le génome et le phénotype et que si des associations sont certes observées, des erreurs sont inévitables vu la complexité des intervenants.

L'un des points est de nature méthodologique. Il s'agit de la comparaison de séquences humaines et murines par Edward Rubin de Berkeley grâce à un ensemble de logiciels dénommé VISTA (http://www-gsd.lbl.gov/VISTA/index.html) GG Loots et al.; Genome Research 12 (MAY02) 832-839, permettant d'identifier les éléments régulateurs aux alentours des gènes. Il a permis d'identifier par simple comparaison un nouveau gène de métabolisme des lipides.

Une autre nouveauté est la création à grande échelle de souris transgéniques exprimant des versions marquées de gènes, GENSAT (dans ce cas de gènes importants dans le système nerveux), utilisant des chromosomes bactériens artificiels comportant le gène d'une GFP améliorée, mais qui devrait pouvoir être appliquée ailleurs. Ceci est le fruit d'une collaboration de N Heinz de Rockefeller University avec des collègues neurologues. Les auteurs font, par ailleurs, remarquer que la taille des BAC permet un effet d'isolateur par rapport à la chromatine environnante, quand on se sert des Bacs pour exprimer un transgène et que l'expression sous la commande de ses propres séquences régulatrices est plus fidèle. http://www.hhmi.org/research/ investigators/heinz.html

Le problème du génotypage a grande échelle a été abordé par plusieurs firmes. En effet on tend, de plus en plus dans des systèmes à haut débit, à rassembler les ADNs de centaines d'individus pour estimer la fréquence des allèles SNPs en un site donné. On peut ainsi déceler des différences entre les ADNs d'individus sans symptômes d'un désordre donné et ceux qui en présentent. Sequenom, Orchid Biosciences et Bruker Daltonik en ont présenté des exemples. Ces techniques ne sont manifestement pas adaptées à l'analyse détaillée d'un individu d'un groupe. Mais un chercheur de Roche Molecular Systems a attiré l'attention sur le fait que la marge d'erreur peut être très grande du fait du "pooling" et elle pourrait déborder les différences subtiles entre gènes causant un risque relativement faible. Un chercheur de DNA Sciences craint que les hétérozygotes ne soient sous-représentés dans ces analyses et ne crée des faux positifs ou des faux négatifs dans les associations.

Il existe, par ailleurs, une préoccupation sur la mauvaise reproductibilité des conclusions sur les associations entre gènes et phénotypes dans le cas des maladies humaines, moins de 75% des associations sont confirmées après leur publication. (voir JN Hirschhorn  et al.; Genetics in Medicine 4 (MAR-APR02) 45-61). Les auteurs ont analysé 25 des résultats non reproductibles. Une méta-analyse indique une association lâche dans 7 des cas et qui peuvent résulter d'une analyse insuffisamment puissante des résultats. .

La question de l'existence de blocs haplotypes (courtes régions du génome où le déséquilibre de liaison entre séquence du bloc est fort, alors qu'il est faible entre séquences appartenant à des blocs différents (voir pour le déséquilibre le Bulletin de Juillet §68) a été discutée. Si ces microfrontières sont réelles, et elles pourraient l'être dans une population, on devrait pouvoir utiliser des marqueurs de blocs (un lot restreint de SNPs) , sans que le contenu de chaque bloc soit, pour autant, homogène. L'existence de ces blocs a été discutée par N Hirschorn et un chercheur de Genaissance Pharmaceuticals qui ont apporté des confirmations empiriques pour l'instant (voir JC Stephens et al.; Science 293 (20JUL01) 489–493 et R Judson et al.; Pharmacogenomics 3 (MAY02) 379). L'utilisation des blocs peut cependant introduire des biais cumulés quand on cherchera à raffiner à partir de l'identification d'un bloc intéressant.

10. On trouvera dans Nature 418 (11JUL02), plusieurs revues générales sur des aspects de la biologie des ARNs, et notamment leurs rôles au cours des premiers stades d'établissement de la vie sur notre globe. L'une d'entre elles est celle de l'équipe de TR Cech (JA Doudna et al.; p.222-226) sur les diverses ribozymes naturelles.

Le premier exemple qui ait été révélé est celui de l'auto-épissage des ARN ribosomaux du cilié Tetrahymena (introns de type I).Le suivant a été celui du rôle catalytique du composant ARN de la ribonucléase P (RNase P), qui était la première ribozyme décrite fonctionnant comme une vraie enzyme, c'est-à-dire avec une réutilisation répétée, contrairement à la précédente qui ne fonctionne qu'une seule fois. On a cependant remodelé les introns auto-épissables pour qu'ils puissent être réutilisés en trans.

Les ribozymes naturelles cellulaires et virales ne réalisent que des transferts de  phosphodiesters, mais on peut, après une sélection in vitro, leur faire faire beaucoup d'autres choses. On a ainsi identifié des ribozymes capables de synthétiser un nucléotide à partir de la base et du sucre, de former une liaison amide, former de l'acyl-coenzyme A, etc… Ce qui manque actuellement c'est une connaissance plus approfondie de la structure et des mécanismes chimiques des ribozymes ainsi sélectionnées.

L'activité auto-clivante du virus de l'hépatite delta ou de Tetrahymena est de l'ordre de celle de la RNase A, c'est-à-dire d'enzymes protéiques classiques

On sait que les catalyseurs stabilisent l'état de transition entre substrat et produit. Protéines et  ribozymes assurent cette stabilisation en ajoutant ou prélevant des protons, orientant ainsi le substrat de façon à ce que la réaction soit facilitée. On a pensé un certain temps qu les ribozymes utilisaient des ions métalliques comme réactifs. C'est vrai des introns auto-épissables et de la RNase P. Cela ne l'est pas pour les ribozymes qui assurent des clivages site-spécifiques comme les hammerhead, hairpin, le satellite Varkud de Neurospora (VS) et celle du virus de l'hépatite delta (HDV). Aucune n'est, apparemment, une métalloenzyme. Les ions métalliques décelés servent, apparemment, au maintien de la structure, et non à la catalyse.  Les ribozymes hairpins comportent deux domaines interagissant pour faciliter la catalyse.  Celle-ci facilite la coupure des ARNs en engendrant un hydroxyl d'un côté et un 2',3'-phosphate cyclique de l'autre.

Ce sont de petites molécules de 40-160 nucléotides. La plus petite est celle "en tête de marteau" (hammerhead) avec 40 nucléotides. C'est la plus efficace et elle assure la réplication de viroïdes et de satellites de virus végétaux (comme la mosaïque d'Arabis) en  débitant un génome à partir de la forme multimérique engendrée par le procédé du cercle roulant. C'est également le cas des hairpins et du HDV. C'est surtout cette dernière qui a été étudiée.

Comme les ribonucléases protéiques, les ribozymes utilisent une variété de mécanismes catalytiques. Dans les deux cas la molécule catalytique doit acquérir une conformation particulière, et l'on s'est beaucoup intéressé aux structures actives. L'acquisition de la conformation prend du temps (de quelques dizaines de millisecondes à plusieurs minutes, avec des étapes intermédiaires hiérarchisées. De plus, la chaîne des événements conduisant à la conformation active ne semble pas unique pour une molécule d'ARN. Tout ceci a été observé à l'échelle de la molécule unique, mais in-vitro. Il est vraisemblable, qu'in vivo, des protéines viennent assister ces reconfigurations. Ceci a probablement mené, au cours de l'évolution, à des assemblages ARN-protéines plutôt qu'aux ribozymes pures qui restent des acteurs mineurs dans le métabolisme cellulaire.

Les Productions Végétales

Les gènes et les génomes

11. On trouvera dans Plant Physiology 129 (JUN02) 394-437 les résumés des projets de la NSF américaine dans le cadre de "Arabidopsis 2010" ainsi que de la génomique des plantes en général.

12. Les cartes génétiques d'Eucalyptus ont surtout été basées sur des marqueurs RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) et AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Ces cartes ont été suffisantes pour établir l'existence de plusieurs QTLs (Quantitative Trait Loci). Mais leur manque de contenu informatif, et la lourdeur de certaines techniques ont empêché d'en tirer partie par extrapolation.

Une carte de liaison génétique des Eucalyptus (Eucalyptus grandis et E.urophylla) constituée par le placage, sur les cartes existantes RAPD et microsatellites, de marqueurs microsatellites polymorphes, vient d'être publiée. Elle permet l'alignement de ces deux cartes d'eucalyptus les plus cultivés sous les tropiques.  RPV Brondani et al;;  Molecular Genetics & Genomics 267,n°3 (MAY02) 338-347.

Soixante trois marqueurs microsatellite ont été assemblés en onze groupes de liaisons sur la carte de E.grandis, et 53 dans 10 groupes de liaisons chez  E.urophylla. On a ainsi pu établir des synténies (associations ordonnées de gènes) présentes dans les deux espèces.

Si maintenant on considère le sous-genre Symphyomyrtus, qui comprend la quasi-totalité des variétés  commerciales, on constate une "transportabilité" de l'ordre de 90% de la carte. On devrait pouvoir découvrir et valider les QTLs dans chacune de ces espèces.

13. Le gène respiratoire cox2, de la sous-unité 2 de la cytochrome c oxydase a été récemment (sur le plan évolutif) transféré de la mitochondrie vers le noyau chez les plantes à fleurs.

Le gène a été caractérisé chez deux Légumineuses: Vigna unguiculata (le soja des restaurants) et Glycine max (le soja oléoprotéagineux de grandes cultures). Le premier a perdu le gène mitochondrial et le second en a conservé une copie silencieuse dans le génome mitochondrial. Tous deux tournent donc avec le gène nucléaire. On a recherché des étapes intermédiaires dans ce transfert (voir KL Adams et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96 (23NOV99) 13863-13868).

Neuf espèces contiennent des copies intactes des deux formes. Les deux gènes sont transcrits dans des espèces qui sont distribuées phylogéniquement avec des espèces ayant perdu l'une ou l'autre des deux formes. Jusqu'à présent on n'avait jamais détecté d'expression simultanée des deux formes. L'inactivation de cox2 a eu lieu à de nombreuses reprises et sous des formes très diverses. Ce qui est intéressant c'est qu'il n'apparaît pas d'avantage sélectif à exprimer l'un ou l'autre des gènes, alors que l'observation de l'inactivation ou de la perte de la seule forme mitochondriale avait fait supposer qu'il y en avait un. Il y a, en réalité, un nombre égal d'inactivations des deux formes.

Le transfert est récent (sur le plan évolutif) et implique des modifications comme l'adjonction d'une séquence de ciblage vers la mitochondrie. Cette séquence est bordée de deux introns. Chez le soja industriel, l'importation mitochondriale de la protéine Cox2 fait intervenir trois clivages indépendants de son assemblage. La dernière étape de maturation a seulement lieu dans la mitochondrie des Légumineuses. Les 20 premiers aminoacides permettent le ciblage mitochondrial et sont remplaçables par une autre préséquence de ce type. La partie centrale de cette préséquence est requise pour le transport dans la mitochondrie. Les 12 derniers aminoacides dérivant de la séquence de la protéine codée par la mitochondrie et sont nécessaires à la maturation correcte de la protéine importée. L'ablation de cette préséquence complexe est donc nécessaire à l'utilisation du gène maintenant nucléaire. DO Daley et al.; Plant Journal 30 (APR02) 11-21.

14. La domestication, puis la sélection variétale, ont imposé de fortes contraintes au génome des plantes cultivées. Le maïs est évidemment concerné.

Des chercheurs de l'University of Wisconsin, Madison ont recherché, dans  501 gènes du maïs, les signatures de la sélection.  Ils ont analysé les microsatellites ou les répétitions de séquences simples (SSRs). Ils ont appliqué aux données des techniques qui permettent de déceler les écarts par rapport à une sélection neutre et d'autres tenant compte du goulet d'étranglement évolutif qu'a constitué la domestication.

L'intérêt de détecter, au niveau de la séquence, les traces de la domestication et de la sélection variétale permet de limiter le nombre de gènes à traiter pour y trouver les caractères agronomiques intéressants, même si on ne connaît, ni le gène, ni la fonction sélectionnée. Y Vigouroux et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (23JUL02) 9650-9655.

15. L'histoire du blé à partir de ses ancêtres est connue dans ses grandes lignes avec les blés diploïdes comme Triticum/Aegilops (génomes A, S, D), les blés tétraploïdes comme Triticum turgidum (AABB) et Triticum timopheevii (AAGG) et le blé tendre actuel hexaploïde  Triticum aestivum (AABBDD). Le groupe de Hazelkorn a étudié les gènes Acc-1 de l'acétyl-CoA carboxylase et Pgk-1 de la 3-phosphoglycérate kinase plastidiales. S Huang et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (11JUN02) 8133-8138.

 Triticum urartu est bien le donneur du génome A des blés tétraploïdes et hexaploïde. Le génome A a divergé de celui de T.urartu il y a moins d'un million d'années (ce qui indique une apparition récente des blés polyploïdes).

Les génomes D de T.aestivum et Aegilops tauschii sont identiques, ce qui confirme que T.aestivum résulte d'une hybridation entre T.turgidum et Ae.tauschii, et ceci il y a moins de 8 000 ans. Les ancêtres de Triticum et Aegilops, sources des génomes A, B, D, G et S ont divergé il y a 2,5-4,5 millions d'années. Acc-1 et Pgk-1 ont manifestement une histoire différente dans les différentes lignées, indiquant une mosaïque du génome et une hétérogénéité intra-spécifique. Les génomes S d'Aegilops speltoides et G de T.timophevii sont très proches et indique une origine pas très éloignée de parties de leurs génomes. Aucun des génomes d'Aegilops actuellement analysés n'est proche du génome B dont on ne connaît donc pas l'origine.

16. L'un des éléments essentiels au maintien des télomères est la télomérase composée de la réverse transcriptase (TERT) est d'un ARN. La séquence codant la TERT de la télomérase du riz vient d'être séquencée et caractérisée. Il n'en existe qu'un exemplaire dans un génome haploïde.

Sa régulation se révèle complexe. Les niveaux observés dans la cellule ne sont pas corrélés avec l'activité enzymatique. On observe de nombreux transcrits épissés différemment dans tous les tissus, qu'ils soient télomérase-positifs ou -négatifs. Les données indiquent que, comme pour les TERT de Mammifères, la télomérase du riz assure d'autres fonctions que le maintien des télomères. K Heller-Uszynska et al.; Plant Journal 31 (JUL02) 75-86.

La transformation cellulaire

17. On trouvera un montage de vecteurs d'expression transitoire avec les deux composants du geminivirus de l'enroulement de la feuille du chou (CbLCV) pour piloter l'expression de gènes d'Arabidopsis. L'intérêt des virus à ADN est de pouvoir être inoculés sous forme de plasmides, sans impliquer une transformation. Ce sont des vecteurs intéressant quand on veut pratiquer un "silencing" momentané. MA Turnage et al.; Plant Journal 30 (APR02) 107-114.

18. Si on charge trop un vecteur basé sur le virus de la mosaïque du Tabac, on limite l'invasion systémique et le spectre d'hôte potentiel. Des chercheurs du Scottish Crop Research Institute et de Large Scale Biology ont modifié le déplacement et le spectre d'hôte de tels vecteurs par réarrangement du gène codant la protéine de mobilisation 30 kDa du virus.

 Un premier tour de mutagenèse a produit 53 clones plus rapides dans leur dissémination dans la plante. Deux cycles de réarrangements ont encore amélioré ce phénotype. L'analyse des clones les plus performants indique que des substitutions codantes et silencieuses sont actives à des degrés divers sur ce phénotype. RL Toth et al.; Plant Journal 30 (JUN02) 593-600.

L'expression génique

19. On sait que des transgènes comportant des répétitions inversées se prêtent facilement au "silencing" post-transcriptionnel probablement à la suite de la production d'ARNs doubles-brins à partir des transcrits complémentaires. On vient de montrer que trois ou quatre répétitions suffisent à provoquer un blocage à 100% de la transcription du gène correspondant dans les transformants primaires, quelle que soit la force du promoteur utilisé. La propriété est transmissible au cours des générations, et elle est valable en trans. C Ma et al.; Plant Journal 31 (JUL02) 37-49.

20. Le facteur de transcription ABI5 d'Arabidopsis active plusieurs gènes de la fin de l'embryogenèse. Des chercheurs de l'INRA à Versailles et du CNRS à Gif ont étudié l'expression de plusieurs de ces gènes. Un autre facteur de transcription, EEL, entre en compétition avec ABI5 pour la même séquence cible dans le promoteur de plusieurs des gènes commandés, qu'il stimule, contrairement à ABI5, qui les répriment. Ce sont pourtant des facteurs homologues. S Bensmihen et al.; The Plant Cell 14 (JUN02) 1391-1403.

La reproduction

21. La tomate cultivée (Lycopersicon esculentum) quoiqu'auto-compatible, dérive de Lycopersicon auto-incompatibles à la suite de la défaillance du système d'exclusion des pollens incompatibles. Des chercheurs de Mie University ont essayé de comprendre les mécanismes moléculaires de cet effondrement de cette barrière moléculaire. Deux publications récentes traitent de ce sujet. K Kondo et al.; Plant Journal 29 (MAR02) 627-636 et K Kondo et al.; Plant Journal 30 (APR02) 143-153.

Dans la première les auteurs ont analysé les protéines du style et recherché les activités RNasiques. On n'en trouve pas chez la tomate cultivée. Si on fait exprimer par cette dernière la S-RNase S6 de L.esculentum. Les styles des tomates transgéniques expriment la RNase à un niveau comparable à celui de L.esculentum, mais ne rejettent pas leur propre pollen comme on pourrait s'y attendre (pas plus que celui de L.esculentum. Ce n'est donc pas la seule absence de la RNase qui cause l'auto-compatibilité.

La protéine riche en asparagine HT, identifiée au départ du style de Nicotiana alata, est un autre acteur intervenant dans les phénomènes d'auto-incompatibilité. Les gènes des protéines HT-A et HT-B de L.peruvianum (LpHT-A et LpHT-B) et de L.esculentum (LeHT-A et LeHT-B) ont été clonés et analysés. On observe un décalage de phase dans la séquence codante de LeHT-A et un codon stop prématuré dans LeHT-B. Aucun transcrit de LeHT-B n'est observé dans le style de  L.esculentum. Une double mutation dans les gènes de la S-RNase et de HT est donc probablement responsable de l'auto-compatibilité.

La seconde publication montre que la réduction de l'expression de HT-B est le mécanisme historique de la perte de l'auto-incompatibilité chez les Lycopersicon.

22. Les mutants de la synthèse de l'acide jasmonique sont atteints dans la maturation du pollen, la déhiscence des anthères et les défenses contre les prédateurs. C'est le cas de mutants du gène CYP74A de l'allène oxyde synthase. Ces mutants présentent des défauts dans les anthères et la formation du pollen entraînant une stérilité mâle. Ils montrent que l'enzyme est indispensable à l'ensemble de la production des jasmonates. Le niveau d'expression de l'enzyme est limitant pour les réactions de réponse aux blessures, mais que c'est au niveau de son substrat l'hydroperoxyde produit grâce aux lipoxygénases et aux phospholipases que se situe la limitation dans une plante normale. JH Park et al.; Plant Journal 30 (JUN02) 1-12.

Le développement

23. L'expression de cycloidea dans les régions dorsales des méristèmes floraux d'Antirrhinum entraîne la symétrie bilatérale des fleurs. Le gène cycloidea s'exprime peu de temps après l'induction florale. Il est également exprimé dans les tiges, alors que celles-ci ne présentent pas de symétrie bilatérale visible. Celles qui l'expriment sont les tiges secondaires situées juste sous l'inflorescence et celles des mutants floricaula. Une expression asymétrique de cycloidea est également observée dans les primordia des sépales des fleurs terminales des mutants centroradialis. cycloidea semble répondre à un patron préexistant commun dans l'apex, et son effet semble résulter d'une interaction avec les gènes floraux. JL Clark et al.; Plant Journal 30 (JUN02) 639-648.

24. Les méristèmes peuvent être déterminés (développement limité) ou indéterminés. Le méristème des inflorescences du maïs est indéterminé. Un gène, indeterminate floral apex1 (ifa1) régule ce caractère. Il assure, de plus, l'identité des méristèmes. D Laudencia-Chingcuanco et al.; Development 129 (01JUN02) 2629-2638.

25. Les gènes knox (knotted1-like homeobox) gouvernent de nombreux processus du développement des plantes. Le produit du gène SEMAPHORE1 réprime un sous-groupe de gène knox du maïs. Ce sont les gènes rough sheath 1 et gnarley1 (knox4). Des mutations récessives de semaphore1 entraîne une expression ectopique de gènes knox,  dans la feuille et l'albumen. Cette expression ectopique est différente de celle d'autres gènes gouvernant  celle des gènes knox, car il intervient dans le développement de l'embryon, l'albumen, les racines latérales et le pollen. Le transport polaire de l'auxine est également perturbé chez les mutants de semaphore 1. Il est vraisemblable que ce défaut dans le transport explique les effets pleïotropes.  MJ Scanlon et al.; Development 129 (01JUN02) 2663-2673.

26. Les mutants d'un nouveau gène, TRANSPARENT TESTA GLABRA2 (TTG2), ont un développement perturbé des trichomes et de la production des tannins et mucilages de l'enveloppe de la graine d'Arabidopsis. Ce gène a été repéré par marquage par le transposon endogène Tag1. Il code un facteur de transcription porteur du motif WRKY Trp-Arg-Lys-Tyr).

 TTG2 agit en aval de l'initiation de la formation des trichomes par TTG1 et GLABROUS1. TTG2 est associé à GLABRA2 dans la régulation de la croissance des trichomes. Dans la paroi des graines, l'expression de TTG2 dépend d'un TTG1 fonctionnel pour la production des tannins. CS Johnson et al.; The Plant Cell 14 (JUN02) 1359-1375.

La Physiologie des Plantes

27. Le système de transduction de signaux du milieu à partir de récepteurs à deux composants se fait, chez les bactéries, grâce à un capteur à histidine-kinase phosphorylant un aspartate (histidine-to-aspartate phosphotransfer) d'un transmetteur appelé régulateur de réponse.

Chez Arabidopsis, trois capteurs à histidine-kinase ont été caractérisés, ETR1, ERS et CKI1, impliqués dans la perception du signal éthylène pour les deux premiers, et les cytokinines pour le troisième. Ce n'est que récemment que régulateurs de réponse ont été caractérisés avec les ARRs (voir plus loin).

Deux  revues sur les acquis récents dans le domaine de la transduction des signaux sont parues. L'une porte sur les signaux engendrés par les cytokinines est parue avec J Sheen; Science 296 (31MAY02) 1650-1652 et l'autre, I Hwang et al.; Plant Physiology 129 (JUN02) 500-515, sur les systèmes à deux composants en général chez Arabidopsis. Elle est basée sur une analyse du génome. On en trouverait 54 différentes. Une autre revue traite des protéine-kinases Ca2+ dépendantes. Les fonctions précises de ces kinases sont énigmatiques. Il y en aurait 34. SH Chen et al.; Plant Physiology 129 (JUN02) 500-515..

Les méristèmes caulinaires et racinaires sont les cibles principales, mais pas exclusives des cytokinines. Ces voies sont amorcées par l'interaction entre cytokinines et un système à deux composants ressemblant aux systèmes récepteurs bactériens (voir, pour ceux que cela intéresse, l'introduction de A Imamura et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95 (03MAR98) 2691-2696). Cette cascade est relativement conservée chez les plantes. La revue s'intéresse surtout au modèle Arabidopsis et introduit les "STKE Connections Maps" correspondantes de Science (http://stke.sciencemag.org/cgi/cm/CMP_10021) et le "Cytokinin Signaling Pathway" (http://stke. sciencemag.org/cgi/cm/CMP_9724).

Chez Arabidopsis la voie comporte des récepteurs AHKs (Arabidopsis hybrid Histidine protein Kinases) et des transmetteurs AHPs (Arabidopsis Histidine Phosphotransfer proteins) agissant, après translocation nucléaire, sur les ARRs (Arabidopsis nuclear Response Regulators) qui régulent positivement ou négativement la transcription. Il existe une boucle en retour liée aux produits des ARRs. Le rôle des phosphorelais dans la transmission chez les plantes est beaucoup moins bien connu que dans le cas des bactéries.

On connaît, chez Arabidopsis, au moins trois gènes de récepteurs de cytokinines, AHK4 (alias CYTOKININ RESPONSE 1, CRE1) ou WOODEN LEG (WOL), AHK2, et AHK3.

Les produits des gènes d'histidine protéines kinases, cytokinin independent 1 (CKI1) et CKI2 (également dénommée AHK5), peuvent également déclencher la réponse "cytokinine" en l'absence de cytokinines exogènes. On a des indices selon lesquels CKI1 et les AHKs perçoivent différemment le signal cytokinine. CKI1 est actif en permanence tandis qu'AHK4, AHK2 et AHK3 ne sont activés qu'en présence de cytokinine. AHK2 et AHK3 doivent donner lieu à un certain recouvrement de fonction avec AHK4.

Les activateurs de transcription ARRs sont de deux types. Le type B (ARR1, ARR2 et ARR10) sont porteur d'un domaine MYB-like qui sert lors de la fixation sur l'ADN, et un domaine d'activation de la transcription, riche en glutamine, et renforce l'activation de la transcription du gène codant ARR6 déclenchée par les cytokinines.

Ce dernier fait partie, avec ARR4, ARR5 et ARR7 du type A qui sont des inhibiteurs agissant dans le cadre d'une boucle en retour, et qui agissent par interactions protéines/protéines. .

Le type B semble être le produit d'un réarrangement naturel de domaines, héritages aussi bien procaryotes qu'eucaryotes.

Le rôle de la phosphorylation d'ARR1 et ARR2 (un des facteurs limitant de la réponse) reste à préciser, mais semble bien être celui de l'élimination d'une répression de l'activité des ARRs. Il doit y avoir une certaine redondance entre les ARRs de type B, car les mutants arr1 ne conduisent pas à une modification bien claire du phénotype.

Ces cascades sont manifestement activables par d'autres signaux stress, sucres ou phytochrome B.

29. Il existe au moins deux gènes de l'acide 1-aminocyclopropane-1-carboxylique synthase (ACS) chez le riz qui sont impliqués dans la réponse de la plantule à la submersion. L'expression du gène OsACS5 est gouvernée par un équilibre entre actions des gibberellines et de l'acide abscissique.

L'équipe de Van Montagu a étudié le schéma temporel et spatial de l'expression de ce gène chez le riz émergé et immergé. Ce schéma indique que le gène intervient dans la croissance végétative dans toutes les conditions, mais qu'il est surexprimé en submersion. Il est possible qu'il puisse intervenir sur la formation de l'aérenchyme qui se développe en submersion. Z Zhou et al.; Plant Physiology 129 (MAY02) 72-84.

30. Les parois des champignons  contiennent des b-1,3-glucanes comme polymère principal, tandis que ce sont des b-1,4-glucanes dans celles des plantes. Il existe, cependant, un  b-1,3-glucane chez les plantes, et c'est le callose. Il est produit dans le pollen et lors d'attaques de pathogènes ou de blessures. L'enzyme membranaire permettant la synthèse du callose a été caractérisée chez Arabidopsis. Elle est bien homologue à la b-1,3-glucane synthase de la levure L Ostergaard et al.; Plant Molecular Biology 49 (AUG02) 559-566. L'expression maximale est observée dans la fleur. C'est une cible de la voie de l'acide salicylique.

31. Le développement de la pomme de terre est sérieusement handicapé par les stress thermiques. Ces stress peuvent être compensés par une concentration de calcium dans le sol supérieure à celle nécessitée pour une croissance à température normale. MD Kleinhenz  et al.; Physiologia Plantarum 115 (MAY02) 111-118.

32. La source principale du fer, dans notre alimentation réside dans les plantes, et pourtant, comme tous les organismes, elles ont du mal à s'en procurer et il ne faut pas qu'elles en absorbent trop, car le fer est alors toxique.

Lors d'une carence en fer, les racines d'Arabidopsis induisent la production d'un transporteur de cations divalents IRT1 dont des chercheurs de l'INRA et du CNRS de Montpellier viennent de montrer qu'il est indispensable au pompage du fer. Il est exprimé dans les couches extérieures de la racine en réponse à une carence en fer. G Vert et al.; The Plant Cell 14 (JUN02) 1223-1233.

L'équipe de Dartmouth College, associée aux précédents, publie ses résultats sur la régulation  de ce transporteur par les métaux. La synthèse commence dans les 24  heures après le début de la carence et atteint son pic à 72 heures. Il disparaît, ainsi que son messager, en 12 heures après le retour à la normale. Sa surexpression ne modifie pas le pompage des métaux. De plus, si on exprime son gène de façon permanente, la protéine n'est présente dans les racines que quand le fer manque. Dans ces plantes surexprimant le transporteur, ce dernier sert au pompage du cadmium et du zinc. EL Connolly et al.; p.1347-1357.

33. Deux lignées d'orge, Riso 17 et Notch-2, accumulent du phytoglycogène, une forme hyper-ramifiée de l'amidon) dans leurs grains. Il leur manque une isoamylase (isa1) dans l'albumen. Ces deux mutants sont alléliques (variants d'un même gène). Ces mutations ont un effet très accusé sur le nombre (beaucoup de petits grains) et la structure (pas de grains normaux A et B) des grains d'amidon. RA Burton et al.; Plant Journal 31 (JUL02) 97-112.

34. Le génome d'Arabidopsis code, apparemment, dix fois plus de transporteurs de peptides qu'aucun autre organisme. Il constituent trois familles: celle des transporteurs de type ABC (caractérisés par une ATP-binding cassette, et dont l'énergie provient de l'hydrolyse de l'ATP), les  transporteurs  de di- et tripeptides et une nouvelle famille de transporteurs de tétra- et pentapeptides (dont l'énergie provient du gradient de protons). on ne connaît pas les fonctions précises de ces transporteurs mais des substrats potentiels sont la glutathione, les g-glutamyl peptides, les conjugués hormone–amino acides, les phytosulfokines, et des composés assimilés comme les phytotoxines tabtoxine et phaséolotoxine. G Stacey et al.; Trends in Plant Science 7 (JUN02) 257-263. Les auteurs font le tour de tous ces transporteurs, y compris dans les plantes carnivores. Certains de ces transporteurs sont de type des transporteurs multidrogues et, au passage, de peptides. Il est d'ailleurs que, vu l'absence des transporteurs de métaux lourds chez Arabidopsis certains de ces transporteurs les remplacent dans ce rôle, en pompant la phytochélatine.

35. Les glucosinolates (glucosides de certaines crucifères) contiennent soufre et azote et constituent une défense contre les herbivores en combinaison avec des thioglucosidases (alias myrosinases). Il est maintenant plus facile de comprendre leur synthèse à partir de la séquence génomique et des mutants d'Arabidopsis. L'intérêt de ces composés réside dans leur fonction de défenses mais également comme substances toxiques ou bénéfiques pour la santé humaine. U Wittstock et al.; Trends in Plant Science 7 (JUN02) 263-270.

Les cinq premiers gènes de cette synthèse ont été identifiés en 2000. Cinq autres sont venus s'ajouter récemment. Les enzymes correspondantes ont été  caractérisées.

Le rôle des myrosinases est intéressant, car si leur substrat est présent partout, l'enzyme est dispersée dans quelques cellules. Mâchant ou coupant les organes de la plante, on met en présence les deux, ce qui libère l'aglucone correspondant qui est instable, donnant des isothiocyanates et nitryles. Des facteurs protéiques viennent piloter la nature du produit final.

36. Les lumières bleue et UV-A interviennent dans plusieurs mécanismes régulateurs chez les plantes. Leurs récepteurs ont été récemment identifiés. Les phototropines Phot1 et Phot2 sont des récepteurs à kinases particuliers aux plantes. Ils ont des fonctions partiellement redondantes dans le phototropisme, la migration des chloroplastes et l'ouverture des stomates d'Arabidopsis. On ne sait, cependant, pas encore comment sont assurées ces fonctions. WR Briggs et al.; Trends in Plant Science 7 (MAY02) 204-210.

Les rôles respectifs de ces deux récepteurs avaient été décrits peu de temps avant dans le cas de l'évitement des chloroplastes.  T Kagawa et al.; Plant Cell Physiology 43 (APR02) 367-371. La lumière bleue induit le déplacement des chloroplastes. Ils évitent une insolation trop forte, mais rejoignent les régions modérément éclairées de la cellule. Ces deux réponses d'évitement et de concentration est annulée chez des mutants d'Arabidopsis thaliana. Elles impliquent les gènes PHOT1 et PHOT2. Phot1 et Phot2 régulent l'accumulation tandis que Phot2 régule, seul, l'évitement.

Les symbioses

37. Les Cycadacées sont des gymnospermes très primitives des régions tropicales ou subtropicales (mais on en trouve dans nos jardins publics) ressemblant à des palmiers trapus. Ce sont les seules gymnospermes connues fixant l'azote dans des racines spéciales dites corraloïdes où la plante est associée à des cyanobactéries. On en connaît 9 genres et environ 150 espèces. On ne sait pas comment les racines sont envahies, mais on a récemment réussi à reconstituer la symbiose.

Les cyanobactéries sont décrites comme Anabaena cycadae ou Nostoc cycadae. Il persiste un certain flou dans cette systématique purement morphologique. De plus ces identifications ont été pratiquées dans des plants "civilisés" de jardins botaniques, etc… Un inventaire moléculaire vient d'être réalisé par des chercheurs chinois et suédois. W Zheng et al.; FEMS Microbiology Ecology 40 (JUN02) 215-222. Ils montrent que la population cyanobactérienne varie d'une plante à une autre (ce qui avait déjà été montré chez des Cycas et Gunnera), et qu'une même racine (et même dans ses différentes régions) héberge plusieurs espèces bactériennes. Cette diversité est plus réduite dans les cycas de serre. Ceci indique une grande souplesse de cette symbiose.

38. La glutathione est un tripeptide à thiol (GSH; g Glu-Cys-Gly) très abondant dans les nodules où ils assurent de multiples fonctions. Chez certaines des légumineuses, comme le pois, on trouve de l'homoglutathione (hGSH; g Glu-Cys-bAla), en sus ou à la place de la glutathione. Un cDNA, GSHS2, exprimé dans les nodules, mais pas dans les feuilles, vient d'être caractérisé. Il code une hGSH synthétase. C'est probablement une protéine homodimérique cytosolique. Ce n'est donc pas une glutathione à large spectre mais une synthétase spécifique. I Iturbe-Ormaetxe et al.; Physiologia Plantarum 115 (MAY02) 69-73.

Les pathogènes des plantes et les mécanismes de défense

39. EDS1 d'Arabidopsis est indispensable aux résistances engendrées par un groupe de protéines R contenant un domaine N-terminal de type Toll et Interleukine-1, un site de fixation de nucléotides et des répétitions riches en leucines (protéines TIR-NBS-LRR).EDS1 n'est, par contre, pas nécessaire à celles qui ont, à la place de Tol, un motif coiled–coiled (protéines CC-NBS-LRR).

La résistance N au virus de la mosaïque du tabac fait intervenir une protéine R de type TIR-NBS-LRR qui nécessite EDS1. Ce n'est pas le cas pour la résistance Pto de la tomate à des Pseudomonas fluorescens (voir le paragraphe précédent) qui est due à une protéine kinase et Rx de résistance de la pomme de terre au virus PVX n'en ont pas besoin. Ceci a montré en neutralisant le gène EDS1 de Nicotiana benthamiana par VIGS (virus-induced gene silencing). Le recrutement d'EDS1 par les protéines TIR-NBS-LRR est donc conservé chez les dicotylédones et fonctionne au moins contre les bactéries, les oomycètes et certains virus. JR Peart et al.; Plant Journal 29 (MAR02) 569-579.

 Des chercheurs de Yale ont recherché les gènes intervenant dans cette voie de résistance en les réprimant également par "silencing" viral (VIGS) chez des Nicotiana benthamiana transgéniques contenant le gène N. Les lignées transgéniques présentent une réponse (HR) au TMV. Les gènes Rar1-, EDS1- et NPR1/NIM1-like sont requis. Y Liu et al.; Plant Journal 30 (MAY02) 415-429.

40. La reconnaissance entre protéines Avr et protéines R impliquées dans la résistance a lieu dans fait la cellule végétale, mais les bases moléculaires de cette reconnaissance sont, dans la plupart des cas, inconnues et on ne les a démontrées que dans deux de ces interactions dont celle avec Pto. La sérine/thréonine kinase Pto de la tomate permet une résistance aux souches de Pseudomonas syringae exprimant la protéine AvrPto. Ces deux protéines interagissent directement et déclenche les réponses de défense. Les chercheurs de Cornell et du Boyce Thompson Institute ont identifié une deuxième protéine de Pseudomonas dénommée AvrPtoB qui est injectée, via un système de sécrétion de type III (voir le § ), dans la cellule végétale, et déclenche les défenses. Il n'y a pas beaucoup de similitude dans les deux séquence de AvrPto et AvrPtoB, mais les acides aminés donnant une interaction avec Pto sont conservés. Il est vraisemblable que les protéines Avr et R interviennent sous la forme de complexes pour déclencher les défenses. YJ Kim et al.; Cell 109 (31MAY02) 589-598.

41. Le germacrène A a un rôle clé dans la synthèse de la sesquiterpène lactone, sous sa forme de (+)-germacrene A, et c'est un intermédiaire dans la synthèse de plusieurs phytoalexines. Deux gènes codant des sesquiterpène synthases de la chicorée ont été clonés par Plant Research International. Le produit a été analysé pour y localiser les acides aminés responsables de la spécificité. HJ Bouwmeester et al.; Plant Physiology 129 (MAY02) 134-144.

42. L'oomycète Phytophthora infestans est particulièrement destructeur pour les plantations de pomme de terre (famine irlandaise des années 1840). De nouvelles souches sont récemment apparues qui surmontent les résistances que l'on a pu monter (voir GE de Vries; Trends in Plant Science 5 (JUN00) 238 et CM Rommens et al.; Current Opinion in Biotechnology 11 (APR00) 120-125). La nature moléculaire des résistances unigéniques (gènes R) et quantitatives extraites de pomme de terre sauvages et cultivées est inconnue.

On vient de montrer que le gène R1 code une protéine à leucine zipper/NBS/LRR de 150 kDa. Ce gène est localisé dans une zone riche en gènes de résistances du chromosome V. Il ressemble au gène de résistance Prf de la tomate à Pseudomonas syringae. Le gène de résistance est inséré dans un autre gène qui confère la sensibilité. A Ballvora et al.; Plant Journal 30 (MAY02) 361-371.

43. Chez des diploïdes, les allèles d'un locus donné fonctionnent comme des entités indépendantes. On connaît, cependant, des allèles dont l'expression donne lieu à une interaction. On appelle transvection une interaction entre allèles qui implique un échange de signaux entre deux séquences régulatrices liées à chacune des séquences alléliques. Cet échange  entraîne une régulation dépendant d'un appariement. L'effet de la transvection est en général transitoire, et les allèles ne sont pas modifiés. Inversement les paramutations consistent en modifications héritables de l'expression sans modification de leurs séquences, après interactions entre les deux allèles. Il s'agit donc d'une modification épigénétique.

Deux allèles d'Arabidopsis, bal et cpr1-1 (constitutive expressor of PR genes 1), causent un nanisme et des réponses  permanentes de défense, un peu comme un autre variant nain, ssi1 (suppressor of SA-insensitivity 1). Leur phénotype est lié à une surexpression d'un gène de résistance R-like activant une voie de défense dépendant de l'acide salicylique. Ce gène est inséré dans un locus complexe du chromosome 4.

Le variant cpr1-1 ne modifie pas l'expression du groupe de gènes R-like. Les allèles bal et cpr1-1ne donnent pas lieu à une complémentation  dans des hybrides F1 (ce qui est attendu d'un allèle), mais les populations qui ségrègent ces deux allèles en F2 présentent 20% de plantes normales. La majorité des plantes normales portent un allèle cpr1-1 modifié. cpr1-1 est donc un allèle épigénétiquement modifié, déstabilisé chez les hybrides bal/cpr1-1. TL Stokes et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (11JUN02) 7792-7796.

C'est le troisième cas d'allèles épigénétiques dans ce locus qui est probablement un point chaud de variations épigénétiques, ce qui est intéressant pour des gènes de résistance qui se doivent de pouvoir évoluer.

44. La contamination des capsules de coton par Aspergillus flavus entraîne la présence d'aflatoxines regrettables qui rendent dangereux les aliments préparés à partir des graines de coton. La stimulation des défenses contre ce champignon est donc utile.

La production des naphthol-phytoalexines, 2,7-dihydroxycadalène (DHC) et 2-hydroxy-7-methoxy cadalène (HMC), et de leurs produits d'oxydation, ainsi que de la coumarine phytoalexine scopolétine est stimulée par une administration à des capsules du coton de méthyl-jasmonate associé  à des éliciteurs issus du champignon ou du lactate de chitosan. On observe alors une réduction de 75-95% de l'aflatoxine B1 présente. HJ Zeringue; Biochemical Systematics and Ecology 30 (JUN02) 497-503.

45. On vient de caractériser un nouveau gène exprimé spécifiquement dans les racines de coton d'une variété résistante au nématode Meloidogyne incognita (M-249) lors d'une infestation. Il s'agit de MIC-3. Le gène possède un intron. Il code une protéine de 141 amino-acides dont le messager porte 7 sites de polyadénylation dont la forme majeure est la plus longue. Il fait partie d'une famille d'au moins six gènes. Il est exprimé uniquement dans la racine et cette expression est amplifiée dans l'amorce des galles aux débuts de l'infestation. YD Zhang et al.; ; Biochimica et Biophysica Acta (BBA-Gene Structure and Expression 1576 (07JUN02) 214-218.

46. L'expression de peptides antimicrobiens est théoriquement intéressante pour le renforcement des défenses chez les plantes, mais des transgènes ne donnent pas de résultats constants  et prédictibles.le niveau de résistance n'est, en général, pas suffisant pat rapport aux fongicides classiques. On attribue parfois ce défaut à la dégradation des peptides par des protéases ou l'action de cations divalents. Des efforts pour accroître la résistance aux protéases ont donné lieu à de multiples publications. Il est , par ailleurs, intéressant d'utiliser des peptides d'origine animale qui n'ont pas subi la sélection par les agents phytopathogènes.

Des chercheurs d'Aventis CropScience et du CNRS à Strasbourg montrent que l'expression de peptides antifongiques riches en cystéines d'insectes chez des plantes (héliomycine d'Heliothis virescens et drosomycine de Drosophila melanogaster) protège des tabacs transgéniques de plusieurs maladies fongiques, notamment sur la germination des spores de Botrytis cinerea. N Banzet et al.; Plant Science 162 (JUN02) 995-1006. Ces deux peptides ressemblent beaucoup à des défensines végétales.

Les Insectes et leur Maîtrise

47. Les insectes luttent contre les infections par des mécanismes innés, et non par des mécanismes adaptatifs, comme la production spécifique des anticorps. Les réponses sont souvent une phagocytose, un enkystement cellulaire des intrus avec mélanisation, la production de protéases dans l'hémolymphe ou celles de peptides plus ou moins spécialisés contre bactéries et champignons. Les voies Toll et Imd sont les principales régulatrices de ces réponses immunitaires innées de la Drosophile.

La voie Toll des insectes est surtout activée par les bactéries Gram+ et les champignons et régule la plupart de peptides antimicrobiens, tandis que la voie Imd répond surtout aux Gram- et régule l'expression de peptides antibactériens.

Ces deux voies semblent totalement indépendantes, au sens où elles ne partagent aucun intermédiaire commun. Elles activent les gènes des réponses par des facteurs de transcription de type NF-kB.

La voie Toll est activée, in-vivo, par une cascade de protéases à sérine impliquant la protéase Necrotic qui modifie Spaetzle, qui est le ligand probable de Toll. La fixation de Spaetzle sur le récepteur Toll déclenche une cascade intracellulaire impliquant MyD88 et Tube, plus la kinase Pelle qui cible l'inhibiteur de NF-kB, Cactus (homologue de IkB), vers sa dégradation en le phosphorylant, libérant ainsi les facteurs NF-kB, ici appelés Dif et Dorsal (respectivement chez l'adulte et la larve) et leur permettant de passer dans le noyau pour y exercer leur office. Voir le Bulletin de Décembre 2001 §43.

On connaît sept composants de la voie Imd. La cible ultime de cette voie est Relish, qui ressemble à un facteur NF-kB qui semble devoir être modifiée pour passer dans le noyau. Son clivage dépend du complexe IkB de la mouche et de la caspase Dredd.

Cette voie dépend également de la perception du danger et une protéine chargée de ce rôle serait la protéine transmembranaire PGRP-LC. On connaissait le rôle des deux voies dans la régulation des gènes codant les peptides antimicrobiens, mais pas grand chose pour les autres gènes de défense.

Utilisant des réseaux d'expression permettant d'analyser celles des quelques 400 gènes répondant à une infection, des chercheurs du CNRS à Gif et de Berkeley ont étudié les effets de mutations dans les gènes régulateurs des deux voies. Elles interviennent effectivement sur tous les gènes de défense des réactions immunes innées. Il y a, cependant, quelques exceptions et une échappatoire doit exister, car certaines de ces défenses fonctionnent quand même quand Toll et Imd sont inactivées. Certains des gènes dont l'expression est modifiée sont regroupés et semblent répondre à une régulation commune. E De Gregorio et al.; The EMBO Journal 21, n°11 (03JUN02) 2568-2579.

48. On trouvera dans AR Weeks et al.; Trends in Ecology & Evolution 17 (JUN02) 257-262, une revue sur ce que l'on sait et ne sait pas des effets de la symbiose des Wolbachia avec leurs arthropodes hôtes. Je ne reprendrai pas les effets sur la différenciation sexuelle qui ont été abondamment discutés dans plusieurs numéros de ce bulletin (voir les bulletins d'Octobre 2001 §47, Décembre 2001 §40, par exemple)  pour revenir sur des aspects moins discutés dans la littérature. Ainsi on a affirmé que l'incompatibilité cytoplasmique (qui entraîne une mortalité zygotique des diploïdes ou une production de mâles haploïdes) est intervenue dans la spéciation, mais aucune preuve n'a été avancée. L'effet sur la compétitivité des spermatozoïdes a été montrée chez le coléoptère Tribolium confusum, mais les vérifications chez la drosophile n'ont rien donné. Quant aux effets sur l'adaptabilité (fitness), ils varient selon les insectes et peuvent être positifs comme négatifs.

49. Les réponses du génome du moustique Anopheles gambiae, vecteur sub-saharien de Plasmodium falciparum aux blessures, aux infections bactériennes et par cet agent du paludisme, ainsi qu'aux stress oxydatifs ont été étudiées grâce aux réseaux ADNs  par un consortium faisant intervenir l'EMBL, ainsi que la firme Cellzome de Heidelberg. Les réponses aux infections sont en partie superposables, mais la réponse aux stress oxydatifs est nettement distincte. G Dimopoulos et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8814-8819.

50. Les larves et adultes d'Aedes aegypti développent une résistance à la deltamethrine, un pyréthroide de synthèse. Ces résistants éliminent l'insecticide grâce à un cytochrome P450. Si on co-administre l'insecticide avec le potentiateur pipéronyl butoxyde, on ralentit sensiblement l'apparition de résistants. Des résistants sélectionnés sur l'insecticide seuls perdent brutalement leur résistance quand on les traite par ce dernier plus le potentiateur. La résistance est cependant progressivement regagnée par sélection continue. S Kumar et al.; Archives of Insect Biochemistry &Physiology  50 (MAY02) 1-8.

51. Une idée nouvelle a germé à propos de la grégarisation des criquets migrateurs. Les débris de produits végétaux ingérés par les sauterelles seraient transformés, dans les pelotes fécales, en phéromones par une bactérie,  Pantoea agglomerans. En effet guaiacol et phénol apparaissent dans les excréments des criquets sous leur forme migratrice, initiée par leurs regroupements massifs avant l'envol. RJ Dillon et al.; Journal of Applied Microbiology92 (APR02) 759-763.

Ils ont pu le démontrer sur une colonie axénique de l'insecte. L'introduction de la bactérie induit la formation de grandes quantités de guaiacol et d'un peu de phénol. Deux autres entérobactéries du tube digestif du criquet, Klebsiella pneumoniae pneumoniae et Enterobacter cloaca synthétisent également du guaiacol dans des pelotes axéniques. Enterococcus casseliflavus en produit un peu. Il est évident que le régime alimentaire module cette production, le précurseur de ces deux produits à activité phéromone est l'acide vanillique qui est libéré lors de la digestion, et converti en guaiacol par simple décarboxylation.

Les Biopesticides

 

52. On peut utiliser des champignons nématophages pour s'attaquer aux nématodes parasites des plantes. On a effectivement tenté de s'en servir, mais les résultats ne sont pas mirobolants. Il faut toujours se rappeler qu'une stratégie de parasites n'est jamais d'exterminer son hôte. L'exploiter sans modification ne permet, au mieux, que réduire les dégâts au dessous d'un seuil économiquement tolérable par l'agriculteur. Aller au-delà suppose des modifications artificielles de la virulence. On manque cependant d'informations sur les bases moléculaires de la virulence de ces champignons. C'est ce que des chercheurs du TNO néerlandais essayent en modifiant une protéase extra-cellulaire de type subtilisine, appelée PII utilisée par Arthrobotrys oligospora qui est un de ces champignons qui piègent les nématodes qui les frôlent. Il colonise ensuite le ver et la protéase est produite à ce stade. En surexprimant l'enzyme dans le champignon, on améliore son efficacité.

L'enzyme exprimée chez Aspergillus niger est, en elle-même, toxique in vitro pour les nématodes. J Åhman et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3408-3415.

53. Les endophytes sont des microorganismes colonisant les tissus végétaux, sans causer de dégâts évidents. Plusieurs d'entre eux ont, même, des vertus stimulantes sur la croissance de la plante. La réponse de cette flore à une infection par Erwinia carotovora subsp. atroseptica de la pomme de terre a été étudiée par des chercheurs autrichiens. Non seulement l'infection entraîne une diversification de la microflore, mais 38% des isolats caractérisés moléculairement ont, apparemment, un effet bénéfique sur la résistance de la plante. B Reiter et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (MAY02) 2261-2268.

 

Les Productions Animales

La transformation des cellules animales

54. La transformation des cellules hépatiques par les vecteurs adénoviraux entraîne une élimination rapide des cellules exprimant le transgène. C'est plutôt gênant. Elle est due à la réponse immunitaire à l'adénovirus.

L'apoptose observée peut être induite par le système immunitaire inné, via les récepteurs TNFR du TNF-a (Tumor Necrosis Factor a), Fas, et les récepteurs à "death domains" DR4 et DR5. On a déjà montré que le blocage du signal de TNFR prolonge la vie des cellules productrices de la protéine hétérologue par les hépatocytes.

Le ligand TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) est un des ligands actifs. On peut le neutraliser avec une forme soluble du récepteur DR5 exprimé par un vecteur adénoviral. Ce vecteur diminue également la production d'interféron g et l'activation des cellules NK stimulant, ainsi, la production d'une protéine marqueur hétérologue en limitant la mort des cellules productrices. HG Zhang et al.; Journal of Virology 76, n°11 (JUN02) 5692-5700.

Les clonages

55. On trouvera dans OA Ryder; Trends in Biotechnology 20 (JUN02) 231-232 et la réponse de P Loi et al.; p.233, un commentaire sur l'article consacré par ces derniers au clonage d'un mouflon (P Loi et al.; Nature Biotechnology 19 (OCT01) 962-964), discuté dans le Bulletin de Novembre 2001, §54. Il faut rappeler que c'est avec un noyau d'un mouflon mort qu'a été pratiqué le transfert, et pourtant la relative facilité a surpris les auteurs. Dans leur réponse les auteurs du clonage insistent sur le fait que, contrairement à ce que l'on pourrait penser, les noyaux de cellules devenues non viables (dénaturées selon les auteurs) sont plus efficaces dans un clonage que les noyaux normaux, ce qu'ils ont vérifié chez le mouton.

Par ailleurs, la discussion portant sur l'opportunité d'un tel clonage fait ressortir qu'un embryon viable est une chose positive, mais que, au-delà des défauts souvent constatés chez les clones, l'utilisation de mères porteuses perturbe l'"éducation" du nouveau-né et ne le prépare probablement pas à une survie dans la nature.

Un autre objectif est visé avec la préservation, même en captivité, d'un pool génique, de façon à injecter, si nécessaire, une variabilité dans une population devenue trop consanguine à la suite d'un goulet d'étranglement génétique.

L'expression des gènes

56. On vient de montrer, qu'il est possible de supprimer spécifiquement , chez des souris adultes, l'expression de transgènes par des ARNs homologues doubles brins dans le cadre du "silencing" par ces ARNs interférants. AP MacCaffrey et al.; Nature 418 (04JUL02) 38-39.

Les auteurs ont utilisé des ARNs synthétiques ou des transcrits en épingle à cheveu de séquences ADN sous la commande de l'ARN polymérase III. Ces siRNAs (Small interfering RNAs) ou shRNAs (small hairpin RNAs) peuvent réprimer l'expression de transgènes sans activer, non spécifiquement, les protéines kinases dépendant de la présence d'ARNs doubles brins. Ils les ont utilisés contre un gène marqueur, celui de la luciférase) dans le foie de souris et contre le virus de l'hépatite C (une personne sur quarante à l'échelle mondiale).On savait déjà qu'il est possible de dégrader ainsi le virus syncytial respiratoire.

57. Le récepteur de l'hormone thyroïde (TR) est un récepteur nucléaire qui recrute des complexes protéiques permettant de réguler spécifiquement la transcription de certains gènes particuliers par l'hormone thyroïdienne (T3). Il fonctionne comme un hétérodimère avec RXR (Retinoid X Receptor) et ne recrute les complexes co-activateurs qu'en présence de T3, alors qu'il recrute les complexes co-répresseurs en son absence. Les co-activateurs de la famille des SRCs (p160/steroid receptor coactivators) se lient directement au ligand. On pense que ces protéines agissent en liaison avec de puissantes histones-acétyltransférases (HATs) comme CRBP (p300/CREB Binding Protein) et ciblent l'activité HAT vers les TRs liés au promoteur, avec acétylation des histones dans le nucléosome à ce niveau. Certains membres de la famille possèdent même une activité HAT intrinsèque.

Il existe un autre type de co-activateurs avec le complexe TRAP/Mediator (TRAP pour TR-associated protein). Il semble intervenir en se liant au complexe du récepteur et de son ligand par une de ses sous-unités, TRAP220. Ce complexe fonctionne en stimulant la transcription de base des gènes cibles, probablement en facilitant la fixation de l'ARN polymérase II, par analogie avec ce qui se passe chez la levure avec Mediator.

On vient de montrer qu'il existe un ordre temporel dans ces recrutements. TR se fixe sur le promoteur en l'absence du ligand T3. Après addition de T3, il y a rapidement recrutement des SRC (SRC-1, GRIP-1), de p300, avec une acétylation des histones au niveau des promoteurs. Le recrutement du complexe TRAP/Mediator a lieu plus tard et nécessite l'acétylation des histones , mais est accéléré en l'absence d'une activité histone désacétylase. Les trois groupes de co-activateurs sont indispensables (les deux analysés plus p300). D Sharma et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (11JUN02) 7934-7939.

58. Les protéines Tcf (T-cell factor) et Lef (Lymphoid enhancer factor) comprennent Tcf1, Lef1, Tcf3 et Tcf4 chez les mammifères et sont des facteurs de transcription. On constate la présence de nombreuses isoformes des Tcfs liées à des promoteurs et épissages alternatifs. Les Tcfs se lient  à l'ADN, sous forme de monomères, à une séquence consensus AGATCAAAGGG via leur HMG box (High Mobility Group) de 80 aa.. Comme les autres facteurs de transcription à HMG box, ils sont capables d'induire des courbures dans l'ADN, permettant ainsi la fixation de complexes protéiques de grande taille.  Et pourtant ces protéines ne sont pas capables par elles-mêmes de moduler la transcription. Elles servent plutôt à recruter d'autres protéines qui s'en chargent. Une revue porte sur ces co-facteurs de transcription. A Hurlstone et al.; The EMBO Journal 21, n°11 (15MAY02) 2303-2311.

Ils jouent un rôle très large, notamment au cours du développement avec l'établissement du plan de l'organisme. Plus tard ils régulent la survie, la prolifération et la différenciation dans les tissus soumis à renouvellement, comme la peau, la muqueuse intestinale et les lymphocytes. Une particularité curieuse de ces facteurs est d'être capables de stimuler simultanément un mécanisme dans un groupe de cellules, et de l'inhiber dans un autre, en agissant sur l'expression d'un même gène.

La reproduction

59. En eau douce, la spermatogenèse de l'anguille japonaise (Anguilla japonica, mais cela doit être vrai pour les autres) est arrêtée avant la prolifération des spermatogonies. Elle peut être relancée par une injection de gonadotropine chorionique. Ceci indique qu'une substance inhibitrice est présente. C'est la eSRS21(eel Spermatogenesis Related Substances 21). La protéine correspondante ressemble à la "Mullerian-inhibiting substance". Elle est exprimée dans les cellules de Sertoli et cette expression est supprimée par la gonadotropine chorionique, mais elle l'est également par la 11-cétotestostérone. T Miura et al.; Development 129 (01JUN02) 2689-2697.

60. Lors de la spermiogenèse (phase finale de la différenciation des spermatozoïdes) les histones sont souvent remplacées, chez les Vertébrés, par des protamines. On a longtemps pensé que cela était provoqué par une hyperacétylation de l'histone H4, mais on ne connaissait pas l'acétyltransférase correspondante. Cette transition histone vers protamine est gouvernée par le produit du gène cdy1. L'homologue humain est porté par le chromosome Y, tandis que celui de la souris est sur un autosome. BT Lahn et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8707-8712.

61. Les spermatozoïdes de la souris sauvage Apodemus sylvaticus coopèrent dans la course vers l'ovocyte à féconder. Il se forme un véritable train de centaines de milliers de spermatozoïdes qui se disloque par rupture des acrosomes de la plupart des wagons au contact de l'ovocyte. (H Moore et al.; Nature 418 (11JUL02) 174–177). Le train va deux fois plus vite qu'un spermatozoïde isolé. Les souris mâles de cette espèce sont des compétiteurs remarquables dans la reproduction et se dépensent sans compter. .

On sait, par ailleurs, que la pièce intermédiaire du spermatozoïde des primates, le reste de cytoplasme où se logent les mitochondries très modifiées, possède une taille proportionnelle à l'activité des spermatozoïdes et celle de leurs dispensateurs. Vérifié chez les chimpanzés. (MJ Anderson et al.; Nature 416 (04APR02) 496).

Le développement

62. Les cellules souches provenant d'adultes sont une alternative aux cellules embryonnaires pour la régénération de certains tissus. Mais la controverse n'est pas prête de se terminer sur leur valeur réelle et sur les mérites comparés des cellules souches embryonnaires et des cellules souches adultes. Elle sous-tend, en effet, les querelles éthiques sur l'utilisation de cellules embryonnaires humaines

Deux articles viennent alimenter le débat: Y Jiang et al.; Nature 418 (04JUL02) 41-49 et JH Kim et al.; p. 50-56. Ils sont commentés dans SH Orkin et al.; p.25-27.

Des cellules souches possèdent deux propriétés essentielles: elles se perpétuent sous forme indifférenciée et peuvent se différencier en des cellules spécialisées.

Elles se placent à des stades différents du développement, et peuvent avoir un spectre variable de possibilités. La plus vaste panoplie de possibilités est détenue par les cellules pluripotentes dont font partie les cellules ES (Embryonic Stem cells) provenant du bouton embryonnaire de l'embryon des mammifères.

Les cellules souches prélevées à des stades plus tardifs ont un spectre de différenciations potentielles et une capacité de multiplication plus restreints.

Ainsi les cellules souches hématopoïétiques donnent tous les types de cellules sanguines, mais ne se multiplient que très peu en culture. La possibilité de différenciation plus larges a été évoquée plusieurs fois (ce Bulletin en a fait état, voir, en particulier le Bulletin de Juillet §71), mais il semble que les expériences ont du mal à être reproduites.

Il faut remarquer qu'en dehors des problèmes éthiques dans le cas des cellules humaines qui doivent être prélevées dans de très jeunes embryons, les compatibilités immunologiques vont poser des problèmes pour l'utilisation de ces cellules en thérapie génique, par exemple. Il faudrait donc, soit disposer de batteries de telles lignées, soit les modifier pour minimiser les problèmes.

Un second problème est celui de la formation des tératomes, après transplantation des cellules indifférenciées. Il faut donc faire se différencier les cellules avant de les implanter.

Enfin des cellules qui paraissent différenciées, par exemple en produisant de l'insuline, n'ont pas, pour autant la capacité physiologique attendue, comme de corriger le taux de sucre dans le sang après implantation. Il est vraisemblable que de telles cellules sont des sauvageonnes qui n'ont pas été patiemment éduquées lors du développement à la suite des multiples interactions qui s'y déroulent.

L'article de JH Kim montre que l'équipe a réussi à produire des neurones spécifiques à partir de cellules ES et les a utilisées pour supprimer les symptômes d'une maladie de Parkinson chez les rats. Y Jiang et al. ont, d'un autre coté, obtenu des cellules remarquablement versatiles et se multipliant indéfiniment en culture à partir de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de souris, rats et humains et qui peuvent se différencier en des cellules ayant des caractéristiques de mésoderme viscéral, de neurectoderme et d'endoderme  in vitro. .

 JH Kim et al ont, apparemment résolu, dans le cas de la maladie de Parkinson chez le rat, le problème de tératomes. Ils ont, par ailleurs, observé l'absence des effets secondaires redoutables observés chez l'homme dans des conditions comparables. Le nombre de cellules compétentes pour la production de dopamine a été, dans ce cas, augmenté par l'expression de la protéine Nurr1, qui intervient dans la différenciation des neurones du striatum normal.

La publication de Y Jiang et al. indique que l'équipe a commencé avec des cellules non hématopoïétiques de la moelle osseuse, où ils ont sélectionné des cellules qu'ils ont appelées "multipotent adult progenitor cells" (MAPCs). Ils ont introduit ces cellules dans des blastocystes ou intra-veineusement. Dans le second cas, ils obtiennent des cellules sanguines ou épithéliales, dans le premier elles contribuent à beaucoup de tissus. Leur transplantation dans un hôte non irradié donne lieu à la formation de cellules hématopoïétiques en sus des épithéliums du foie, des poumons et du tube digestif.

Il se pourrait que les MAPCs n'apparaissent que tardivement à la suite d'une dédifférenciation. Les cellules ES elles-mêmes n'existent pas dans un embryon, mais apparaissent après un temps de culture des embryons.

63. Lorsque des embryons de bovins sont obtenus après maturation et fécondation in-vitro, la proportion des individus atteignant le stade blastocyste dépend des conditions de culture et de la "qualité" des ovocytes.

La mesure de cette qualité a été analysée par ses conséquences au niveau transcriptionnel au cours de la phase précoce de l'embryogenèse bovine. S Bilodeau-Goeseels et al.; Animal Reproduction Science 71 (17JUN02) 143-155.

Les complexes cumulus-ovocyte complexes (COC) ont été classés en six ensembles basés sur la structure des couches cellulaires du cumulus et la structure de l'ooplasme. Les résultats confirment des résultats antérieurs indiquant que les ovocytes présentant quelques signes d'atrésie (involution) sont de bons candidats à un développement. Il vaut cependant mieux utiliser des ovocytes de grande taille (plus de 115mm). On utilise classiquement des ovocytes à cytoplasme clair, et dont le cumulus contient de nombreuses couches cellulaires.

On pensait que l'activation du génome embryonnaire se situe aux stades 8-16 cellules, mais il semble bien que la transcription commence dès le stade 2 cellules. Les auteurs ont analysé cette transcription entre les stades 2 à 16 cellules.

64. Les mécanismes permettant cette "qualité" sont inconnus. On ne connaît pas plus les raisons de la fragmentation cytoplasmique des embryons bovins obtenus in vitro et cryopréservés, entraînant une survie aléatoire des embryons après implantation. Il semble qu'un rapport élevé des protéines Bcl-2/Bax soit un marqueur fiable de la qualité, et que l'apoptose est la raison de la piètre évolution de certains des ovocytes. Bcl-2 est donc critique lors de la phase préimplantaire. MY Yang et al.; Animal Reproduction Science 70 (15APR02) 159-169.

65. Chez beaucoup d'invertébrés (dont les insectes) la détermination des cellules germinales est automatique, dans la mesure où elle dépend du territoire cytoplasmique de l'œuf où atterrissent les noyaux pendant la segmentation. Il n'y a pas de choix.

Chez les Mammifères, la détermination exclusive des cellules sexuelles et somatiques sous-tend la discussion sur les cellules souches. Sous-entendu, peut-on convertir une cellule somatique en cellules germinale? Comment sont choisies les cellules qui vont donner les cellules germinales primordiales (PGCs).

M Saitou et al.; Nature 418 (18JUL02) 293-300 ont suivi l'activité transcriptionnelle de cellules embryonnaires individuelles, juste au moment où l'on pense que se fait ce choix. Un premier gène intéressant, fragilis, code une protéine membranaire qui pourrait, par analogie avec des protéines voisines, faciliter l'agrégation des cellules l'exprimant. Ceci permettrait de les maintenir ensemble pendant la gastrulation.

Un second gène code potentiellement une protéine liant l'ADN. Il s'agit de Pgc7 (M Sato et al.;  Mechanisms of Development 113 (APR02) 91-94). Pgc7 (alias Stella) n'est pas seulement exprimé dans les PGCs mais également dans l'œuf fécondé dans l'embryon et dans les cellules ES.

L'un des rôles de cette protéine est de maintenir en action les gènes empêchant la différenciation et, probablement, réprimer ceux qui conduisent à une différenciation. .

M Saitou et al. proposent un modèle où les cellules du centre du massif cellulaire, celles qui expriment le plus fragilis, sont celles qui vont donner les PGCs proprement dites et vont exprimer Stella.

Les cellules de la granulosa enveloppent un ovocyte pour donner les follicules primordiaux, qui matureront plus tard en follicules primaires puis secondaires. Les gènes intervenant dans ce processus sont analysés dans la revue de O Epifano et al.; Trends in Endocrinology & Metabolism 13 (JUN02) 169-173.

Les interactions entre ovocytes (cellules germinales) et cellules de la prégranulosa (cellules somatiques, folliculaires) sont essentielles. Elles ont été surtout étudiées chez la souris, qui est l'objet de la revue.

Au jour 6 du développement embryonnaire (E6) des cellules de épiblaste proximal migrent dans le mésoderme extra-embryonnaire. Le premier signal entraînant la détermination des PGCs provient de l'ectoderme extra-embryonnaire. Ce sont des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins, Bmp4 et Bmp8b) auxquels des cellules de l'épiblaste embryonnaire répondent en donnant des précurseurs des cellules du mésoderme extra-embryonnaire et des cellules germinales primordiales. Un second signal permet la détermination germinale chez quelques unes de ces cellules (40 à 50) qui vont exprimer le marqueur Tnap (codant une phosphatase alcaline), les autres donnant le mésoderme extra-embryonnaire.

BMP4 agit au cours de cette première phase, tandis que la synergie de BMP4 et BMP8b permet de fixer définitivement le sort germinal.

A E7,5-E8,0, on voit l'expression du facteur OCT4 se restreindre aux seules cellules germinales. Ces cellules migrent ensemble, avec des connexions intercellulaires, vers les crêtes urogénitales, vers E10-E11, et se multiplient donnant 6 000 à 25 000 ovogonies selon les souches et entrent en méiose à E13,5, pour s'arrêter au diplotène. On a caractérisé plusieurs gènes dont l'expression est indispensable au déroulement de cette phase de la méiose comme Msh4/5, Dcm1, Atm et Spo11.

Le lancement de la méiose est asynchrone dans les diverses cellules germinales et semble être une décision au niveau de la cellule.

Les cellules somatiques associées, granulosa et thèque (cellules produisant les stéroïdes) évoluent parallèlement. A E10, l'expression des gènes Wt-1 (Wilms tumor-1) codant un facteur de transcription et Sf1 (Steroidogenic factor-1) codant un récepteur hormonal nucléaire jouent un rôle décisif à ce stade. Les crêtes génitales se forment, mais dégénèrent aussitôt chez leurs mutants.  Les cellules de la granulosa, sont des parentes des cellules de Sertoli du testicule.

Le sexe est déterminé par l'expression du gène Sry du chromosome Y dans les précurseurs des cellules de Sertoli, vers E10,5. En son absence, le développement est, on le sait, femelle par défaut.

On a montré que Sox9 (un facteur de transcription) et Fgf9 (Fibroblast Growth Factor 9) jouent un rôle dans la détermination du sexe. Tous deux interviennent en aval de Sry, mais comment ?

Un gène comme Dax1 s'oppose à Sry, tandis que Wnt4 est nécessaire au maintien de la différenciation femelle et à la suppression de la différenciation des cellules de Leydig.

La formation des follicules primordiaux dépend donc de Wnt4, qui est exprimé dans les cellules somatique, mais aussi de Figa (Factor in germline a) qui est exprimé dans les ovocytes. Avant cette différenciation, les cellules germinales femelles forment des syncytia avec des ponts intercellulaires qui se résolvent juste avant la différenciation. C'est la période de déclenchement de l'apoptose massive des ovocytes. On comprend d'ailleurs pas bien le rôle de cette disparition massive. Ce que l'on sait c'est que des cellules somatiques se glissent entre les ponts intercellulaires au sein des syncytia, comme cela a été montré chez la brebis. Il est vraisemblable que les cellules de la pré-granulosa jouent un rôle dans la disruption des syncytia.

L'ovocyte est indispensable à la différenciation des follicules (voir le Bulletin d'Avril §67). En son absence, on observe une différenciation mâle. La protéine FIGa  est l'acteur dans ce cas.

Une autre interaction a été détectée avec le récepteur KIT à tyrosine kinase des ovocytes et son ligand KIT-L (L pour ligand) produit par la granulosa.. On a formation de follicules primordiaux en son absence, mais cela ne va pas au-delà.

La formation de la zone pellucide est un marqueur de la croissance du follicule. L'ovocyte est alors séparé des cellules somatiques par cette couche acellulaire. Néanmoins des ponts existent entre l'ovocyte et les cellules de la granulosa avec une "gap junction" au contact des deux types cellulaires. Ces ponts sont indispensables au développement du follicule.

66. Chez le mouton, des chercheurs néo-zélandais ont également étudié la formation des follicules primordiaux, sous ses aspects endocriniens. Au 38° jour de la gestation, on  distingue cinq catégories cellulaires : l'épithélium de surface de l'ovaire, les cellules endothéliales qui vont amorcer la vascularisation de l'ovaire, les cellules stromales ou mésenchymateuses, la pré-granulosa et les cellules germinales. L'épithélium de surface très important jusqu'au 30° jour; se simplifie ensuite pour reprendre sa croissance jusqu'au 90° jour. La formation des follicules est terminée au 100° jour. pendant cette évolution, de nombreuses cellules (somatiques) du mésonéphros migrent en masse, jusqu'à la régression de ce rein intermédiaire, dans l'ovaire, apparemment en suivant la vascularisation naissante. On ne connaît pas les fonctions de telles cellules.

Les cellules de la pré-granulosa se distingue des autres cellules somatiques car elles sont en contact avec les ovogonies et les cellules mésenchymateuses. Entre les jours 38 et 45, les complexes prégranulosa-ovogonies s'organisent en cordons ovigères que les cellules de la pré-granulosa enveloppent. Ceux-ci isolent les ovocytes du reste, et notamment des vaisseaux sanguins. Cette structure persiste jusqu'au 75° jour, moment auquel apparaissent les follicules primordiaux qui émergent des cordons disloqués. C'est également à ce moment que commence l'apoptose des ovocytes qui sont détruits à plus de 75% le 90° jour. La majorité des cellules de la granulosa des follicules dérivent de cellules mésothéliales provenant de l'épithélium de surface de l'ovaire.

On peut détecter les premiers signes d'une stéroïdogenèse vers le 32°jour et le pic de production est atteint 10 à 15 jours plus tard, un peu avant le début de la méiose Le suivi de l'expression des gènes impliqués dans la stéroïdogenèse indique que les hormones stéroïdes jouent un rôle  à la fois autocrines (sur la cellule productrice) et paracrine (sur les cellules voisines). Les œstrogènes sont les stéroïdes dominants dans cette production. Si on essaye de déterminer l'origine de ces stéroïdes, on constate que les messagers correspondants sont localisés, au pic de production, à l'interface entre la medulla et le cortex de l'ovaire. Quelques ovocytes et les cellules de la prégranulosa sont actifs à ce stade. Après le début de la méiose (55° jour) cette production se limite à des paquets de cellules de la médulla de l'ovaire.

La réponse à ces stéroïdes est difficile à localiser. Avant le 55° jour, seul le récepteur ERb est détectable, et sa localisation se superpose avec celle de la production des stéroïdes, c'est-à-dire à l'interface entre la medulla et le cortex de l'ovaire. Le messager d'ERa apparaît à partir du 55° jour dans l'épithélium de surface et dans les cellules se joignant aux cordons ovigères. Celui  d'ERb apparaît dans les cellules stromales de la medulla.

 Au 55° jour les cellules germinales les plus proches de la medulla cessent de se diviser et amorcent la méiose, au moment où la production des stéroïdes chute brutalement à la fois à l'échelle individuelle de la cellule, comme du nombre des cellules productrices. Ces cellules productrices restent en dehors du courant principal des cordons ovigères (auxquels elles sont cependant associées,) et ne contribuent donc pas à la granulosa. Elles donneront plus vraisemblablement les cellules de la thèque, dont on sait qu'elles sont stéroïdogènes. Il est donc fortement suggéré que le rôle des stéroïdes est probablement de réguler la maturation des ovocytes, mais également à la vascularisation.

67. Armadillo, après formation d'un complexe avec une protéine appelée TCF (alias Pangolin chez la drosophile), active les gènes possédant une séquence particulière reconnaissant TCF dans leur région régulatrice. Mais TCF peut également avoir des effets répresseurs. Il le doit à une interaction avec la protéine Groucho (appelée TLE chez les vertébrés). Une nouvelle protéine intervenant à ce niveau, appelée Pygopus, vient d'être caractérisée. Pygopus agit en aval d'Armadillo lors du transfert nucléaire. C'est vraisemblablement un facteur de remodelage de la chromatine agissant au niveau de TCF. DS Parker et al.; Development 129 (01JUN02) 2565-2576.

68. Un nouveau gène Wnt du poulet, Wnt6, vient d'être caractérisé. Il code une protéine qui a les caractéristiques d'un déterminant épidermique. Il est actif dans la formation des épithéliums à la limite de la plaque neurale et l'ectoderme de surface, dans le plafond de plusieurs parties de l'encéphale, le cœur en cours de différenciation et la vésicule otique. On observe une co-localisation d'une cascade BMPs de signalisation. Il a été dénommé Wnt6 par homologie avec le gène correspondant de la souris. FR Schubert et al.; Mechanisms of Development 114 (JUN02) 143-148.

69. Sry est supposé déclencher la cascade des signaux aboutissant à l'organogenèse somatique des testicules, avec la différenciation des cellules myoïdes péritubulaires, les cellules de Sertoli et les cellules endocrines de Leydig. Ces dernières sont importantes dans la mesure où elles sont indispensables à la masculinisation de l'embryon des mammifères.

L'expression de Sry dans les cellules somatiques des gonades entraîne la différenciation des cellules de Sertoli. La différenciation des cellules myoïdes péritubulaires et la formation subséquente des cordons testiculaires sont régulés par la protéine Desert hedgehog (DHH) produite par les cellules de Sertoli. Il semble cependant qu'il existe deux populations successives et indépendantes de cellules de Leydig : les cellules fœtales et les cellules adultes. Les premières seraient responsables de la masculinisation initiale et les secondes de l'entretien des fonctions testiculaires.

Les cellules de Leydig fœtales sont identifiables dans le tissu interstitiel des gonades où elles expriment déjà les enzymes de la stéroïdogenèse. Les secondes dériveraient des cellules du mésenchyme péritubulaire. Les deux types pourraient dériver, soit du mésonéphros (rein transitoire), soit de la paroi du cœlome.

Le signal gouvernant la différenciation des cellules fœtales est inconnu. On sait tout juste que Wnt4 est un signal inhibiteur. On vient de montrer que Desert Hedgehog (DHH) et son récepteur Patched 1 (PTCH1) sont des responsables de cette différenciation. L'absence de différenciation des cellules de Leydig dans des gonades XY (mâles) de souris DHH-/- ne résulte pas d'une absence de migration des cellules à partir du mésonéphros. La signalisation DHH/PTCH1 n'est pas impliquée dans la prolifération et la survie des précurseurs des cellules de Leydig. Cette voie déclenche bien la différenciation de ces cellules en stimulant l'expression de Sf1 (Steroidogenic Factor 1) et Scc (P450 Side Chain Cleavage) impliqués dans la production des hormones stéroïdes dans les cellules exhibant le récepteur PTCH1. HHC Yao et al.; Genes & Development 16 (01JUN02) 1433-1440.

La Physiologie

70. Le récepteur de l'hormone lutéinisante/choriogonadotropine (LH/CG-R) intervient dans la régulation de l'ovulation, la formation du corps jaune et la survie fœtale. La fixation d'un agoniste sur ce récepteur est très peu réversible, ce qui devrait entraîner une stimulation persistante. Il doit, cependant, exister un mécanisme pour atténuer cette stimulation. Les arrestines sont capables de limiter la persistance du signal en désensibilisant le récepteur au bout d'un certain temps. C'est le rôle de l'arrestine 2.

ARF6 (ADP Ribosylation Factor 6) est une abondante protéine membranaire. C'est elle qui intervient dans le cas du LH/CG R. Elle est activée par le LH/CG-R, mais régule, à son tour, la disponibilité de l'arrestine 2 qui va désensibiliser le récepteur dans les membranes folliculaires. Elle existe sous deux formes alternatives (comme les GPCRs), activée quand elle est liée au GTP, et inactive quand elle l'est au GDP.

Sous la forme ARF6GDP l'arrestine 2 est associée à ARF6, de sorte que l'arrestine ne peut entrer en fonction et inhiber le signal du récepteur. Sous sa forme active,  ARF6GTP. L'arrestine 2 est libérée de ARF6 et se fixe spécifiquement sur la troisième boucle intracellulaire du LH/CG-R activé et le "désensibiliser". La désensibilisation est un découplage du GPCR de sa protéine G entraînant une interruption dans la transmission du signal. On estime que ce découplage est entraîné par une phosphorylation du GPCR par une GRK (G protein Regulated Kinase) qui entraîne le recrutement d'une arrestine qui se lie au récepteur phosphorylé avec une haute affinité. Elle va alors empêcher stériquement l'interaction entre récepteur et G-protéine. Il est vraisemblable qu'ARF6 intervient pour d'autres récepteurs de ce type. Hunzicker-Dunn et al.; FEBS Letters 521 (19JUN02) 3-8.

71. Les TGF-b1, b2 et b3 modulent classiquement l'activité des chondrocytes du cartilage de conjugaison des os via la voie Smads, mais également et comme on vient de le montrer, par plusieurs voies convergentes, notamment celle des prostanoïdes, pour TGF-b1 (E Rosado et al.; Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research 1590 (12JUN02) 1-15.

TGF-ß1 agit sur les récepteurs type II des TGFb. Ce récepteur, après avoir fixé TGF-ß1, s'associe et active le récepteur de type I. Les Smads 2 et 3 sont, alors, phosphorylées et transportées dans le noyau où elles jouent leur rôle de facteurs de transcription. La voie Smads active la protéine kinase C (PKC). La protéine kinase PKA active la réponse physiologique via la régulation, par PKA, du signal PKC cytosolique.

Mais les TGFb stimulent également la phospholipase PLA2 et la libération de prostaglandines via l'intervention de la cyclooxygénase Cox-1 sur l'acide arachidonique. La prostaglandine E2 active le récepteur des prostaglandines EP2, provoquant l'activation de la protéine kinase PKA G-protéines dépendante. C'est l'intervention de la PKA qui stimule l'activité de PKC.

72. L'approche classique des interactions en signaux extra-cellulaires et récepteurs a, le plus souvent, considéré la membrane comme un simple support du ou des récepteurs et co-récepteurs. Déjà, la coalescence des complexes récepteurs, l'existence de sites privilégiés de la membrane (radeaux lipidiques par exemple) a amorcé une étude plus fine du rôle de la membrane. Une revue fait, cette fois le point sur le rôle de l'endocytose dans la réception et la transmission des signaux au cours du développement. ES Seto et al.; Genes & Development 16 (01JUN02) 1314-1336. On y trouvera une rapide analyse de l'endocytose.

On concevait traditionnellement l'endocytose comme un moyen de soustraire des récepteurs à leurs agonistes, et donc de limiter la réponse de la cellule. En réalité, l'endocytose peut jouer des rôles plus subtils et variés. C'est ainsi que l'endocytose de complexes récepteur/tyrosine kinase peut renforcer la réception du signal en les rapprochant de transmetteurs de signaux endosomiques, tout en régulant négativement la réponse en envoyant le récepteur vers les lysosomes.

L'endocytose peut, également, distribuer les molécules signal. Ainsi dans le cas de Wingless et des TGF-ß)/Decapentaplegic (DPP), on observerait une endocytose particulière avec la transcytose qui permettrait la formation d'un gradient de Wg en recyclant ou en détruisant le morphogène. Enfin l'internalisation est parfois nécessaire à l'activation du récepteur, comme c'est le cas pour Notch.

73. On trouvera dans AE Drummond et al.; Molecular & Cellular Endocrinology 191 (31MAY02) 27-33, une revue sur les récepteurs des stéroïdes dans l'ovaire, et leur rôle dans le fonctionnement de cet organe.

On ne connaît même pas, avec certitude, le rôle précis de l'œstrogène dans l'ovaire. Cette hormone intervient, comme on le sait, grâce à deux récepteurs spécifiques ERa et ERb, tous deux présents dans l'ovaire, ERb étant le plus abondant, et exprimé dans les cellules de la granulosa.

On ne sait cependant pas quels sont les rôles respectifs de ces deux sous-types, bien qu'on ait pu démontrer par des expériences de "knock-out", que les deux sont nécessaires. Les souris sans aromatase (qui intervient dans la dernière étape de la synthèse du 17 b œstradiol) sont stériles du fait d'un arrêt de la folliculogenèse au stade antral. Elles ne sont cependant pas complètement dépourvues d'œstrogènes, et il faut se rappeler qu'un troisième type d'ER a été détecté chez les poissons, avec ERg.

Les récepteurs de la progestérone ont également deux formes, PR-A et PR-B codées par un même gène. PR-A et PR-B sont présents dans les cellules de la granulosa préovulatoires et lutéinisantes. On ne sait pas si ces deux formes ont des rôles différents, bien que certains résultats puissent indiquer un rôle répresseur dominant de PR-A sur PR-B. L'expression de ce gène est stimulée par  l'œstrogène dans la plupart des tissus et réprimée par la progestérone. Dans les follicules matures pré-ovulatoires la LH (hormone lutéinisante) induit l'expression des gènes des PR dans la granulosa. Les PRs sont indispensables à l'ovulation, d'une part, et à la formation du corps jaune, de l'autre.

Les cellules de la thèque produisent les androgènes, surtout la testostérone, sous stimulation par la LH. Leurs cibles sont les cellules de la granulosa. Les récepteurs (ARs) déclenchent trois mécanismes alternatifs suivant le stade de la folliculogenèse. Aux débuts, les androgènes provoquent la différenciation de la granulosa sous l'action de la FSH (Follicle Stimulating Hormone) en amplifiant le signal cAMP, en aval du récepteur. Durant la phase préovulatoire tardive, les récepteurs disparaissent progressivement. Les androgènes sont, alors, métabolisés au lieu d'être utilisé comme signaux. Ce sont alors des précurseurs de la synthèse des œstrogènes.

On sait qu'en l'absence de ces récepteurs, on a un vieillissement accéléré de l'ovaire.

74. TRAF6 (TNF Receptor-Associated Factor 6, avec TNF pour Tumour-necrosis factor) est le seul membre de cette famille à intervenir dans la transduction du signal, à la fois, des récepteurs du  TNF (TNFRs) et du récepteur classique IL-1R/TLR (interleukin-1 receptor/Toll-Like receptor) qui interviennent dans l'immunité innée et adaptative, ainsi que dans l'homéostasie des os.

Le structure cristalline de TRAF6, seul ou associé aux récepteurs CD40 (des cellules dendritiques) ou TRANCE-R (alias  RANK important dans l'ostéogenèse), vient d'être établie et permet de commencer à comprendre comment TRAF6 est capable d'initier plusieurs cascades différentes de signaux. On observe, par exemple, que l'une des liaisons peptidiques présente un angle 40° dans TRAF6 par rapport à TRAF2. C'est le domaine C de la protéine qui lui confère ses propriétés originales. Des peptides transportables dans la cellule et possédant le motif de liaison de TRAF6 inhibent son fonctionnement.

Une mutation Asn237Asp dans le peptide CD40 augmente l'affinité de TRAF6. En effet on attend une faible affinité de TRAF6 pour son récepteur monomérique, car le recrutement de TRAF est induit par une oligomérisation de son récepteur et d'une protéine adaptatrice. H Ye et al.; Nature 418 (25JUL02) 443-447.

Le système immunitaire

75. Le numéro de Juin de Current Opinion in Immunology  est consacré à l'activation des lymphocytes.

Trois revues sont tournées vers la reconnaissance initiale de la cible par ces cellules, et notamment les évènements se déroulant à la surface, la synapse immunologique.

PA van der Merwe; p.293–298 analyse la synapse proprement dite avec une attention particulière pour ses fonctions. On a découvert cette synapse il y a 5 ans à l'interface entre cellules CD4 et les cellules présentatrices des antigènes. On a, depuis, généralisé cette observation aux cellules CD8 et NK (Natural killers), ce qui indique que c'est un mécanisme général d'activation des lymphocytes. Mais on ne connaît pas bien sa signification et des controverses se sont manifestées à ce propos. Au passage lisez au moins le commentaire de JD Yewdell et al.; Nature 418 (29AUG02) 923-924 sur un de deux articles passionnants du même numéro que je reprendrai en Octobre: M Boes et al.; Nature 418 (29AUG02) 983-988, sur la cinétique visualisée d'une partie du dialogue entre une cellule dendritique et les cellules T au niveau de la synapse.

G Werlen et al.; p.299–305 s'intéressent au signal transmis par le complexe récepteur des cellules T (TCRs ou signalosome pour rester à la mode), leurs rapports avec les radeaux lipidiques et l'amplification du signal grâce à ces structures associées. La reconnaissance des antigènes provenant des pathogènes présentés en association avec les molécules MHC est réalisée par les TCRs.

Un récepteur TCRab est un hétérodimère clonal ab associé de façon non-covalente à une chaîne invariante multimérique CD3. Ce complexe comprend des hétérodimères CD3ed un hétérodimère CD3eg et un homodimère CD3zz. les composants invariants de CD3 régulent l'expression à la surface des chaînes TCRab et la transduction des signaux déclenchés par la liaison du MHC+antigène aux domaines variables du récepteur. Les TCRab possèdent de courtes queues cytoplasmiques dépourvues de domaine permettant une transmission du signal. C'est CD3 qui permet cette transmission. La formation du complexe TCR est amorcée par l'occupation du récepteur proprement dit, puis s'étoffe par recrutement. Cette convergence de deux types de recrutements "verticaux" pour les protéines cytosoliques et "horizontaux" dans les radeaux lipidiques contribue à la formation de signalosomes spécialisés entraînant une réponse spécifique. E Vivier et al.; p.306–311 étudient les découvertes récentes dans la reconnaissance des cibles par les cellules NK dans le système immun inné et adaptatif. NKG2D est un récepteur activateur de surface exprimé dans un grand nombre de types cellulaires effecteurs du système immunitaire, dont les cellules NK, les cellules NKT (utilisant un répertoire TCRab,, comme les cellules T, mais restreint et reconnaissant les glycolipides en association avec CD1d, mais porteuses de marqueurs des cellules NK), les cellules Tgd et CD8+. Les ligands de NKG2D comme les MICA, MICB et ULBP humains ou Rae1 et H60 murins sont induits par les stress cellulaires. Chez les cellules T NKG2D est un co-stimulateur du TCR, alors que chez les cellules NK, c'est, apparemment, une structure de reconnaissance primaire

Cinq revues traitent des voies de signalisation intracellulaires. WR Burack  et al.; p.312–316), font le tour des squelettes (scaffolds), adaptateurs et "linkers" dans ces voies, notions auxquelles on pourra se familiariser à la lecture de cette revue. Quatre protéines non enzymatiques du cœur du TCR relient l'activation du récepteur par son antigène spécifique à la voie aval de signalisation intracellulaire. Trois de ces protéines contribuent au squelette du complexe (LAT, SLP-76 et SLAP-130 alias Fyb ou ADAP) tandis que la quatrième est un adaptateur (GADS). On a disséqué les interactions par des expériences systématiques de knock-out et reconstitution.

 EK Griffiths  et al.; p.317–322 se concentrent sur la molécule adaptatrice Fyb avec le rôle des intégrines. L'adhésion grâce aux intégrines faisant suite à la stimulation du TCR stabilise l'interaction entre cellules T cellules présentatrices de l'antigène reconnu et facilité l'activation de la cellule T. Ce qui n'est pas connu est la communication entre intégrines et TCR. Il y a certes réorganisation du cytosquelette et SLAP-130/Fyb/ADAP accroît l'affinité des intégrines. C'est d'ailleurs un mécanisme plus général dans la transduction d'autres signaux par les intégrines. Fyb est un adaptateur donc une protéine multifonctionnelle. Elle interagit avec de très nombreuses protéines dont le complexe Arp2/3.

CW Arendt et al.; p.323–330) traitent des fonctions de la protéine kinase C-q, dans le cadre de la synapse immunitaire, qui pourraient varier selon le stade de développement. Des cellules sans cette kinase n'activent pas NF-kB et AP-1 (voir le §) et n'expriment pas la cytokine caractéristique IL-2.

AT Miller et al.; p.331–340 s'intéressent aux tyrosine-kinases de la famille Tec. L'analyse de nombreux mutants indique que ces kinases ont un rôle distinct de celui des kinases de type Src. Elles interviennent en aval des récepteurs des antigènes comme TCRs, BCRs (récepteurs des cellules B) et Fce. On pu montrer qu'elles interviennent sur le développement, la différenciation et l'apoptose des lymphocytes.

Toutes ces revues sont essentiellement consacrées aux cellules T. Je rappelle que les cellules T cytotoxiques (CTLs) exprimant CD8 reconnaissent les MHC I et détruisent directement les cellules infectées ainsi désignées, tandis que les cellules Th (T helpers exprimant CD4) interviennent indirectement, après avoir reconnu les MHCII et en activant les lymphocytes B producteurs d'anticorps circulants et les macrophages qui détruisent les bactéries.

T Kurosaki ; p.341–347 s'intéresse, lui, à la transmission des signaux intracellulaires à partir des récepteurs des cellules B (BCR), les comparant avec ceux en aval du TCR. Comme dans les cellules T, la force du signal perçu par les BCRs des cellules B conditionne le développement de ces cellules et donc l'étendue du répertoire immunologique, ainsi que la tolérance. Ceci a été montré en utilisant des mutations dans les gènes des Iga et/ou Igb. Les cellules B utilisent des régulateurs positifs et négatifs pour optimiser le signal. L'auteur s'intéresse aux aspects développementaux  des cellules B conventionnelles (B2) et vers les cellules B1 et les cellules B de la zone marginale. Il discute également des conséquences de la localisation des BCRs dans les radeaux lipidiques.

Trois revues traitent de la régulation de l'homéostase et des fonctions effectrices des cellules T CD8+. RA Tuma et al.; p.348–353 font le tour des avancées récentes dans nos connaissances de l'homéostasie de ces cellules. l'homéostasie des populations de cellules T CD8 (celles qui sont induites par la reconnaissance des MHC-I) est indispensable aux défenses contre les agents infectieux.  Ils insistent sur le rôle des tissus non-lymphoïdes dans la régulation des populations des cellules T "mémoires" par les jeux opposés de la survie entretenue et celui de la mort programmée.

De grands progrès ont été faits ces dernières années dans la connaissance des régulations de populations de cellules naïves, effectrices et mémoires (voir, par exemple, AW Goldrath et al.  Nature 402 (18NOV99) 255-262). On trouvera également dans AL Singer; Science 296 (31MAY02) 1639-1640, une revue sur les régulateurs négatifs et positifs des fonctions des cellules T.

On a eu quelques surprises comme celle de constater que les tissus périphériques contiennent un nombre anormalement élevé de cellules T effectrices/mémoires. Une autre surprise a été que la prolifération des cellules T est déclenchée, même par une très courte exposition à un antigène.

Les cellules T CD8 naïves résident essentiellement dans les organes lymphoïdes, où elles attendent les peptides présentés par d'autres cellules immunitaires. Leurs récepteurs (TCRs) ont appris à les reconnaître avec une forte affinité. La réponse est alors explosive, donnant une très abondante population de cellules effectrices (phase d'expansion). Ensuite 95% des cellules ainsi activées meurent (phase de contraction) et un petit 5% va persister. Il est supposé donner les cellules mémoires  à longue vie spécifiques de l'antigène.

Un des problème à résoudre est celui de trouver des marqueurs utilisables de ces cellules mémoires (voir à ce sujet CR Mackay; Nature 401 (14OCT99) 659-660).

Le maintien de ces cellules T périphérique dépend beaucoup de cytokines comme IL-7. L'utilisation de souris dont la production d'IL-7 et de son récepteur IL-7R montre que les cellules naïves, comme les cellules mémoires ont besoin d'IL-7 pour une prolifération contrôlée.

DA Hildeman et al.; p.354–359 s'intéresse aux aspects intracellulaires du pilotage de l'homéostasie des populations de cellules immunitaires. La réponse immunitaire culmine avec l'apoptose, et donc la disparition de la majorité des cellules T activées par un antigène perçu comme importun. C'est, d'ailleurs, une des conditions à une réponse proportionnée à l'agression. On observe deux mécanismes de suppression des cellules devenues inutiles: celui faisant intervenir FasL-Fas induit par l'activation, et celui autonome dans les cellules T activées faisant intervenir la protéine Bcl2-like Bim. Enfin, les adjuvants qui permettent la survie des cellules T pourraient opérer via NF-kB et Bcl-3 plutôt que par les cytokines. On commence, en particulier, à percevoir le rôle des adjuvants dans la survie de ces cellules en jouant sur NF-kB et Bcl3, plutôt que sur les cytokines.

JT Harty et al.; p.360–365 traitent les mécanismes effecteurs spéciaux des réponses des cellules CD8+. L'expansion et la contraction des populations de cellules T CD8+ antigène-specifiques après infection ou vaccination est accompagnée par la formation de cellules "mémoires". Certains effecteurs des cellules cytotoxiques comme perforine et interféron g (et les cytokines de façon plus générale) semblent jouer un rôle dans la régulation des populations des cellules CD8+.  Les CTLs CD8+ tuent leurs cibles par la voie de l'exocytose de granules contenant des protéines cytotoxiques comme la perforine, contrairement aux CTLs (phénotypiquement distincts) CD4-CD8- qui lysent leurs cibles en induisant leur apoptose via la voie FasL-Fas.

L'immunité innée apparaît, par ailleurs et de plus en plus, comme ayant un rôle important dans l'homéostasie des cellules T.

Enfin cinq dernières revues couvrent le domaine des cellules Th (T helpers). JL Grogan et al.; p.366–372 discutent les découvertes récentes dans le domaine du développement de ces cellules CD4+. La "polarisation" des cellules Th (un terme que je trouve malheureux du fait des nombreuses acceptions possibles) entre cellules Th1 et Th2 semble, selon des données récentes, plutôt résulter d'une activation généralisée suivie d'un tri amenant un "silencing", plutôt que d'une activation régulée des gènes de cytokines. La fixation des facteurs de transcription GATA-3 ou T-bet sur des séquences activatrices spécifiques permet le recrutement respectif de facteurs de transcription comme NFAT-1 sur les promoteurs des gènes d'IL-4 ou IFNg. GATA-3 et T-bet se régulent mutuellement et de façon négative. L'inhibition de la transcription de GATA-3/T-bet, qui est modulée par des cytokines, est associée à une fixation définitive du type Th1 ou –2 (polarisation). Les premières divisions laissent les cellules Th dans leur état naïf pluripotentes, mais au-delà, elles se fixent en réponse à leur environnement.

M Colonna et al.; p.373–379) s'intéressent à une population de cellules humaines, mais également révélées chez la souris (cellules plasmacytoïdes observées dans les ganglions lymphatiques lors d'une infection par les virus) qui constituent une faible fraction des leucocytes secrétant à très haut niveau des interférons de type I (IFN-a et b). Elles jouent un rôle dans l'immunité innée et dans la modulation de la réponse des cellules T.

GM Barton et al.; p.380–383 traitent des récepteurs Toll-like de l'immunité innée. Le lien direct entre ces récepteurs, et le développement en cellules Th1 des cellules T CD4+, est maintenant relativement bien établi. L'analyse de l'activation des cellules dendritiques dans ce cadre grâce aux récepteurs Toll indique que ces récepteurs peuvent avoir un effet sur la réponse immunitaire adaptative. Les récepteurs Toll-like doivent uniquement réguler la réponse des Th1. Un autre mécanisme est concerné dans le cas des Th2.

L Liang et al.; p.384–390 traitent des régulateurs ICOS et B7h qui sont des ligands co-stimulateurs tardifs de la réponse immunitaire. Ainsi ICOS (Inducible CO-Stimulatory molecule) est exprimée, les cellules T une fois activées 24 heures après la stimulation du récepteur.

RJ Greenwald et al.; p.391–396 analysent les progrès dans le domaine des co-récepteurs répresseurs avec le rôle de molécules comme PD-1 avec son ligand. Cette voie peut déprimer les signaux issus des TCRs et du récepteur CD28. C'est également le cas le cas pour le couple ligand-récepteur B7-CD28 (B7-1 et –2 sont un autre nom de CD80, si je ne me trompe pas).Les données structurales sur CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4) qui gouverne la prolifération des cellules T périphériques ont permis de comprendre son rôle inhibiteur. Dans le cas d'ICOS, on constate des effets différents sur les cellules T (y compris stimulateurs) aux différentes phases de la réponse immunitaire.

76. Les macrophages circulant dans l'organisme sont également des croque-morts pour les cellules de leur propre organisme. Le problème, pour eux, est de reconnaître une cellule bien fraîche, d'une autre sur le déclin. S Brown et al.; Nature 418 (11JUL02) 200-203 apportent une réponse. La reconnaissance entre macrophage et cellule se fait via leur protéine CD31.

Quand la cellule est bien vivante, un signal, probablement une phosphorylation d'une tyrosine dans la queue cytoplasmique de CD31 (alias Platelet-Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 ou PECAM-1) de la cellule vérifiée, et une interaction subséquente avec les protéines SHP-1 et SHP-2 (pour SRC Homology containing protein tyrosine Phosphatase-1 et -2) écarte le macrophage. Au contact d'une cellule inactive et donc potentiellement morte, ce signal n'est pas émis, l'interaction se prolonge et la phagocytose peut alors se déclencher à la suite de la reconnaissance de marqueurs particuliers des cellules mortes. C'est donc une régulation négative qui protège les cellules vivantes. Ce processus est associé à l'apoptose qui marque la cellule à éliminer avec des phosphatidylsérines migrant du feuillet intérieur de la membrane vers le feuillet extérieur. Il est, par ailleurs, vraisemblable que d'autres molécules "intérieures" sont également déplacées vers la surface. De plus et chez Caenorhabditis, les macrophages sentent très tôt qu'une cellule est mal en point. Voir le commentaire et le schéma de G Chimini; p.139-141.

 77. La translocation des cellules à travers l'endothélium des capillaires comporte plusieurs étapes. Les sélectines E, P et L permettent l'adhésion des leucocytes à l'endothélium, ce qui les freine puis les immobilise à la face interne du vaisseau à la suite d'une interaction entre les intégrines du leucocyte et des récepteurs immunoglobuline-like comme VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1). La translocation dépend de chimiokines qui modulent l'avidité des intégrines des leucocytes. Une kinase de sérine thréonine de 59 kDa, ILK (Integrin-Linked Kinase), qui interagit principalement avec les ß1 intégrines, est activée par un facteur appelé MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) en aval de la phosphoinositide 3-kinase. ILK freine l'adhésion cellulaire quand elle est surexprimée. B Erik et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (10MAY02) 16371-16375.

Les Vaccins

78. L'herpesvirus de la maladie de Marek des volailles est un vecteur potentiel pour la construction de vaccins ADN contre divers pathogènes du poulet. Pour l'instant on n'a guère obtenu de protection réelle.

Deux montages basés sur  le virus de la dinde et l'antigène VP2 du virus de l'Infectious Bursal Disease, sous la commande du promoteur du cytomegalovirus humain, tel que ou modifié (et beaucoup plus efficace), ont été réalisé par des chercheurs de Nippon Zeon. K Tsukamoto et al.; Journal of Virology 76, n°11 (JUN02) 5637-5645. La protection est proportionnelle à la production de l'antigène. Le virus cause la destruction de la bourse de Fabricius, l'organe fonctionnellement équivalent, sur le plan immunologique, de la moelle osseuse chez les Oiseaux et entraîne donc une immunodépression. Les vaccins vivants actuels sont efficaces, mais la présence d'anticorps maternels abaisse cette efficacité, et certains vaccins causent une atrophie de la bourse de Fabricius.

79. L'immunité contre Mycobacterium tuberculosis repose sur une activation des réponses de l'immunité cellulaire où l'interféron g joue un grand rôle. Ce sont ces réponses qui limitent l'infection à son point d'entrée, le poumon. Un vaccin à sous-unités porteur de deux protéines immunodominantes de la bactérie associé à l'adjuvant monophosphoryl lipide A (MPL) détoxifié introduit par voie digestive (donc immunisation mucosale) a été comparé à l'immunisation sous-cutanée classique chez la souris. .

Ce n'est pas la méthode la plus efficace pour amorcer la réponse immunitaire (comme souvent) mais cela peut servir de rappel très efficace et protège contre une infection contre les aérosols. TM Doherty et al.; Infection and Immunity 70 (JUN02) 3111-3121.

80. Les ennuis de reproduction des truies liées à des infections par des parvovirus a amené à penser à des vaccins. Un tel vaccin produit à grande échelle dans un système de baculovirus est décrit dans L Maranga et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 59 (JUN02) 45-50.

81. La capside des rotavirus est complexe avec plusieurs couches. Des anticorps contre la glycoprotéine externe VP7 suffisent pour empêcher la décapsidation du virion et donc neutralisent l'infectivité. JE Ludert et al.; Journal of Virology 76, n°13 (JUL02) 6643-6651.

82. De nouvelles nanoparticules cationiques, support d'antigènes vaccinants permettent une vaccination nasale, comme le montrent des chercheurs de Biovector Therapeutics de Toulouse et Rhein Biotech de Düsseldorf. Elles induisent à la fois des IgG (anticorps circulants) des lymphocytes cytotoxiques et des IgA mucosales. Ces nanoparticules ont été essayées avec des protéines marqueurs, mais aussi un vaccin trivalent anti-grippal. A Debin et al.; Vaccine 20 (21JUN02) 2752–2763.

83. On trouvera dans R Gaur et al.; Vaccine 20 (21JUN02) 2836–2839 un article de chercheurs indiens sur une immunisation nasale contre le bacille du charbon.

84. On peut utiliser un morceau du domaine extracellulaire de la toxine diphtérique (Corynebacterium diphtheriae) pour empêcher la toxine complète d'attaquer les cellules humaines. JH Cha et al.; Infection and Immunity 70 (MAY02) 2344-2350. Les auteurs font partie de l'équipe qui a caractérisé le récepteur de la toxine, il y a une dizaine d'années. C'est le précurseur de l'Heparin-binding EGF-like growth factor, qui est une protéine ancrée dans la membrane. La souris n'est pas sensible à la toxine de sorte que les différences avec le récepteur humain ou des cellules de singe Vero (sensibles) ont permis de déterminer des régions qui sont responsables de la reconnaissance. L'équipe a donc songé à utiliser le facteur de croissance comme leurre, en prenant la précaution de désamorcer sa fâcheuse tendance à se révéler tumorigène.  

On pourrait donc s'en servir comme antidote après déclenchement de la maladie plutôt que d'avoir recours au traitement séculaire par des sérums de cheval. Ce n'est cependant pas une technique commercialement viable du fait du coût, et de l'existence d'un vaccin efficace. Mais cette observation va plus loin, car on pourrait songer à en faire de même pour d'autres toxines. Il suffit qu'elles aient des récepteurs à haute affinité. Des chercheurs de  l'University of Wisconsin à Madison et Harvard Medical School font des essais avec la toxine du bacille du charbon. On ne connaît pas la fonction du récepteur dans ce cas, mais on a déjà essayé une forme soluble. Une équipe de l'University of Alberta à Edmonton travaille sur un  antidote de la shigatoxine, d'Escherichia coli O157 qui semble donner de bons résultats chez la souris. Les Centers For Disease Control and Prevention décrivent plusieurs autres cible potentielles sur son site Web. D Holzman; ASM News  (JUN02) 267.

Les Pathogènes

85. On trouve des Nodavirus chez les insectes comme les poissons. Ils ont été regroupés du fait de nombreuses ressemblances morphologiques et génétiques, avec deux ARNs l'un codant la réplicase et l'autre la protéine de capside. Ils sont responsables d'épidémies dans les bancs de plusieurs poissons avec des manifestations nerveuses et une mortalité élevée. En étudiant un des ces virus de Epinephelus malabaricus, le Malabaricus Grouper Nervous Necrosis Virus (MGNNV), des chercheurs ont constaté que contrairement aux virus d'insectes, sa protéine de capside contient deux domaines différents, un peu comme le virus Norwalk (un calicivirus) ou le Tomato Bushy Stunt Virus. On savait déjà que les séquences de la protéine de capside ne présentent pas d'homologies entre les nodavirus de poissons et d'insectes. L Tang et al.; Journal of Virology 76 (JUN02) 6370-6375.

86. La réplication du virus de l'hépatite B du canard entraîne la formation d'ADNs circulaires covalents. Des chercheurs canadiens ont mesuré la demi-vie de ces intermédiaires en bloquant leur formation avec des agents pharmacologiques (lamivudine et didésoxyguanosine). Ces cercles sont particulièrement stables car ils ont une demi-vie de plusieurs dizaines de jours. WR Addison et al.; Journal of Virology 76, n°12 (JUN02) 6356-6363.

87. Lawsonia intracellularis a été identifiée récemment comme la cause d'entéropathies prolifératives. On retrouve cette pathologie chez de nombreux animaux, mais surtout chez le porc. Des colites ulcératives ont été détectées chez l'homme qui pourraient avoir la même cause.

Cette bactérie est une intracellulaire obligatoire voisine de Desulfovibrio et Bilophila wadsworthia. On vient de caractériser un gène codant un antigène périphérique, LsaA (pour Lawsonia surface antigen), associé avec la fixation de la bactérie et sa pénétration dans la cellule cible. C'est la première approche moléculaire de la pathogénicité de cette bactérie. J MvCluskey et al.; Infection and Immunity 70 (JUN02) 2899-2907.

88. Les protéines formant des pores dans les membranes cellulaires eucaryotes font partie d'un arsenal des envahisseurs bactériens. Cette astuce n'est pas sans contrepartie, dans la mesure où la cellule lésée va donner des signaux d'alertes et stimuler les phénomènes d'inflammation qui sont le résultat d'un afflux de défenseurs. La capacité de former des pores permet à ces pathogènes de s'échapper du phagolysosome, mais certains pathogènes s'y trouvent parfaitement bien. Les protéines ont donc des rôles relativement variés qui sont analysés dans une revue. FR Almeida-Campos et al.; Microbes & Infection 4 (JUN02) 741-750.

89. Le dinoflagellé Pfiesteria piscicida est non seulement impliqué dans des maladies de poissons dans le sud-est des Etats-Unis, mais on a observé une pathologie humaine parmi les chercheurs et des pêcheurs en contact avec dees poissons infectés par le protiste. Il semble que ce soit une toxine qui soit en cause, mais sans démonstration. M Swinker et al.; Microbes and Infection 4 (JUN02) 751-762. On trouvera dans cet article une courte mise au point sur tous les dinoflagellés toxiques, avec leurs caractéristiques (dont la répartition géographique et son évolution depuis 1970 et les toxines correspondantes).

90. Bien que les virus de la variole et de la vaccine présentassent des homologies très fortes (ce qui se traduit, en particulier, par l'antigénicité croisée, le tropisme strict de la variole pour l'homme suggère que certaines protéines de la variole sont plus adaptées à cet hôte exclusif, et notamment à contourner ses défenses immunitaires.

Ceci est dû à l'inhibiteur SPICE (SmallPox Inhibitor of Complement Enzymes) du complément. Il est 100 fois plus efficace dans l'inhibition du composant C3b et 6 fois plus  pour C4b du complément que la protéine de la vaccine assurant cette fonction (VCP pour Vaccinia virus Complement control Protein) .SPICE est également plus spécifique que VCP du complément de l'homme. SPICE inhibe la formation des convertases C3/C5 indispensables à la lutte antivirale.

Une substance agissant sur SPICE serait potentiellement utile. AM Rosengard et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8808-8813.

91. Le prion [PSI+] de Saccharomyces cerevisiae est une forme autoréplicative de la protéine Sup35p, mais on peut s'en débarrasser avec un traitement  au chlorure de guanidium qui inhibe la réplication. Ce traitement ne disloque pas les agrégats existants, mais empêche la formation de nouvelles amorces. Si on lève cette inhibition, le nombre d'amorces double toutes les 20 minutes. L'élimination du prion par le traitement résulte d'une inhibition de la chaperone Hsp104, indispensable à la conversion en prion et à la formation des amorces. Au-delà, l'agrégation n'est plus sensible au chlorure de guanidium et Hsp104 n'est plus nécessaire. F Ness et al.; Molecular and Cellular Biology 22, n°15 (AUG02) 5593-5605.

92. Les chercheurs du CNRS à Bordeaux qui avaient montré que l'élément infectieux [Het-s] du champignon filamenteux Podospora anserina est un prion, démontrent que les agrégats amyloïdes de sa protéine sont infectieux. ML Maddelein et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (28MAY02) 7402-7407. Ceci est intéressant comme modèle car on n'a encore jamais pu démontrer directement que la protéine PrPSc est infectieuse dans le cas des prions animaux. 

93. La voie de transport du prion de l'encéphalopathie transmissible du vison a été suivie par des chercheurs du Nebraska. Ils ont inoculé le prion dans le nerf sciatique du hamster.

 PrPSc a été détecté, 3 semaines après, dans la moelle épinière lombaire, puis dans le cerveau à 6 semaines, avec une vitesse de déplacement de 3,3 mm par jour. Il y a donc un transport rétrograde passant à travers les synapses, car il passe de neurones sensitifs à des neurones moteurs. L'absence de  PrPSc dans la rate suggère que le système lymphoréticulaire ne joue, au moins ici, pas de rôle dans la propagation de l'infection d'un nerf. JC Bartz et al.; Journal of Virology 76, n°11 (JUN02) 5759-5768.

94. De nombreuses protéines se liant à PrPC ont été identifiées, mais le rôle de ces interactions dans une fonction quelconque reste à démontrer.

 Doppel (Dpl), est une protéine PrP-like, récemment découverte, qui pourrait être intéressante de ce point de vue. En effet, sa surexpression cause une mort par apoptose dans le cervelet, mort qui peut être prévenue par une surexpression de PrPC . D Westaway et al.; Trends in Biochemical Sciences 27 (JUN02) 301-307. Cette revue traite également des vaccins potentiels contre cette maladie.

95. Un commentaire de TK Atwood; Trends in Biotechnology 20 (JUN02) 235, attire l'attention sur un article de AM Thackray et al.; Biochemical Journal 362 (15FEB02) 253–258, qui se sont penchés sur les métaux à l'état de traces dans le cerveau et d'autres organes chez des souris infectées par la tremblante.

On a attribué à la protéine naturelle PrPC se déformant en prion PrPSc plusieurs fonctions, dont l'une est rôle dans le métabolisme du cuivre. En tout cas, elle lie le cuivre. 

Ils observent des modifications des teneurs en cuivre et en manganèse dans le cerveau, avant l'apparition des symptômes de la maladie. Il y a une réduction de la teneur en cuivre dans le cerveau et des niveaux anormalement élevés dans le sang et le foie. Pour le manganèse, on a une élévation des concentrations dans le cerveau, le sang et les muscles. Le changement dans le cerveau précède juste l'apparition des symptômes L'idée sous-jacente est que PrPC est une protéine anti-oxydante et que le cuivre serait utile, pas le manganèse. L'expression du gène des superoxydes dismutases (SOD) à cuivre/zinc et manganèse, n'est pas modifée mais leur activité l'est lors des symptômes de la maladie. Cette modification serait liée aux changements dans les métaux liés. Si cela se confirme, il y aurait un diagnostic précoce potentiel.

Les Productions Microbiennes

 

96. DOT1 est un gène de Saccharomyces cerevisiae identifié, au départ, comme régulant le "silencing" dans les télomères, loci HM du type sexuel et rDNA. On vient de montrer que la protéine Dot1p méthyle la lysine 79 de l'histone H3 qui est postée au sommet et en bas du cœur du nucléosome et module le "silencing". F van Leeuwen et al.; Cell 109 (14JUN02) 745-756.

F van Leeuwen et al.; Cell 109 (14JUN02) 745-756.

Cette méthylation n'a lieu que quand l'histone H3 est assemblée dans la chromatine. Des levures dot1D (sans DOT1) le silencing est compromis et les protéines intervenantes (i e. les protéines du complexe Sir, Sir2p, Sir3p et Sir4p) vont voir ailleurs. Les auteurs proposent que Dot1p empêche la fixation ubiquitaire des protéines Sir sauf en des sites précis qui sont alors réprimés. Du fait de la conservation de ces mécanismes, il n'est pas impossible que l'on puisse retrouver le phénomène chez d'autres eucaryotes.

Les histones contiennent un repli très structuré qui contribue au cœur du nucléosome, tandis que les deux extrémités sont plutôt libres et interagissent avec de multiples effecteurs qui les modifient post-traductionnellement, entraînant en particulier le "silencing". Les lysines des queues des histones H3 et H4 sont usuellement hyperacétylées, mais dans la chromatine réprimée, elles sont hypoacétylées. L'acétylation des arginines active la transcription, mais dans le cas des lysines, l'effet dépend du contexte.

97. Escherichia coli possède trois  ADN polymérases SOS induites par des lésions: pol II, pol IV et pol V. On vient de montrer que chacune apporte un avantage dans l'adaptabilité (fitness) au cours de la phase stationnaire, en l'absence de tout dommage à l'ADN. Elles engendrent, en effet, une variabilité génétique en sus de la réplication du chromosome. B Yeiser et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8737-8741.

98. Des chercheurs australiens ont évalué une souche recombinante de Klebsiella oxytoca pour une saccharification et une fermentation simultanée en éthanol à partir de la cellulose. Cette souche est la souche P2 construite en 1992 et brevetée par l'Université de Floride, et porteuse, sur son chromosome des gènes d'une pyruvate décarboxylase (pde) et d'une alcool déshydrogénase (adhB) de la bactérie Zymomonas mobilis. Elle fermente le cellobiose. Ceci permet de soustraire le cellobiose induisant la rétroinhibition des enzymes d'utilisation de la cellulose.

Ils ont comparé ses performances à des souches de levure éthanologènes ainsi qu'à Zymomonas mobilis. Elle est supérieure dans le procédé complet, mais donne moins d'éthanol en fermentation simple (maximum 36 g/l.).Elle est cependant beaucoup plus rapide que des souches de Saccharomyces pastorianus, Kluyveromyces marxianus et Zymomonas mobilis éthanol-tolérantes, ce qui signifie que son problème est l'éthanol-tolérance. On peut combiner en co-culture la souche recombinante avec l'un ou l'autre des trois microorganismes plus tolérants, en modulant la température pour optimiser la production d'éthanol. K.oxytoca P2 domine les phases initiales de la co-culture, en présence de cellulose microcristalline, phases qui correspondent à la saccharification et au début de la fermentation, puis le relais est pris par les autres microorganismes. H Golias et al.; Journal of Biotechnology 96 (26JUN02) 155-168.

99. Les interactions électrostatiques au sein des membranes imposent des contraintes structurales aux protéines importées. Si on considère la colicine E1, son insertion et la formation du pore correspondant sont à leur pic pour une teneur en lipides anioniques de 25-30 mol%, comme le montrent des chercheurs moscovites, et qui est précisément celle des membranes d'E.coli. SD Zakharov et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8654-8659.

100. Les bactéries sont capables de localiser des protéines membranaires en un site précis, malgré l'absence d'appareil de distribution comme le reticulum, le Golgi, etc… Elles utilisent le système des pièges à mouches avec diffusion libre suivie d'une capture. Cela a été démontré pour une protéine membranaire de la spore de Bacillus subtilis. DZ Rudner et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8701-8706.L'expression de protéines à la surface de Saccharomyces cerevisiae peut être sérieusement améliorée en allongeant la protéine par une insertion de grande taille. F Breinig et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 58 (APR02) 637-644.

Si on fusionne  la séquence leader (N-terminale) de la protéine Kre1p (ou celle de Cwp2p), suivie par les neuf acides aminés de l'épitope principal de l'hémagglutinine suivis par un peptide d'ancrage C-terminal soit de Cwp2p, soit de Flo1p, on obtient une expression pariétale dans 70% des cellules. La construction a été exprimée en permanence sous la commande du promoteur de la phosphoglycérate kinase. On peut ensuite solubiliser la paroi de la levure par une laminarinase, ce qui indique que l'ancrage a lieu sur les b-1,3-D-glucanes.

Ce qui est plus intéressant, c'est que si on interpose un espaceur riche en Ser/Thr de 350 aminoacides, on augmente de façon spectaculaire l'accessibilité de l'épitope à la surface de la levure.

101. Le 2-Phényléthanol (2-PE) a un parfum voisin de celui de la rose. On en produit, chimiquement, plusieurs milliers de tonnes par an. Des chercheurs de Dechema, à Frankfurt, publient une revue sur le marché actuel, la production chimique, mais également sur les essais de bioconversion de la L-phénylalanine en 2-PE par des levures. Le problème à résoudre est de soustraire le produit au fur et à mesure de sa production pour éviter les rétroinhibitions. MM Etschmann et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 59 (JUN02) 1-8.

102. La cyanophycine (multiarginyl-poly[L-aspartate]) est un polymère pseudopeptidique contenant une proportion équivalente d'acide aspartique et d'arginine, présent chez la plupart des Cyanophycées, à qui il sert de réserve azotée sous forme granulaire. On devrait pouvoir s'en servir comme biopolymère alternatif aux polyaspartates. La polymérisation ne fait intervenir qu'une seule enzyme, la cyanophycine synthétase (CphA).

Les Cyanophycées ne sont, cependant, pas des hôtes d'expression souhaitables du fait de leur croissance lente et à faibles densités. Les gènes de CphA d'Anabaena variabilis ATCC 29413, Anabaena PCC7120, Synechocystis PCC6803, Synechocystis PCC6308, Synechococcus elongatus et Synechococcus MA19 ont, donc, été clonés et exprimés dans Escherichia coli. Des essais d'expression de CphA ont été réalisés à petite échelle dans Ralstonia eutropha, Corynebacterium glutamicum et Pseudomonas putida. Mais, comme souvent, le polymère est plus court et beaucoup plus polydispersé dans les souches recombinantes et, en plus, elles rajoute subrepticement de la lysine.

Des chercheurs de Münster et de Bayer ont exprimé, sous la commande d'un promoteur thermosensible, celle de Synechocystis PCC6803 dans Escherichia coli à l'échelle de 500 litres. Il a fallu inventer une méthode d'isolement spéciale de la cyanophycine pour cette échelle. KM Frey et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3377-3384.

Les Protéines et les Enzymes

 

103. Les peptides amidases clivent les liaisons amides des peptides. Le gène de l'enzyme de Stenotrophomonas maltophilia, une bactérie Gram- a été cloné. L'enzyme clive préférentiellement la liaison C-terminale. C'est une protéine périplasmique car elle possède un peptide signal de ciblage vers l'extérieur. Elle est monomérique. Sa fonction naturelle est inconnue. Elle est beaucoup plus exprimée chez E.coli que chez la bactérie d'origine. S Neumann  et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 58 (MAY02) 772-780.

104. On connaît huit gènes de xylanases chez C.thermocellum: xynZ, xyn10B (alias xynY), xynC, xynX, xynA et xynB et xynU et xynV.

Ces xylanases ont souvent une structure modulaire avec un domaine catalytique lié à un ou plusieurs domaines, dont des domaines liant la cellulose (CBDs), des domaines de thermostabilisation (TSDs) et/ou de fixation sur la couche S (la plus périphérique). Ces domaines sont fonctionnels même quand ils sont transférés sur d'autres protéines.

Le gène xynX de xylanase de Clostridium thermocellum possède un domaine de thermostabilisation (TSD) entre le peptide signal de ciblage membranaire et le domaine catalytique (CD). Le TSD d'un gène tronqué de xylanase, xynX'TSD-CD, a été déplacé (xynX'CD-TSD) de la partie N-terminale vers la partie C-terminale par une technique dérivée de la PCR. XynX'TSD-CD gagne 5° en Topt (70°C) et elle est plus thermostable (68% versus 46%  20 minutes à 70°C) sur XynX'CD (sans TSD). Mais, par rapport à XynX'CD-TSD, les caractéristiques sont fortement modifiées, avec une Topt de 30°C et une thermostabilité de seulement 20% dans les mêmes conditions que précédemment. Mais XynX'TSD-CD comme XynX'CD-TSDont une meilleure capacité à lier les xylanes et lichenanes que XynX'CD.

Le TSD de XynX possède une double fonction de thermostabilisation et de fixation des xylanes. C'est donc plutôt un "xylan-binding domain". ES Shin et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3496-3501.

105. Les laccases sont des oxydases à cuivre extra-cellulaires qui oxydent la lignine et de nombreux xénobiotiques. Une laccase "bleue" du basidiomycète Stropharia rugosoannulata est capable d'oxyder Mn2+ en Mn3+ en présence de chélateurs du Mn comme les oxalates, malonates et pyrophosphates. L'application d'oxalate ou de malonate, mais pas de pyrophosphate, entraîne la formation de peroxyde d'hydrogène et réduction du tétranitrométhane (TNM) ce qui indique la présence d'anions superoxydes. La présence d'oxalate donne une activité supérieure à elle en présence de malonate. La laccase catalyse l'oxydation du Mn2+ et une  décomposition abiotique des chélateurs par le Mn3+, entraînant la formation de superoxydes et une réduction subséquente en H2O2. Celui-ci va servir à des oxydations extra-cellulaires et à initier les réactions des peroxydases à manganèse. D Schlosser et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3514-3521.

Stropharia rugosoannulata dégrade les chlorophénols, la ciprofloxacine (la fluoroquinolone antibactérienne à la mode), le TNT (2,4,6-trinitrotoluène) en CO2 et H2O.

105. Des amylases ne nécessitant pas la solubilisation et l'hydrolyse à haute température sont industriellement souhaitées. Des chercheurs taiwanais ont cloné et séquencé le gène d'une a-amylase attaquant l'amidon brut (non empesé) d'une Cytophaga. CL Jeang et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3651-3654.

106. Le palatinose (ou isomaltulose, 6-O--D-glucopyranosyl-D-fructose) est un isomère du saccharose ayant le même pouvoir sucrant, mais pas cariogène. C'est aussi un édulcorant ne donnant pas de glucose digestif et donc utilisable par les diabétiques. 

Plusieurs microorganismes le produisent. C'est le cas de Protaminobacter rubrum, Serratia plymuthica, Erwinia rhapontici, Klebsiella planticola CCRC 19112, Pseudomonas mesoacidophila MX-45 et Agrobacterium radiobacter MX-232.

L'isomaltulose synthase (alias saccharose isomérase), a été purifiée des quatre premières bactéries. L'enzyme produit aussi bien isomaltulose que tréhalulose, et libère un peu du glucose et du fructose.

L'isomaltulose synthase de S. plymuthica peut, de plus convertir le saccharose en isomaltose et isomelézitose. L'activité des enzymes est fortement dépendante de la température et elles sont thermolabiles.

Une nouvelle souche LX3 de  Klebsiella du sol convertissant le saccharose en isomaltulose a été isolée par des chercheurs de Singapore. Le gène codant l'isomaltulose synthase palI a été cloné. L'enzyme contient un domaine d'a-amylase. L'activité est inhibée par le fer ferrique et augmentée par  Mn2+ et Mg2+ ; L'enzyme  recombinante a été surexprimée chez E.coli, purifiée, puis améliorée par mutagenèse dirigée pour renforcer la thermostabilité par substitution de prolines. D Zhang et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUN02) 2676-2682.

107. Le repliement d'un ARN n'est pas facile à étudier, car on a souvent des pièges cinétiques dus à des repliements incorrects qu'il faut défaire avant de continuer. La RNase P de Bacillus subtilis ne donne pas lieu à ce type de pièges. Elle a été utilisée pour étudier la cinétique du repliement de son ARN. XW Fang et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (25JUN02) 8518-8523. Les auteurs ont utilisé la technique de spectroscopie de fluorescence et d'absorbance et la diffraction aux petits angles des rayons X. L'étape limitante est un petit réarrangement terminal impliquant les ions métalliques déjà fixés.

Les RNases P engendrent l'extrémité 5'des tARNpar clivage des précurseurs. Toutes les RNases P contiennent un ARN, dit M1 (sauf, peut-être, celles de certains chloroplastes et des mitochondries des trypanosomes) qui est une ribozyme responsable de l'activité catalytique. Des ions métalliques divalents sont indispensables. Pour ceux que cela intéresse, voir V Gopalan et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (01MAR02) 6759–6762 ou C Cobaleda et al.; Trends in Biochemical Sciences 26 (OCT01) 406-410.

L'Agroalimentaire

 

108. Le colostrum produit par la glande mammaire, juste après la naissance des descendants, est chargé de facteurs immuns, de croissance et de réparation des tissus. Il contribue au développement de l'immunité chez le nouveau-né.

Il contient, en particulier, des quantités appréciables de composants du complément qui confèrent une immunité innée contre les microbes et activent le développement du système immunitaire. Une revue sur les propriétés du colostrum est parue dans FO Uruakpa et al.; Nutrition Research 22 (JUN02) 755-767.

 Le colostrum bovin peut être utilisé pour prévenir ou traiter des infections du tube digestif. Il a, par ailleurs, des propriétés stimulantes sur la réparation et la croissance des muscles squelettiques (d'ici à ce qu 'on l'interdise pour les compétitions sportives…). C'est la seule source naturelle des TGF a et b (Transforming Growth Factors ) ainsi que des IGF-1 et –2 (Insulin-like Growth Factors).

109. Les techniques d'emballage des fruits causent des dommages mécaniques que l'on cherche à limiter. Les chocs entraînent des lésions qui se propagent dans le fruit avec une dégénérescence du mésocarpe et de l'endocarpe. Ces effets dépendent évidemment de la variété, mais une sélection pour une meilleure résistance ne va pas forcément de pair avec celle des qualités gustatives.

Les polyamines ont été pas mal étudiées, mais surtout dans les lésions au froid. La putrescine s'accumule, en effet, dans les organes de plantes soumises à ce stress. C'est ce que l'on a montré pour les citrons et les pamplemousses. On a pensé que c'était un mécanisme de défense et l'injection de telles polyamines retarde, effectivement, la sénescence chez plusieurs fruits, mais on ne sait pas grand-chose du rôle des amines endogènes. La putrescine est la première polyamine dans la chaîne de synthèse de ces composés.

Une étude a été faite sur des prunes, Prunus salicina cv. BlackStar, conservées à 10°. Un traitement par de la putrescine inhibe et diffère la production d'éthylène et de CO2. Il améliore la résistance physique du fruit, avec activation de la voie de synthèse, et accumulation des putrescine et spermidine pariétales. A Pérez-Vicente et al.; Postharvest Biology and Technology 25 (MAY02) 25-32. C'est un marqueur, mais est-ce un mécanisme de résistance?

110. Un ramollissement rapide s'observe chez beaucoup de pommes après cueillette. Ce ramollissement est accompagné par une production endogène d'éthylène amenant sas concentration au-dessus de 1,5 ml/L. On s'est donc demandé si ce fruit climactérique pourrait être traité par l'éthylène pour provoquer un mûrissement rapide avant la vente. La Royal Gala le fait entre 0 et 35°, mais d'autres pommes comme la Granny Smith ne subissent cette phase qu'après un passage entre 0-4° pendant 2 à 32 jours. Elle a besoin, à la fois, d'un traitement au froid (0,5°) et d'une application d'éthylène (100 ml/L. durant 24 h) pour se ramollir. Les deux traitements sont synergiques, et induisent la production autocatalytique endogène de l'éthylène. JW Johnston et al.; Postharvest Biology and Technology 25 (JUL02) 257-264.

111. Les gènes codant les peptidases PepN, PepC, PepX et PepI d'une souche fortement protéolytiques de Lactobacillus helveticus ont été transférés dans Lactococcus lactis avec un vecteur "food-grade" (une antinomie par les temps qui courent) par des chercheurs de MTT Agrifood Research Finland. L'idée est d'améliorer et de raccourcir la durée de maturation des fromages, spécialement des fromages allégés. V Joutsjoki et al.; Journal of Applied Microbiology 93 (JUL02) 1159-1166.

Les Probiotiques

112. Les spores de divers Bacillus sont commercialisées comme probiotiques agissant comme compétiteurs dans le tube digestif. Elles sont utilisées couramment au Vietnam contre des diarrhées, mais sont également vendues dans les drugstores aux Etats-Unis. On en parle comme des promoteurs de croissance dans l'alimentation animale pour remplacer les antibiotiques. Il reste à prouver que ces spores germent de façon suffisante dans le milieu hostile du tube digestif. En effet, les probiotiques sont usuellement des cellules végétatives souvent lyophylisées. Des chercheurs britanniques ont utilisé l'expression du gène ftsH-lacZ, qui n'est exprimé que dans les cellules végétatives et détectée par une RT-PCR (Reverse Transcription) qui détecte son expression. Les pores germent dans le jéjunum et l'iléon. Il semble donc que les spores peuvent permettre une colonisation transitoire de l'intestin grêle. G Casula et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (MAY02) 2344-2352.

113. Des chercheurs du Deutsches Institut für Ernährungsforschung s'intéressent depuis quelques années à une bactérie anaérobie stricte de l'intestin humain, qui vit des flavonoïdes de l'alimentation, Eubacterium ramulus. Au point qu'on finirait par croire que les probiotiques de ce type ne servent qu'à elle seule.

La quercétine est un flavonol usuellement lié au glucose (quercétine-3-glucoside). C'est le plus abondant dans notre alimentation végétale.

Ses effets probiotiques ont été démontrés in vitro sur l'agrégation plaquettaire, etc…beaucoup moins in vivo, sauf dans des études de corrélations. Après ingestion, les flavonoïdes sont dégradés en acides phénoliques, comme l'acide 3,4-dihydroxyphenylacétique. Eubacterium ramulus est capable de cette conversion ainsi que de celle de beaucoup de flavonoïdes. R Simmering et al.; FEMS Microbiology Ecology 40 (JUN02) 243-248.

La sécurité alimentaire

114. On trouvera dans E Susman; ASM News 68 (JUN02) 264, le compte rendu de la conférence sur les maladies émergentes qui s'est tenue à Atlanta en Mars. On y trouvera une discussion sur les problèmes de sécurité alimentaire, mais aussi sur le charbon, la peste et les Salmonelles antibio-résistantes. L'article décrit comment une épidémie de charbon a été bloquée dans les bureaux du Congrès et signale que des cas de peste, loin de se limiter au tiers-monde ont été détectés aux Etats-Unis sous forme isolée, notamment en Arizona.

Le sérovar Typhimurium de Salmonella est le plus commun des sérotypes. Salmonella enterica sérovar Typhimurium du type ACSSuT (ampicilline, chloramphénicol, streptomycine, sulfamethoxazole et tétracycline), S. enterica sérovar Typhimurium du type AK(kanamycine)SSuT, and S.enterica sérovar Newport R-type du type ACSSuT rassemblent environ la moitié des cas de résistances aux antibiotiques aux Etats-Unis. Cela est donc préoccupant, d'autant plus que 2% des Salmonella sérovar Typhimurium type ACSSuT, 3% des AKSSuT et 71% des Salmonella sérovar Newport type ACSSuT sont aussi résistantes à la ceftriaxone.

Des raisins de type seedless ont été rendus responsables d'une pathologie gastro-intestinal chez 41 patients aux Etats-Unis l'an passé par le biais d'une Salmonella enterica sérotype Senftenberg, qui pourtant afflige surtout les viandes bovines ou la volaille.

 Salmonella enterica sérovar Poona a causé une large épidémie en Californie à partir de melons et pastèques précoupés. Selon L Beuchat, la pratique de laver brièvement les laitues à l'eau chaude pour en préserver l'aspect frais facilite l'implantation de Listeria.

115. La listériolysine O (LLO), qui est une cytolysine sécrétée par Listeria monocytogenes et créant des pores membranaires dans la cellule-cible, lui permet d'y survivre intra-cellulairement. La LLO active la voie aboutissant au facteur de transcription NF-kB. On vient de montrer que cette activation est classique, en activant la sous-unité b de la kinase (IKKb) de IkB qui inactive, par phosphorylation, l'inhibiteur IkB de NF-kB, libérant ainsi NF-kB. L'activation par la LLO ne nécessite pas les adaptateurs MyD88 et IRAK (IL-1R-Associated Kinase). Ce qui signifie que LLO ne fait pas intervenir la voie amorcée par le récepteur de IL-1. S Kayal et al.; Molecular Microbiology 44 (JUN02) 1407-1419.

116. Des chercheurs de Wageningen viennent de caractériser un isolat de L.monocytogenes qui tolère cent fois mieux les hautes pressions. On essaye, en effet, d'utiliser de très hautes pressions pour stériliser certains aliments (voir le Bulletin de Juin §109). Ceci permet, en effet, de conserver beaucoup des caractéristiques organoleptiques. La souche a été récoltée après un traitement de 400 MPa durant 20 minutes. Cette piézotolérance a été conservée durant 40 générations. Les cellules ne sont pas flagellées et plus résistantes que la souche d'origine à divers stress (chaleur, acide et peroxyde d'hydrogène). La raison de la piézotolérance n'est pas à rechercher dans les lipides de la membrane. Il faudrait donc prévoir ces résistances et élucider leur mécanisme. KAG Karatzas et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3183-3189.

L'Environnement

117. L'utilisation d'un nouveau système de gène d'organomercuriques-lyase, merB3,   permet de détecter et d'éliminer les contaminations organomercurielles. il provient du transposon TnMERI1 de Bacillus megaterium, qui permet la résistance aux désinfectants à base de mercure chez les Gram+. M Narita et al.;  Applied Microbiology & Biotechnology 59 (JUN02) 86-90. La même équipe avait caractérisé les trois gènes MerB de ce transposon porté par Bacillus megaterium MB1. C Huang et al.; Gene 239 (01NOV99) 361-366.

La construction consiste  en une fusion des gènes luxAB, sans promoteur, qui constituent un marqueur en aval du gène merB3 qui fournit le promoteur et assure l'élimination du mercure. Une autre construction comportant l'opéron mer (merR1 à merA), a été utilisée pour exprimer la protéine régulatrice MerR1 et l'enzyme de réduction du mercure, MerA. Les deux plasmides ont été introduits chez E.coli. La bactérie détecte bien le méthylmercure à des niveaux nanomolaires en quelques minutes et l'élimine en quelques heures.

118. Une souche de Sphingomonas sp. (2MPII) provenant d'un sédiment marin qui est capable d'utiliser le phénanthrène ou le 2-méthylphénanthrène comme seule source de carbone a été caractérisée par des chercheurs de l'IFREMER. T Nadalig et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 59 (JUN02) 79-85.

Le 9-méthylphénanthrène et le dibenzothiophène (DBT) ne sont dégradés de façon appréciable qu'en présence de 2-méthylphénanthrène, tandis que la dégradation du 2-méthylphénanthrène est stimulée en présence du 9-méthylphénanthrène. Le dibenzothiophène inhibe cette dégradation par le biais de son métabolite, la  dibenzothiophène sulfone, qui n'est pas transformable par la bactérie.

119. Les nitroaromatiques comme le TNT (2,4,6-triaminotoluène) et les picrates sont de fréquents contaminants des sols dans les usines de production et dépôts de munitions lourdes. Leur danger vient de leur toxicité et de leur solubilité dans l'eau, ce qui leur donne des idées de migrations dans les sols et les eaux.

Il existe plusieurs bactéries utilisant ces composés comme sources d'énergie et d'azote,  car elles possèdent la batterie complète de gènes permettant cette utilisation. D'autres se contentent d'une dégradation partielle. Les composés nitroaromatiques naturels sont relativement rares. La présence de deux groupements nitro rend le composé xénobiotique lié au fait que la totalité du  système des électrons p est pratiquement vidé de ses électrons. Les composés sont donc d'abord réduits avant d'être oxydés par les oxygénases des organismes aérobies. L'étendue de la réduction des groupements nitro et des produits engendrés dépendent de l'organisme considéré. Une minéralisation complète est bloquée par de nombreux culs-de-sac métaboliques en aérobiose liés à des réductions partielles. La plupart de ces réductions sont des réactions gratuites (sans bénéfice pour l'organisme), mais chez Pseudomonas sp.JLR11, elle semble couplée à une translocation de protons, et donc à une recharge de l'ADP en ATP. Un transfert d'hydrure sur le noyau aromatique est rarement la réaction initiale de réduction (voir, néanmoins, plus loin), mais on l'observe chez des bactéries essentiellement Gram+, surtout chez les bactéries traitant les picrates. La co-réduction du TNT (poubelle à électrons en présence de substrat oxydables) est possible en conditions strictement anaérobies, c'est -à-dire au-dessous de 200 mV. Les dérivés réduits dans ces conditions convergent vers la forme réduite 2,4,6-triaminotoluène (TAT). En présence d'oxygène (et de métaux lourds comme médiateurs redox) on a une autooxydation rapide (donc pas intéressante pour les bactéries), une polymérisation et une fixation irréversible à des matrices électrophiles.

Du fait de ces déficiences de la minéralisation, on peut donc se tourner vers l'immobilisation des dérivés du métabolisme des nitroaromatiques, cela permet d'éliminer un de leurs défauts: leur migration avec l'eau. L'utilisation des acides humiques dans ce but est un procédé simple et de bon goût actuellement disponible.

Le TAT est un carrefour commode du fait de ce que l'on peut le rejoindre avec tous les dérivés du TNT en conditions strictement anaérobies, et qu'il disparaît spontanément par une désamination hydrolytique. Son immobilisation laisse le temps à ces réactions avoir lieu. TAT pourrait servir de source d'azote et même d'énergie en présence de nitrates qui servent d'accepteurs d'électrons, le nitrate ne réagissant pas avec le TAT (ce qui serait revenir en arrière) dans les conditions physiologiques. Mais des essais dans ce sens ont été, jusqu'à présent, improductifs;

 Il reste des options ouvertes pour la minéralisation du TNT, comme une réduction chimiosélective qui engendrerait des hydroxylaminotoluénes qui pourraient être convertis en amino-phénols ou catéchols par des mutases ou des hydroxylaminolyases. A partir de là, de nombreuses bactéries possèdent de quoi ouvrir le cycle aromatique.

L'acide picrique est plus complaisant et se laisse plus facilement minéraliser. La réductase initiale et l'hydrure transférase des souches dégradant l'acide picrique, HL PM-1 de Rhodococcus (opacus) erythropolis et  FJ2-1A de Nocardioides simplex, ont été caractérisées.

120. Que la microflore des sols soit abondante et variée ne fait aucun doute. Les outils d'analyse de sa complexité ont permis, dans un premier temps, d'identifier des organismes sans les isoler, et on est récemment passé à la caractérisation de fonctions dans le sol en se basant sur la présence de gènes connus. Certaines firmes s'en sont fait une spécialité. On construit actuellement des bibliothèques de génome de cette microflore dans des chromosomes bactériens artificiels. Une revue déjà signalée, V Torsvik et al.; Current Opinion in Microbiology 5 (JUN02) 240–245 s'attache aux progrès récents dans nos connaissances sur la structure et les fonctions de cette microflore. Elle comporte l'idée d'un métagénome, la somme des parties différentes des génomes extraits, même partiellement, d'échantillons du sol. On a même estimé la taille de ce métagénome (environ 6 000 à 10 000 génomes d'Escherichia coli dans un sol pas trop trafiqué, et 350–1500 génomes dans un champ cultivé ou contaminé par des métaux lourds). Ce n'est qu'une sous-estimation de la variabilité génétique dans la mesure où, si j'ai compris, on n'envisage que la présence ou pas d'un gène, mais pas des variations fines au sein des gènes qui peuvent avoir une signification fonctionnelle importante.

On développe actuellement les outils pour aller plus loin de ce point de vue. Ces nouvelles méthodes moléculaires sont l'objet de la revue. Elle montre avec quelques exemples liant les données phylogénétiques aux fonctions. Elle discute, enfin, les liens existants entre la flore, sa composition, sa stabilité et sa résilience aux fluctuations du milieu, en fonction de la structure du milieu.

121. Les performances de l'hybridation sur réseau ADNs n'ont pas été vraiment mesurées dans le cas de milieux complexes comme les milieux environnementaux, bien que l'utilité potentielle soit évidente, ne serait-ce que pour l'identification des constituants des populations de microorganismes. Dans le cas d'hybridation classique, il est difficile, voire pratiquement impossible, de repérer les séquences suffisamment conservées pour pouvoir être utilisées comme sondes oligonucléotidiques.

Les réseaux n'ont pas ces exigences, car on peut voir large pour la diversité des séquences en s'inspirant des séquences connues. Il n'est, cependant, pas évident que les conditions d'hybridation déterminées de cultures pures soient fonctionnelles dans des milieux complexes. Ainsi les acides humiques, plus généralement les contaminants organiques et les métaux interfèrent avec l'hydridation sur réseaux. On ne sait, enfin, pas dans quelle mesure la quantité et la pureté des ADNs récoltées dans le sol est suffisante (probablement pas) et dans quelle mesure on peut espérer une quantification, plus particulièrement des fonctions recherchées.

La spécificité varie beaucoup selon  les séquences utilisés et, par conséquent, le type de réseau.

Il existe des réseaux "phylogénétiques" (POAs) contenant des sondes provenant des gènes conservés codant les ARNs ribosomaux. Ils sont utilisés essentiellement dans l'analyse de la composition des communautés. Les réseaux "fonctionnels" (FGAs) comportent des sondes correspondant à des gènes impliqués dans des processus donnés des cycles biogéochimiques, comme la nitrification et la dénitrification. On peut, enfin, utiliser des réseaux "cultivables" (CGAs) bâtis sur des sondes d'organismes connus et cultivables. les auteurs discutent plusieurs exemples d'utilisation de ces réseaux avec les difficultés de détection de certaines séquences. 

L'existence de deux substitutions de nucléotides suffit à réduire de 75 à 95% la capture par une sonde. C'est un peu la rançon de la sensibilité de la détection des "mismatch", par ailleurs intéressante. FGAs et CGAs sont moins spécifiques et permettent de détecter à basse stringence (45°) des séquences avec 60 à 70% d'identité. A haute stringence (65°) on peut discriminer les séquences ayant moins de 80 à 85° d'identité. Selon les auteurs, on peut aller jusqu'à l'espèce, avec les CGAs, mais pas plus loin en présence de 50% (vol/vol) formamide à 55°C. En passant à 65-75° on peut distinguer deux espèces très proches.

La sensibilité dépend des séquences et du type de réseau utilisés. Pour les petites sous-unités des ARNs ribosomiques de Geobacter chapellei,  on a montré que l'on pouvait  détecter 0,5 mg de cet ARN avec les POAs, le gène nirS (nitrate réductase), avec un FGA, dans un ng d'ADN pur (ce qui n'est pas le plus facile) et 25 ng d'ADN global. de sol,. Le seuil de détection pour un ADN pur avec un CGA a été de l'ordre de 0,2 ng.

122. Les métaux, et spécialement le fer, sont des éléments essentiels de protéines transmettant des électrons sur l'oxygène (cytochromes) ou les sulfates. Ils peuvent également constituer des accepteurs finaux d'électrons, et donc assister une respiration anaérobie. Le fer n'est pas le seul, et des métaux et métalloïdes comme manganèse, uranium, chrome, technetium, cobalt, sélénium et arsenic peuvent également accepter des électrons. Cette réduction microbienne joue un rôle dans les cycles géochimiques d'une part, et le sort de la matière organique dans de nombreux environnements de l'ordre. Un survol bref de ce problème est paru avec DR Lovley et al.; ASM News 68 (MAY02) 231

123. L'émulsifiant polysaccharide produit par Halomonas eurihalina H-28 en présence d'hydrocarbures a été caractérisé par des chercheurs de Granada. La bactérie est modérément halophile et consomme n-tétradécane, n-hexadécane, n-octane, xylène, pétroles, huiles légères et lourdes ainsi qu'en présence de glucose.

Le polymère est surtout produit en présence de n-hexadécane et de glucose. Les quantités d'acides uroniques, d'acétyls et de sulfates dépendent beaucoup des hydrocarbures. C'est un émulsifiant potentiellement intéressant car sa production est induite dans des conditions salines et en présence d'hydrocarbures. F Martinez-Checa et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 58 (MAR02) 358-363.

La sécurité génétique

124. Des chercheurs de Lyon décrivent dans E Key et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUL02) 3345-3351. le transfert d'un gène de résistance à spectinomycine et la streptomycine d'une plante vers un Acinetobacter, mais à condition que des séquences chloroplastiques soient incorporées dans la bactérie, pour faciliter la recombinaison homologue. La plante est un tabac transplastomique contenant le transgène aadA de résistance (aminoglycoside N-adényltransférase) dans son génome chloroplastique.Ce type de transformation vise à éviter le transfert de transgènes par le pollen, mais également augmenter le nombre de copies du transgène pour en améliorer l'expression (on arrive à 10 000 exemplaires. Il a été coinfecté par l'Acinetobacter et Ralstonia solanacearum. Acinetobacter est une bactérie opportuniste du sol qui colonise facilement les tissus végétaux infectés par le pathogène Ralstonia solanacearum et développe sa compétence à absorber des ADNs étrangers dans ces conditions.

Ralstonia solanacearum développe également un état de compétence, mais on n'a jamais pu observer de transfert de gènes de la plante à la bactérie, probablement du fait de la faible transformabilité de la bactérie.

Les auteurs ont augmenté leurs chances d'observer quelque chose en transformant, au préalable, Acinetobacter avec un plasmide porteur de séquences chloroplastiques.

La Vie des Sociétés

 

125. Cargill ajoute les polyols à son portefeuille d'additifs alimentaires après l'acquisition de Cerestar. Comme beaucoup d'autres produits de la compagnie, ils seront produits à partir du maïs par des traitements enzymatiques. C'est l'érythtritol qui est le premier produit visé, mais isomalt, xylitol maltitol, mannitol et sorbitol pourraient suivre. Par ailleurs la compagnie va commercialiser des maltodextrines séchées par atomisation (spray-drying) et les amidons modifiés hydratables à froid, notamment de manioc, de Cerestar. Cargill Press Release (16JUN02).

126. La définition des nutraceutiques (alias alicaments) et probiotiques est encore bien floue malgré certaines réglementations. Celles-ci diffèrent dans le monde et dans tel pays, on doit démontrer les propriétés avancées et dans d'autres on ne vérifie que la non-nocivité. La frontière entre ces aliments et les produits pharmaceutiques reste très floue, probablement volontairement pour ménager les intérêts concurrents de l'industrie pharmaceutique et de l'industrie alimentaire qui ne cultivent pas le même jardin.

L'expansion de ce marché, très probable dans la mesure où, dans les pays solvables, on ne mange plus pour calmer sa faim, dépend en outre de structures commerciales adaptées. Un article, J Hodgson; Nature Biotechnology 20 (APR02) 322‑323, analyse la situation. C'est une partie des discussions qui se sont tenues à Zürich en Février dernier à la BioSquare Partnering Conference que relate l'article.

L'objectif pour cette partie de l'industrie alimentaire est de fournir des ingrédients (à un prix rémunérateur), dont la valeur "santé" est prouvée (plus ou moins). Ceci est illustré avec le cas d'un producteur de gélatine, DGF Stoess d'Eberbach en Allemagne. celle-ci a de multiples usages industriels, mais dans le domaine alimentaire la firme veut développer ses débouchés vers l'alimentation, d'abord en fournissant de la gélatine recombinante produite dans le cadre d'une coopération avec Fibrogen,  en s'appuyant sur la peur de l'encéphalite spongiforme (la gélatine est actuellement produite traditionnellement à partir des os animaux donc à risques prouvés si on pense à la colonne vertébrale). Mais cela ne suffit pas, et elle avance que l'absorption journalière de gélatine atténue les déficiences osseuses, arthritiques, et améliore la pousse des cheveux, etc…[voir les US Patent n°5 925 736 (20JUL99), 5 928 922 (27JUL99) et 6 358 741 (19MAR02)].La firme établit les bases physiologiques de ces effets qui auraient été constatés. La technique commerciale utilisée est d'autoriser les clients à clamer qu'ils incorporent le collagène de DGF dans leurs produits ("Intel Inside"). mais selon un légiste de Mayer, Brown & Platt (Frankfurt am Main), dire qu'un aliment améliore l'arthrite en fait un médicament et c'est le très lourd processus de validation d'un médicament qui permettrait de le mettre sur le marché. Dire que "c'est bon pour les articulations" serait acceptable, sauf contre-vérité flagrante. Encore qu'au sein de l'Europe la réglementation, "subsidiarisée" est celle de chaque pays. .

Le danger de telles affirmations vient des concurrents qui peuvent mettre en doute la véracité des affirmations, et il faut être prêt à se prémunir contre de telles attaques. L'absence absurde de réglementations uniformes communes, notamment dans l'étiquetage et la publicité, permet des contestations nationales, voire locales (mais l'application d'un jugement sera également nationale ou locale). Un compétiteur peut même affirmer que les revendications sont si convaincantes que des essais de type pharmaceutiques sont indispensables!!!!

La réglementation américaine permet de prévenir le producteur que ses revendications sont acceptables ou non, pas en Europe ou la réglementation sur les "nouveaux ingrédients et aliments" conduit les producteurs à renoncer à l'affirmation qu'il s'agit d'un produit nouveau devant la lourdeur des vérifications. Tout cela provient des attitudes variables vis-à-vis de la réglementation en général : les pays scandinaves et germaniques mettent l'accent sur la protection des consommateurs, alors que la Grande-Bretagne met l'accent sur une claire définition laissant le consommateur choisir. Dans d'autres pays, on essaye d'envoyer les ministres en prison, ce qui fait que le parapluie réglementaire national devient extraordinairement large. L'uniformisation devra attendre les conclusions du Codex Alimentarius.

127. Affymetrix a obtenu un contrat de $4 millions du NIH pour développer des techniques de révélation de transcriptions cryptiques (http:/www.affymetryx.com/corporate/ index.html). Les  premiers résultats sont parus dans P Kapranov et al.; Science 296 (03MAY02) 916-919. En effet, on se base sur les messagers polyadénylés trouvés dans le cytoplasme pour déclarer qu'une séquence est exprimée, et l'on sous estime largement le nombre de ces dernières. L'expérience a été fait sur les chromosomes 21 et 22 humains et l'on a construit, a priori des sondes espacées de 35pb correspondant à la séquence connue et l'on a pêché les transcrits. On en trouve effectivement  beaucoup plus que de cDNAs (10 fois plus).

La technique peut également être appliquée à des études de génétique épidémiologique, notamment dans cette approche des maladies infectieuses (DD Dalma-Weiszhausz et al.; Genetic Epidemiology  23 (JUN02) 4-20).

128. Archer Daniels Midland est le plus gros producteur de bioéthanol en Amérique du Nord et va commercialiser de l'alcool industriel en Janvier 2003.Elle le faisait jusque-là au sein d'une compagnie commune avec Dow Chemical Company. Les boissons alcoolisées et le carburant ne sont plus un débouché suffisant. Les usines de Peoria (Illinois) et Clinton, (Iowa) qui partent du maïs sont impliquées. http://www.admworld.com.

129. Biocontrol Technology n'en finit pas de se sortir d'un problème de fausses déclarations (voir BICO Press Release (16OCT01). Bien que le juge de Pennsylvanie qui examinait son cas n'est prononcé aucune sanction, tout l'état-major a été purgé. La société est en réorganisation totale et cherche à limiter ses pertes. PRNewswire (26JUL02).

130. Celera Genomics et Applera Corporation annoncent la base de données sur les SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) de la souris dans le cadre du Celera Discovery System™, ainsi qu'un complément à sa séquences annotée de la souris. Elle correspond à une couverture de huit fois (augmentant la fiabilité) des quatre souches de souris (129X1/SvJ, DBA/2J, A/J, 129S1/SvlmJ et C57BL/6J). les données concernant C57BL/6J sont issues du domaine public.  Cette base de données SNPs contient plus de trois millions de variations non recouvrantes tout au long du génome. Elles sont publiées avec 300 pb de part et d'autre pour permettre leur utilisation. Une présentation est consultable à www.celera.com où la firme se charge de vanter ses produits. Celera Press Release (17JUN02).

131. Diversa annonce un nouvel accord d'exploration de la biodiversité avec le Marine Bioproducts Engineering Center de University of Hawaii-Manoa. C'est le neuvième site dans le monde pour qui des accords de ce type ont été conclus. La justification de telles explorations est l'isolement exceptionnel de ce groupe d'îles. Diversa Press Release (04JUN02).

La Politique

 

132. La mise en place de souscriptions pour accéder aux données de la "Proteome BioKnowledge Library" d'Incyte Genomics , met les chercheurs en rage. Ces données étaient gratuites, jusqu'à présent, pour des chercheurs publics, car elles provenaient de la société Proteome qui avait mis en place cette politique. Cette société a été rachetée par Incyte Genomics en fin 2000. Au mois de Juillet de cette année, un abonnement de 2 000 dollars par laboratoire a été mis en place.

Cette exigence n'est pas déraisonnable devant la fuite des investisseurs; et si la société veut continuer à développer ces bases de données. De plus, l'annotation des séquences est bien un travail qui mérite une contribution financière, mais la somme est exagérée pour les petites équipes. La faiblesse de l'aide des institutions est certainement en cause, mais c'est une conséquence du souhait d'une non-concurrence des institutions publiques quand une entreprise privée couvre un secteur. Les chercheurs de l'EMBL (European Molecular Biology Laboratory de Heidelberg) ont donc dû retirer des données d'une publication récente juste avant publication, Incyte ne souhaitant pas que les données soient diffusées gratuitement par le biais d'une publication. Les auteurs ne savent plus quoi répondre aux questions sur ces données. A Abbott; Nature 418 (25JUL02) 357.

133. Un rapport du Nuffield Council on Bioethic sur les règles d'octroi des brevets sur les séquences d'ADN a été publié le 23 Juillet et commenté par D Adam; Nature 418 (25JUL02) 356.Ce conseil est une émanation du Medical Research Council et de deux fondations londoniennes,Wellcome Trust et Nuffield Foundation. Le rapport indique que la brevetabilité des séquences (surtout humaines) ne contribuera pas à une stimulation de l'innovation au bénéfice du bien public qui est sa raison d'être. Leur argumentation porte, en particulier, sur l'identification par homologie sans aucune inventivité.

Le rapport insiste sur le fait qu'il ne s'agit nullement de rafistoler le système, mais, surtout, d'appliquer plus strictement les critères existants (nouveauté, inventivité et utilité).

Japon, Etats-Unis et Europe les traitent de façon différente.  L'US Patent Office est le plus laxiste. Des efforts sont cependant faits pour le critère d'utilité aux Etats-unis. En Europe, une application commerciale doit être démontrée.

Les brevets européens sur les séquences utilisées en diagnostic comme celui de Myriad Genetics sur le gène BRCA1 de prédisposition au cancer du sein, par ailleurs attaqué par des chercheurs français car il empêche la mise au point d'outils alternatifs, est cité en exemple.

La conclusion du rapport est que des brevets sur l'ADN devraient être l'exception plutôt que la règle, si on veut développer cette approche de la santé publique.

Une phrase sanglante de Deryck Beyleveld, directeur du Sheffield Institute of Biotechnological Law and Ethics at Sheffield University résume merveilleusement la situation actuelle :  "We no longer have a patent system that rewards inventors for their creativity,but one that essentially rewards investors for their investment."

134. Le marché des produits pharmaceutique a longtemps été un marché finalement très fragmenté, et les sociétés pharmaceutiques n'étaient pas des géants. Une certaine concentration était inévitable. Mais le stade actuel devient préoccupant (60 milliards de dollars pour l'acquisition par Pfizer, déjà la plus grosse firme, de Pharmacia, il est vrai en actions, ce qui est souvent un marché de dupes) et pose la question de savoir comment amortir ce genre d'excès. Les fusions entre firmes pharmaceutiques qui sont (ou ont été) encouragées par les investisseurs dans l'esprit du temps, ont, cependant, commencé à semer le doute, même parmi ces derniers et là comme ailleurs (voir Chrysler-Benz), très souvent le prix de l'action chute de façon continue après la fusion (voir GlaxoSmithKline issue de la fusion de Glaxo Wellcome et SmithKline Beecham). Ce n'est pas mon problème ici, mais celui des conséquences sur la recherche industrielle qui me préoccupe. Un article dans Nature 418 (25JUL02) 353 (d'ailleurs non signé, ce qui est rare) me donne l'occasion de faire un point modeste.

Cet article souligne que beaucoup de ces fusions sont corrélées avec la fin de protection de "vaches à lait" et un certain désarroi face à des pipelines vides ou menacés. Ces "pipelines" dépendent d'autorisations de plus en plus difficiles à obtenir et à un coût croissant (800 millions de dollars actuellement pour un produit pharmaceutique, contre 400 millions il y a une quinzaine d'années, selon le Tufts Center for the Study of Drug Development de Boston, http://www.tufts.edu/med/csdd). GlaxoSmithKline, en difficulté à la suite de déboires récents est déjà, dans la même ligne de pensée, à la recherche d'un nouveau partenaire.

On admet qu'un produit sur mille essayé atteindra le stade commercial, le reste disparaissant à la suite de déboires pré-cliniques ou cliniques. Ces derniers sont particulièrement ennuyeux dans la mesure où on a déjà beaucoup investi et où on a, en général, séduit les actionnaires avec un avenir plein de dollars. Quand on doit abandonner (et on en a des exemples très fréquents dans la presse quotidienne), cela fait mal.

Le concept de sociétés des sciences de la vie avec la communication entre plusieurs branches de ces disciplines et les extrapolations visibles à l'œil nu ont fait long feu, et les difficultés de débouchés des applications agronomiques (et leur plus faible rentabilité) ont rapidement conduit les investisseurs à séparer (et revendre) les activités "agro". Même dans le cas de Monsanto.

Malheureusement les fortes hausses de revenus en pharmacie sont également du passé. Les "vaches à lait" sont en voie de passage au domaine publique. Les contestations de brevets sont, par ailleurs, devenues fréquentes et peuvent obscurcir sérieusement l'avenir .

L'article insiste sur le fait qu'il existe actuellement des produits efficaces et pas chers pour beaucoup de problèmes de santé. Encore que les exemples donnés ne me paraissent pas tout à fait convaincants. Ceux qui restent irrésolus sont complexes. Le nombre de cibles potentielles pour une action donnée ne cesse, certes, de croître, mais le problème est, d'abord, de choisir la bonne, puis de démêler les interactions multiples à maîtriser.

Le séquençage complet (ou presque) du génome humain a lancé des spéculations folles du type de la bulle internet. La croyance (largement basée sur des opinions de scientifiques et relayée par les financiers) que tout ceci déboucherait sur des revenus substantiels a lancé, d'une part, des investissements massifs sur des données réelles à l'état brut, mais qui se sont révélées douteuses quant au calendrier de leurs applications et et, d'autre part, la prolifération incontrôlée des brevets qui en découle.

 Les chercheurs sont depuis quelques années le pied en l'air, car les ordres et contre-ordres, en attendant les décisions stratégiques sur les créneaux choisis et les produits à développer en priorité, peuvent se multiplier. On sait qu'on aura des lignes à éliminer, mais lesquelles? sans parler des allègements d'effectifs qui reviennent à un délestage de capital. Les sociétés de biotechnologies, qui dépendent souvent d'accords avec les compagnies proprement pharmaceutiques, sont également suspendues à des discussions, où elles n'ont guère leur mot à dire et dont les conclusions sont difficiles à prévoir. La pérennité des accords acquis est douteuse, dans la mesure où ils associent des firmes concurrentes du nouvel ensemble. En attendant les dollars sont difficiles à trouver en dehors, et des programmes voir l'ensemble de l'activité de la firme sont menacés. Plusieurs firmes de biotechnologies ont choisi de suivre leur propre stratégie et de viser des produits, mais pour cela il faut des finances, ce qui n'est pas facile actuellement.

Cela n'encourage guère à l'optimisme et les chercheurs en ont terriblement besoin. Si on discute du problème avec des dirigeants, on observe souvent un optimisme de façade qui est largement absent aux échelons inférieurs, même si tous sont menacés. Cette incertitude peut disparaître rapidement si des décisions stables sont rapidement prises. Curieusement c'est vers des sociétés plus petites, dont les sociétés de biotechnologies, souvent menacées par l'étranglement financier, que se dirigent les chercheurs confirmés (voir GlaxoSmithKline). Du coup les géants transfèrent également leurs commandes de recherche vers ces sociétés qui prennent alors tous les risques. Cela n'évitera pas la prise de risque lors des essais cliniques.

135. On trouvera dans C Müller; Trends in Biotechnology 20 (JUL02) 287-290, une analyse du développement des industries biotechnologiques en Allemagne.

Elle conclut que l'évolution probable sera plus vers une innovation dans les produits plutôt que dans les plateformes de technologies (moins risquées, car polyvalentes, mais moins rentables), qui y sont la part actuelle la plus importante, contrairement à ce qui se passe aux Etats-Unis ou en Grande-Bretagne. Selon un rapport d'Ernst & Young sur l'état des biotechnologies en Europe, qui a inspiré l'article, l'Allemagne a le plus grand nombre de sociétés (c'est un indice des idées originales des scientifiques). Avec une définition restrictive des sociétés de biotechnologies, il y a 333 compagnies en Allemagne contre 271 en Grande-Bretagne et 240 en France. Il y a dix ans, pendant la phase de rejet des biotechnologies, il n'y en avait que 17. On trouvera dans l'article une carte des implantations en 2000.

Les grandes firmes ont eu un rôle très effacé dans ce développement en Allemagne. Face à l'hostilité forcée des autorités locales, elles avaient exporté leur recherche aux Etats-Unis (voir Bayer, Hoechst et BASF), et y avaient noué des liens avec des institutions prestigieuses (Bayer avec Genentech et Hoechst avec le Massachusetts General Hospital) pour garder un regard sur les développements en biotechnologies, malgré la qualité de la recherche publique allemande (particulièrement aux Max Planck Instituten).

Le rôle majeur a été joué, après un retournement d'attitude spectaculaire, par les autorités fédérales et des länders, avec des financements adaptés, le développement de sociétés de capital-risque, et la création d'une bourse pour les hautes technologies (Neuer Markt, pendant du NASDAQ américain), pour faciliter les financements. La réunification, avec la stagnation et le chomage induits, a été le tournant décisif. La nécessité de développer des industries de pointe pour remplacer les industries classiques en involution a été traduite en termes d'engagement rapide d'une politique ambitieuse du gouvernement fédéral et des länder.

Les réglementations rédhibitoires de l'ingénierie génétique ont été modifiées sans problèmes en 1993 et 1996 pour les aligner avec celles des Etats-Unis. L'opprobre sur  les technologies appliquées à l'agriculture continue néanmoins à sévir.

Le Bundes Ministerium für Berufausbildung und Forschung a lancé un programme remarquable de stimulation de création d'infrastructures. La leçon des regroupements biotechnologiques de Boston, Triangle Park, San Diego et de la Bay Area à San Francisco a été assimilée et un concours (évoqué à l'époque dans ce bulletin) pour des centres supra-régionaux BioRegio a été ouvert en 1995. Il impliquait la totalité des acteurs, scientifiques, avec leurs idées, l'administration, le secteur financier, le support brevet, etc… Les BioRegio Berlin, Bio Jena, BioRegio München, BioRegio Rhein-Neckar et BioRegio Rheineland en sont issues directement ou indirectement. Trois avaient été, en fait, sélectionnées par un jury international, BioRegio München, BioRegio Rheineland (avec Köln) et BioRegio Rhein-Neckar (avec Heidelberg).BioRegio Jena a été ensuite créée, avec une spécialisation dans la bioinstrumentation, mais également avec une volonté politique de relancer la partie est du pays.

Le rejet d'autres projets n'a pas découragé les régions. Elles ont continué à financer leurs projets. C'est le cas de BioRegio Berlin qui est en train de se révéler des plus performantes sur le plan commercial, bien qu'il ait échoué au premier concours.

Le financement allemand classique repose sur des crédits bancaires. Il est inadapté aux industries à risque et retour sur investissement à long terme. Cette fonction est assurée aux Etats-Unis par le capital-risque. C'est la raison de la création du Neuer Markt en 1997, débouché naturel de plus de 200 sociétés de capital risque allemandes. Plus de 60 investissent au moins en partie dans les biotechnologies. Les financements  ont été facilités, par ailleurs, par un système de co-financement par la Technologie-beteiligungsgesellschaft (TBG) filiale de la Deutsche Ausgleichsbank (banque gouvernementale) qui s'intéresse aux firmes moyennes. Elle a investi, en 2000, ¤ 504,9 millions dans les hautes technologies dont 24% dans les biotechnologies. Les conditions requises sont de ne pas avoir plus de 50 employés détenir moins de ¤ 5 millions en caisse et être détenue à moins de 25% par une plus grande compagnie. Par ailleurs certaines grandes firmes comme Aventis et Bayer ont, elles même lancé une politique de capital-risque destinée aux biotechnologies qui les intéressent.

Une idée originale pour développer l'entrepreunariat a été la création de concours de "business plans" en collaboration avec McKinsey et  Ernst & Young et des sociétés de capital-risque comme 3i.

L'industrie est très jeune. Ainsi  environ 5% de ces sociétés ont des ventes annuelles supérieures à ¤ 50 millions. Seulement 17 compagnies allemandes de biotechnologies sont cotées au Neuer Markt, contre plus de 400 au NASDAQ (dont les sociétés allemandes Quiagen et LION Biosciences). Ces données datent toutes de 2000, et il reste à voir comment ces firmes, toutes fragiles, passeront la bourrasque actuelle. De ce point de vue, l'importance de l'intervention gouvernementale est un atout indéniable. 

La préparation de la phase où les grandes firmes vont sous-traiter une partie de leur recherche, certaines sociétés vendant des plates-formes coordonnées de recherche s'agrandissent en acquérant tout ou partie de sociétés complémentaires. Ainsi, dès 1999, Evotec Biosystems a acquis Oxford Asymmetry en Grande-Bretagne, Morphochem a acquis Small Molecules Therapeutics aux Etats-Unis en 2000, etc…. En début de cette année,  LION Biosciences a acquis NetGenics aux Etats-Unis.

136. L'effondrement des valeurs high-tech en bourse frappe également la biotechnologie (moins 65% en deux ans) et cela a des conséquences notables sur les accords avec le milieu universitaire. Le nombre d'accords avec l'University of California at San Francisco était de 125 en 2000 pour des recherches non-cliniques. Il est tombé à 70 en 2001 et sur le début de l'année fiscale 2002 (Octobre 2001 à Juin 2002) il est tombé à 39. La valorisation des outils est tombée à zéro et l'intérêt ne porte plus que sur des produits.

Les firmes de biotechnologie américaines avaient pris le relais de l'industrie du Net en 2000 avec l'achèvement du séquençage du génome humain, avaient levé 38 milliards de dollars en 2000, trois fois plus qu'en 1999. En 2001 la somme est tombée à 15 milliards.

Maintenant les scandales l'atteignent également. Le CEO de ImClone Systems est accusé d'avoir commis un délit d'initié, comme des collègues plus célèbres, en avertissant à l'avance ses amis et familles du rejet d'un médicament, leur permettant de vendre avant l'effondrement des cours de la société. J Knight; Nature 418 (04JUL02) 5.

 140. Le programme Human Frontier Science (HFSP) est en train de sombrer du fait, d'une part de la parité Yen/Dollar (le Japon, initiateur du projet, fournit plus de la moitié du budget) et des objectifs de 1997 qui ne sont, selon les Etats-Unis, nullement contraignants. L'Italie n'a, par ailleurs, pas réussi à dégager la somme promise. La réunion à Berlin des participants s'est terminée sans accord formalisé. D Cyranoski; Nature 418 (11JUL02) 115.

 

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