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Bulletin des BioTechnologies - Novembre 1999- n°165

Concepts et Techniques

Un complexe cohésine à plusieurs sous-unités maintient les chromatides associées après duplication. Ces complexes sont détectables au niveau des centromères et de sites discrets le long du chromosome depuis la phase S jusqu'à la métaphase. Ce sont des séquences de 130 à 280 pb interviennent dans cette fixation. L'association de la cohésine fait intervenir les protéines Mif2p, une histone centromérique spéciale, Cse4p, et le centromere binding factor CBF3. Seuls des centromères actifs permettent une fixation, et ce sont donc les mécanismes permettant l'attachement des microtubules sur le centromère qui doivent permettre le recrutement de la cohésine. Quand on utilise des centromères "minimaux" la traction du fuseau dépasse la cohésion assurée par le complexe et il doit exister un renforcement par les segments chromosomiques adjacents. T Tanaka et al.; Cell 98 (17SEP99) 847-858.

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L'extinction post transcriptionnelle de l'expression génique (post-transcriptional gene silencing ou PTGS) est déclenchée par des ARNs double-brins qui entraînent un abaissement spectaculaire de la durée de vie des messagers. On trouvera une revue sur le sujet dans A Fire; Trends in Genetics 15 (SEP99) 358-363. Ce type d'extinction est une gêne pour les techniques de transferts génétiques, surtout du fait de son caractère non prédictible. La co-répression des gènes autochtones a été d'abord observée chez les plantes, puis chez les nématodes, les champignons, les insectes et les protozoaires dans l'ordre. Il existe une deuxième catégorie d'extinction à médiateurs ARN, mais qui agit sur la transcription elle-même (transcriptional gene silencing).

Certains tissus échappent à ce phénomène, notamment une partie du système nerveux chez Caenorhabditis elegans.

De nombreuses caractéristiques conformationnelles des acides nucléiques sont utilisés par la cellule pour détecter des problèmes d'expression. C'est le cas chez les plantes où une expression virale entraîne une extinction qui joue le rôle d'une défense non spécifique. Les virus ont donc développé des méthodes pour neutraliser cette défense. La forme reconnue semble être l'ARN double brin (dsRNAs) produit, au moins transitoirement, au cours du cycle viral. C'est également le cas chez les trypanosomes, nématodes, les planaires, les insectes après une injection de dsRNAs. Quelques molécules par cellules suffisent à déclencher le phénomène, au moins chez Caenorhabditis elegans et Drosophila. L'expression sens plus antisens est une origine possible de tels ARNs, mais une simple épingle à cheveux suffit. Ces situations artificielles gagneraient à être étudiées plus avant pour déterminer si les dsRNA déclenchent toujours cette défense, et si tous les PTGS impliquent un tel signal.

On sait qu'il existe, au moins chez les plantes (la tomate), une ARN polymérase ARN-dépendante (W Schiebel et al.; Plant Cell 10 (DEC98) 2087-2101) qui agit sur des ARN simple-brins de façon non spécifique. Des études chez Neurospora confirme le rôle d'une telle enzyme. Mais on n'arrive pas à concevoir que de telles enzymes soient non spécifiques, compte tenu de la pagaille que cela pourrait entraîner dans la cellule. Il reste à découvrir le mécanisme d'une telle spécificité.

Une première limitation mise en évidence est que les ARN double-brins doivent avoir la même origine et la PTGS ne se déclenchera chez C.elegans et Trypanosoma brucei que si les deux brins sont exogènes. Cela semble également vrai chez les plantes, même si une surexpression des ARNs sens et antisens à partir de chromosomes différents peut déclencher la PTGS.

Celle-ci a toutes les caractéristiques d'un mécanisme catalytique ou amplificateur par sa capacité à inactiver une grande quantité d'ARNs à partir d'un petit nombre d'ARNs double brins. Le mécanisme exact de l'inactivation est encore inconnu, le nombre de modèles proposés en faisant foi.

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Les gènes de six protéines homologues de la GFP (green fluorescent protein) d'Aequorea victoria ont été isolés de coraux non fluorescents et se distinguent, pour au moins deux d'entre elles, par un spectre d'émission très différent de celui de la GFP (jaune et rouge respectivement). Elles ont été essayées comme marqueur d'expression dans des cellules transformées. MV Matz et al.; Nature Biotechnology 17 (OCT99) 969-973.

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Dans des cellules de mammifères en division, la cycline E est une sous-unité régulatrice de Cdk2 (cyclin-dependent kinase 2). Elle s'accumule à la transition G1/S du cycle mitotique et disparaît au cours de la phase S. Sa persistance entraîne une instabilité chromosomique par blocage de la progression de la phase S. CH Spruck et al.; Nature 401 (16SEP99) 297-300.

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Les plasmides mitochondriaux linéaires de 1,9 kb de Fusarium oxysporum ne sont autres que des rétroéléments télomériques avec une épingle à une extrémité et une itération telomere-like de 5pb. à l'autre. TC Walther et al.; Molecular Cell 4 (AUG99) 229-238.

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Les Productions Végétales

Les gènes et les génomes

Les rétrotransposons de la famille BARE-1 de l'orge sont actifs sur le plan transcriptionnel et participent à l'obésité génomique. Des chercheurs finlandais ont étudié le nombre de copies des gènes de l'intégrase, de la transcriptase réverse et des LTRs (Long Terminal Repeat) dans le genre Hordeum. Plus on a de copies, plus la proportion de copies actives diminue, manifestement à la suite de recombinaisons entre les LTRs laissant des LTRs isolées, réduisant ainsi la surcharge génomique .en BARE-1 complets. CM Vicient et al.; Plant Cell 11 (SEP99) 1769-1784.

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Le gène de la protéine ribosomale S14 mitochondriale d'Arabidopsis a été transféré dans le noyau, la mitochondrie n'ayant conservé qu'un seul pseudogène (gène dégénéré). Ce transfert est un événement récent, au sein des crucifères, après la divergence entre Arabidopsis et Brassica napus. Aucun intron n'est décelé à la jonction de la préséquence indispensable de ciblage vers la mitochondrie, On trouve par contre un intron dans la partie 3' non codante entre le messager est la séquence de polyadénylation. P Figueroa et al.; Molecular & General Genetics 262 (AUG99) 139-144.

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Le remaniement de familles de gènes en tandem peut être assuré par une recombinaison inégale lors de la méiose. Ceci a été étudié chez Arabidopsis avec un groupe synthétique de gènes de la petite sous-unité de la ribulose bisphosphate carboxylase avec le gène RBCS1B débarrassé de toutes séquences régulatrices amont et donc silencieuses mais fusionné avec un gène luc de luciférase, suivi des gènes normaux RBCS2B et RBC3B

On a ensuite détecté les graines exprimant la luciférase à la suite d'une recombinaison avec l'un des deux gène normaux. Trois graines par millions examinés étaient luminescentes. L'événement existe, mais il est rare. JG Jelesko et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (31AUG99) 10302-10307.

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La séquence complète du génome chloroplastique de 200 799 pb. d'une algue verte primitive, Nephroselmis olivacea (une Prasinophycée) a été établie. On peut ainsi espérer avoir un aperçu de la structure des génomes chloroplastiques ancestraux. Le génome chloroplastique de Nephroselmis contient 127 gènes et il est effectivement plus complet que les génomes chloroplastiques actuellement séquencés. M Turmel et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (31AUG99) 10248-10253.

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Les vecteurs

La faible fréquence des recombinaisons homologues chez les plantes est un réel handicap, mais on me signale une publication que j'ai ratée : G Shalev G et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (22JUN99) 7398-7402, qui décrit une augmentation de 12 fois de la fréquence de la recombinaison somatique par expression de la résolvase bactérienne RuvC. Elle accroît de 56 fois la fréquence de recombinaison entre plasmides cotransférés. Il reste à démontrer une recombinaison avec des séquences génomiques.

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L'utilisation des chimères ARN/ADN de Kimeragen commencent à faire surface, malgré les difficultés techniques rencontrées par les utilisateurs. Les chercheurs de Pioneer Hi-Bred décrivent comment ils ont modifié de façon site-spécifique deux cibles dans le gène de l'acétohydroxyacide synthase du maïs les rendant résistantes aux imidazolinones ou sulfonylurées. T Zhu et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (20JUL99) 8768-8773. L'efficacité est de 10-4 soit mille fois mieux que la recombinaison homologue normale chez les plantes.

On trouve dans le même numéro un article des chercheurs de la Samuel Roberts Noble Foundation utilisant la même technique dans l'acétolactate synthase du tabac dont ils ont modifié le codon de la proline 196 et dans une GFP inactivée qu'ils ont réactivé par délétion d'une seule paire de nucléotide de cette façon. PR Beetham et al.; p. 8774-8778. Un commentaire analyse ce que cela peut apporter dans le cas des plantes. B Hohn et al.; p. 8321-8323.

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Le développement

Le gène eyes absent (eya) de la drosophile est nécessaire, avec sine oculis (so), à la formation de l'œil. En son absence, les précurseurs de la rétine se livrent à une apoptose très tôt au cours de la différenciation. eya régule l'activité de decapentaplegic et wingless. On le retrouve chez les céphalopodes et chez les vertébrés avec le même rôle. On vient de le retrouver chez le riz, OSEya1, localisé entre le gène waxy et le télomère du bras court du chromosome 6. Il est exprimé dans l'embryon, l'apex de la tige et dans le caryopse. Y Takeda et al.; Molecular & General Genetics 262 (AUG99) 131-138.

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Le gène Dwarf 1 du riz a été cloné et code une protéine liant le GTP (G-proteins). Celle-ci joue probablement un rôle dans la transmission du signal gibberelline, car les mutants sont nains à cause d'une insensibilité aux gibbérellines. M Ashikari et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (31AUG99) 10284-10289

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Le gène ROTUNDIFOLIA3 (ROT3) d'Arabidopsis code un cytochrome P450 qui favorise l'élongation des cellules de la feuille et donc l'allongement de la feuille (et de pièces florales). Comment ??? GT Kim et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (17AUG99) 9433-9437.

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La régulation de la morphogenèse de la fleur d'Antirrhinum est assurée par le jeu de gènes d'identité florale des méristèmes, comme SQUAMOSA, et d'identité des organes floraux comme DEFICIENS ou GLOBOSA. On a montré, par expression chez la levure, que ces trois protéines forment des complexes ternaires par interaction de leurs extrémités C-terminales. Ce type de complexes à plusieurs protéines régulatrices est de plus en plus fréquemment révélé et ajoute une dimension supplémentaire aux systèmes de régulation. M Egea-Cortines et al.; EMBO Journal 18 (01OCT99) 5370-5379.

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La Reproduction

La famille des petites GTPases Rho joue un rôle essentiel dans l'organisation et la régulation du cytosquelette. L'une d'entre elles, Rop1, est spécifique du tube pollinique dont elle régule l'élongation. Elle se concentre à l'extrémité du tube et pilote le gradient de Ca++ qui s'y établit. H Li et al.; Plant Cell 11 (SEP99) 1731-1742.

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Les gènes exprimés lors du développement du grain de pollen chez le colza ont été étudiés par les chercheurs de l'INRA à Versailles. Trois cDNAs fortement et spécifiquement exprimés dans ces conditions sont analysés, plus particulièrement dans le cas de l'un d'entre eux. Celui-ci code une protéine de 23,4 kDa qui est soit pariétale, soit interagissante avec le cytosquelette. A Fourgoux-Nicol et al.; Plant Molecular Biology 40 (JUL99) 857-872.

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Alors que chez la levure et les animaux, le gène DMC1 est indispensable à un appariement correct et à la recombinaison entre chromosomes homologues, son inactivation par insertion d'un T-DNA chez Arabidopsis, entraîne certes une stérilité due à une distribution aléatoire des chromosomes au cours de la méiose aussi bien mâle que femelle, mais la méiose s'achève. F Couteau et al.; Plant Cell 11 (SEP99) 1623-1634.

Les gènes SKP1 détectés chez l'homme et la levure régule le cycle mitotique. On détecte neuf homologues chez Arabidopsis (ASK1 à 9). L'insertion d'un transposon Ds dans ASK1 entraîne une mutation mâle stérile. Ceci est probablement dû au fait que, chez cette plante, ce gène code une protéine nécessaire à la séparation des chromatides homologues lors de la méiose, cette fois. Yang M et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (28SEP99) 11416-11421.

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La protéine ORF138 provoque la stérilité mâle cytoplasmique Ogura chez le colza. La restauration de la fertilité par gène nucléaire Rfo a été étudiée par les chercheurs de l'INRA à Versailles. La protéine codée par Rfo intervient dans la stabilité de la protéine ORF138. M Bellaoui et al.; Plant Molecular Biology 40 (JUL99) 893-902.

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Un gène de glycoprotéine SLG (S locus glycoprotein), SLG43 de Brassica rapa, a été introduit chez un cultivar japonais autocompatible, Osome. Ce cultivar contient les allèles S52 et S60, qui sont codominants sur le stigmate, alors que S52 est dominant par rapport à l'allèle S60 sur le pollen. S43 est récessif par rapport à S52 et codominant avec S60 sur le stigmate. L'analyse de la cohabitation de ces trois allèles indique que si les SLG sont nécessaires à l'expression de la spécificité de l'haplotype (donc de la possibilité d'une fécondation ou non par un pollen donné), l'introduction d'un nouveau gène SLG n'influe pas, à lui tout seul, sur la spécificité de l'haplotype au niveau du stigmate. T ÒTakasaki et al.; Plant Molecular Biology 40 (JUL99) 659-668.

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La maturation des fruits

Un chercheur de Wageningen a décrit au Microarray Meeting du 22 au 25 Septembre à Scottsdale comment il a identifié 200 gènes exprimés au cours de la maturation de la fraise grâce aux techniques de microarrays. Il va s'intéresser aux gènes sous la commande des hormones. E Marshall; Science 286(15OCT99) 445.

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Les Réserves des Plantes

On trouvera dans V Planchot; Biofutur 192 (SEP99) 40-43 un article sur la production des amidons modifiés, et dans AM Smith; Current Opinion in Plant Biology 2 (JUN99) 223-229, une revue sur les dernières données sur la production des amidons dans les plantes, domaine encore bien incertain.

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La suppression de l'expression du gène de l'hexokinase 1 chez la pomme de terre entraîne une accumulation d'amidon dans les feuilles, mais pas dans le tubercule qui n'est pas modifié quant à sa teneur en saccharides. Les données confirment bien que le glucose est le produit primaire de l'hydrolyse temporaire de l'amidon avant la formation du saccharose. J Veramendi et al.; Plant Physiology 121 (SEP99) 123-134.On trouvera, par ailleurs, dans le même numéro une revue sur le rôle des invertases chez les plantes. A Sturm; p.1-8.

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Les gènes codant les enzymes ramifiantes de l'amylopectine (starch-branching enzymes SBEI, SBEIIa et SBEIIb) du maïs ont des patrons d'expression assez différents suivant les tissus. L'analyse des séquences amont régulatrices du gène codant SBEI montre que si les 2.2 kb entre -2,190 +27 par apport au site d'initiation de la transcription suffisent à permettre la transcription, l'addition de la partie transcrite entre +28 et +228, comportant les premiers exon et intron stimulent fortement l'expression dans des cellules d'albumen en culture. Deux éléments rapprochés, critiques pour l'expression, sont situés entre -314 et -295, et entre -284 et -255. La région -314 à -145 est essentielle pour donner lieu à une expression de Sbe1 en présence de sucre. La G-box située entre -227 et -220 semble être la cible du facteur de transcription EmBP-1. Kim KN et al.; Plant Physiology 121 (SEP99) 225-236.

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L'US Patent 5 942 659 a été octroyé à l'Institut National Polytechnique de Toulouse, pour le montage de plantes oléagineuses dont les graines contiennent une lipase libérée lors du triturage, permettant ainsi une production directe d'acides gras. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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La Physiologie des Plantes

Une revue sur le pompage par les plantes des nutriments du sol est parue avec RE Hirsch et al.; Trends in Biotechnology 17 (SEP99) 356-361. La revue porte sur les nitrates, le potassium, le phosphore et le fer; elle ne concerne donc pas seulement une meilleure utilisation des engrais, mais aussi la qualité nutritionnelle des produits végétaux. L'identité de très nombreux transporteurs cellulaires impliqués dans ce pompage a été établie au cours des dernières années. Le passage spontané des ions dépend, à la fois, de leurs concentrations dans le sol et dans le cytoplasme, ainsi que du potentiel de membrane (celui-ci pouvant être très fort dans les racines (<-200mV).

La dépendance de la capture vis-à-vis de la concentration de la plupart des ions suit une cinétique complexe, et on n'est pas très au clair sur ce sujet, peut est-ce dû à la multiplicité des canaux ou des cellules intervenantes. Mais on a montré que l'implantation d'un seul transporteur chez la levure ou l'oocyte de xénope entraine les mêmes cinétiques complexes.

Les plantes absorbent l'ion nitrate grâce à deux familles de protéines NRT1 et NRT2 sur une large gamme de concentrations. Ceci est permis par un système permanent (constitutif) à haute affinité, et deux systèmes à faible affinité, l'un inductible et l'autre constitutif. La famille NRT1 comporte des systèmes inductibles (comme CHL1) et constitutifs. CHL1 permet un transport à forte affinité (donc fonctionnant à de faibles concentrations) et faible affinité. Les gènes codant la famille NRT2 n'ont aucune homologie avec ceux codant les NRT1, et constituent des transporteurs inductibles à forte affinité. Tous deux assurent un cotransport d'un NO3 pour deux protons.

Deux raisons plaident en faveur d'une amélioration de cette capacité : d'une part, un tiers des engrais azotés n'est pas utilisé par les plantes et, d'autre part, ce tiers n'est pas retenu par les sols et passe dans les nappes phréatiques ou les cours d'eau. Or il faut quand même répandre des engrais du fait des effets importants des carences en azote.

La surexpression de transporteurs ayant un effet sur le transport chez les plantes n'a, pour l'instant, pas donné lieu à publication. Cela découle probablement du manque de connaissances sur le sort de l'azote dans la plante. On a, en effet, constaté (sans pouvoir l'expliquer) que les nitrates une fois absorbés peuvent être relâchés dans le sol. Il faut également remarquer que l'azote est aussi un signal de morphogenèse. La carence en azote entraine, en effet, une prolifération des racines latérales. Celle-ci est liée à l'activité d'un facteur de transcription, ANRI.

Dans le cas du potassium, des concentrations jusqu'à µMolaires ne nécessitent pas d'énergie autre que le "y. Le canal AKTI exprimé surtout dans les racines assure ce transport. Il existe cependant des transporteurs actifs (utilisant de l'énergie pour pomper le potassium. Le transporteur HKT1 inductible du blé assure un transport à des concentrations du sol avoisinant le nMolaire. Il doit fonctionner en association avec un transport de sodium. D'autres transporteurs potentiels sont codés par les gènes KUP, dont certains sont fortement exprimés dans les racines et répondent à une carence de potassium, sont connus mais il faut attendre l'analyse de mutants de ces gènes pour établir les contributions respectives des deux familles de transporteurs. Dans la mesure où le potassium circule bien dans les sols et que les concentrations disponibles suffisent dans un sol bien entretenu il ne semble pas nécessaire de modifier ces systèmes de transport. Il subsiste un problème résidant dans le fait que certains de ces systèmes sont certes spécifiques de K+ mais que, quand la concentration en Na+ est forte (50-100 mM dans les sols arides ou semi-arides), ils transportent également le sodium et excluent le potassium. On dispose de mutants des canaux à potassium et de HKT1 moins sensibles à cet effet sodium.

Dans la plupart des sols cultivés le phosphore est en partie complexé sous forme organique, et beaucoup de plantes le mobilisent par des phosphatases sécrétées. Leurs gènes n'ont cependant pas encore été clonés.

De plus le phosphate inorganique est peu soluble et les plantes doivent sécréter des acides organiques variés pour le solubiliser. C'est un facteur limitant important, surtout dans les sols tropicaux. Sa concentration va de 1 µM dans les sols non fertilisés, à 1 mM dans les sols entretenus. La production des acides organiques a surtout visé la tolérance des plantes à l'aluminium (critique dans certaines zones tropicales), mais devrait pouvoir améliorer la mobilisation du phosphore. Cela n'a, cependant, pas été essayé. Une analyse chez des écotypes d'Arabidopsis montre que le seuil d'extraction varie de 30 à 120 nM. Les gènes de transporteurs ont été identifiés à partir de séquences de transporteurs de champignons filamenteux. Ces gènes sont inductibles et exprimés dans les racines. Ce sont probablement des co-transporteurs de protons. Si la variation du seuil dépend du transporteur, on devrait pouvoir, par transfert des transporteurs adéquats en fonction des sols, améliorer cette mobilisation. L'opération n'a été réalisée, pour l'instant, qu'en laboratoire.

Le fer ferrique est quasiment insoluble à pH neutre ou alcalin. On considère qu'environ trois milliards d'humains souffrent de carence en fer.

Les plantes utilisent deux stratégies pour le mobiliser et l'importer. L'une consiste à acidifier le sol puis à chélater le fer et enfin le réduire grâce à des Fe3+-chélate réductases. Ainsi le gène IRTI d'Arabidopsis code un transporteur de Fe2+. Il est exprimé dans la racine, induit par une carence en fer et corégulé avec une Fe3+-chélate réductase (FR02). Les espèces efficaces dans les conditions de carences (comme certaines tomates) présentent des différenciations corticales de la racine, avec des cellules excrétant beaucoup de protons et de composés phénoliques qui disparaissent quand la carence est corrigée. L'autre stratégie est celle des graminées qui produisent des peptides sidérophores (acides mugénéiques) qui chélatent le fer et le transportent dans le cytoplasme. On commence à démêler la synthèse de ces sidérophores et à cloner les gènes codant leurs transporteurs. Le problème est que le fer en excès est toxique. Son importation est donc fortement régulée. Tant qu'on n'aura que des idées très vagues sur ces régulations, il sera difficile, sauf coup de chance, de monter des plantes plus efficaces. Une des idées a été de faire exprimer chez le riz, avec succès, la ferritine de soja sous la commande d'un promoteur spécifique du grain (F Goto et al.; Nature Biotechnology 17 (FEB99) 282-286).

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La circulation de messagers par le phloème est une idée avancée par certains qui y voient un moyen original de régulation chez les plantes. Un messager particulier, celui de NACP de la courge (une protéine faisant partie d'une famille dont certains membres sont impliqués dans le développement du méristème apical), se retrouve dans les cellules compagnes du phloème dans la plupart des tissus. On le voit passer à travers des hétérogreffes permettant de distinguer les deux messager du greffon et du porte greffe. R Ruiz-Medrano et al.; Development 126, 20 (1999) 4405-4419.

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La protéine GIGANTEA code une protéine membranaire. S Fowler et al.; EMBO Journal 18 (01SEP99) 4679-4688.

Le gène GIGANTEA (GI) d'Arabidopsis intervient dans la détermination de la photopériode de floraison (voir le bulletin d'Octobre). Des mutations de ce gène entraînent, en dehors d'une modification du rythme circadien, une insensibilité à la photopériode. GI code une protéine transmembranaire à expression circadienne dont la périodicité est modifiée, parallèlement à celle des gènes LHY et CCA1 liés à l'horloge, (pour LATE ELONGATED HYPOCOTYL et CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1) chez les mutants gi. GI est donc nécessaire au maintien de l'amplitude du rythme avec ses conséquences et il doit participer à une boucle de rétroaction du rythme circadien. DH Park et al.; Science 285 (03SEP99) 1579-1582.

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La surexpression d'une protéine de fusion du phytochrome A-GFP (green fluorescent protein) du riz ainsi que du phytochrome B-GFP du tabac chez le tabac permet une signalisation normale (et un suivi de l'expression). phyA-GFP et phyB-GFP sont localisés dans le cytosol à l'obscurité et sont transportés dans le noyau après illumination en lumière rouge. Ils se différencient par le fait que le rouge lointain inhibe le transport du phyB-GFP. Cette partition dans le transport entre les deux signaux doit intervenir dans la régulation du signal lumineux. S Kircher et al.; Plant Cell 11 (AUG99) 1445-1456.

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La peroxydase anionique de la pomme de terre intervenant dans la cicatrisation des blessures par subérisation (formation de liège) a été caractérisée. L'oxydation des hydroxycinnamates est préférée à celle des alcools correspondants. MA Bernards et al.; Plant Physiology 121 (SEP99) 135-146.

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Les oligogalacturonates ou du chitosane (ß-1,4-glucosamine) réduisent l'ouverture des stomates. C'est une réponse de défense contre les agresseurs induite par le peroxyde d'hydrogène produit par les cellules de garde sous l'action des éliciteurs. S Lee et al.; Plant Physiology 121 (SEP99) 147-152.

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Les Pathogènes des Plantes et les Mécanismes de Défense

On trouvera dans A Schaller; Plant Molecular Biology 40 (JUL99) 763-769, et CA Ryan et al.; Annual Review of Cell and Developmental Biology, 1998, 14 (1998) 1-17, deux revues sur la réponse "systémine" aux signaux oligopeptidiques.

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Les gènes de résistance et leurs origines ont été très étudiés depuis le séquençage de plusieurs d'entre eux. Leur évolution est un sujet qui se développe beaucoup comme l'ont montré les débats aux 13th John Innes Symposium du 20-23 Juillet à Norwich et le 9th International Congress of Molecular Plant-Microbe Interactions 25-30 Juillet à Amsterdam dont on trouvera un compte-rendu clair dans J Dangl; Nature 401 (07OCT99) 543-544.

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Des chercheurs d'Orsay se sont, de leur côté, intéressé aux corrélations pouvant exister entre l'évolution moléculaire des gènes de résistance chez Phaseolus vulgaris, et la co-évolution, au niveau des populations, du haricot et de son champignon pathogène, Colletotrichum lindemuthianum, l'agent de l'anthracnose.

Ils ont utilisé 26 souches du pathogène et 48 variants du haricot récoltés dans les trois centres de diversification. Dans tous les couples coexistant géographiquement, la plupart des souches fongiques ont réussi à surmonter les résistances locales (sinon elles n'existeraient plus) mais les gènes de résistance à des souches étrangères persistent, ce qui signifie qu'après avoir été débordés dans des localités différentes, ils subsistent néanmoins dans le génome au cours de l'évolution. Etudiant des souches recombinantes inbred avec des génomes représentatifs des souches andines et mésoaméricaines, les auteurs ont cartographié les complexes de gènes de résistances correspondants. Ils ont trouvé un groupe de gènes comprenant les deux spécificités de résistance indiquant ainsi que ce locus était présent avant la divergence des deux populations. Ce locus s'est révélé très complexe et la diversification des résistances n'est pas très facile à comprendre. V Geffroy et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 12 (SEP99) 774-784.

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Les protéines WRKY identifiées chez le persil sont des facteurs de transcription régulant l'expression de gènes de défense. Elles se fixent, in vitro, sur des sites spécifiques (W box) des promoteurs des gènes PR-10 (Pathogenesis-Related 10). Des éliciteurs fongiques provoquent une activation rapide de cette commande chez les plantes. Il y a donc un des éléments des réponses précoces de défense. T Eulgem et al.; EMBO Journal 18 (01SEP99) 4689-4699.

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Un mutant dominant grâce à un gain de fonction d'Arabidopsis présente des défenses renforcées. C'est acd6 (accelerated cell death 6) Ce phénotype est supprimé si on élimine l'acide salicylique (SA) par expression de la salicylate hydroxylase. Les symptômes observés chez les mutants acd6 sans SA comprennent la suppression de phénomènes non déclenchés par une application de SA à des plantes normales. Ceci indique que SA joue avec un second signal pour donner ces effets. Ils peuvent être mimés par addition du BTH [benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothioic acid] stimulateur non spécifique des défenses de Novartis. Le gène acd6 intervient en partie par une voie NPR1 (NONEXPRESSOR OF PR 1) indépendante qui confère une résistance à Pseudomonas syringae. DN Rate et al.; Plant Cell 11 (SEP99) 1695-1708.

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On sait que la colonisation de la rhizosphère d'Arabidopsis par Pseudomonas fluorescens WCS417r provoque une résistance systémique induite à Pseudomonas syringae pv.tomato. Ce type de résistance diffère de la résistance systémique acquise (SAR) par le fait qu'elle ne fait pas intervenir l'acide salicylique. Elle fait, par contre, intervenir l'éthylène et sa voie complète de signalisation. L'éthylène doit être produit au voisinage des bactéries inductrices de la résistance pour être efficace. M Knoester et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 12 (AUG99) 20-27.

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La petite protéine G Rac intervient dans la production de peroxyde d'hydrogène et la mort cellulaire chez le riz. Ces protéines ont décidément beaucoup de rôles dans la cellule. T Kawasaki et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (14SEP99) 10922-10926.

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Des tomates surexprimant le gène de la systémine expriment également fortement celui de la calmoduline. On savait que de telles tomates expriment plusieurs gènes de réponses aux blessures, même en leur absence. Cette production est synchrone de celle des composants de signalisation impliqués dans les défenses. DR Bergey et al.; Plant Molecular Biology 40 (JUL99) 815-823.

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Des cannes à sucre transgéniques détoxifiant l'albicidine grâce à l'expression d'un gène bactérien (albD), ont été montées par des chercheurs de Brisbane. Elles deviennent résistantes à la leaf scald disease. Le gène a été prélevé chez une bactérie utilisée comme biopesticide dans ce cas. L Zhang et al.; Nature Biotechnology 17 (OCT99) 1021-1024.

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Le système de sécrétion de type III de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria permet de sécréter deux protéines hétérologues, l'une de Ralstonia solanacearum, l'autre de Pseudomonas syringae pv. glycinea mais surtout la protéine YopE de Yersinia pseudotuberculosis, un pathogène de mammifères. O Rossier et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (03AUG99) 9368-9673.

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Erwinia carotovora est encouragée à sécréter des exoenzymes dégradant les parois végétales en présence de la phéromone liée au quorum sensing, la N-(3-oxohexanoyl)-L-homosérine lactone (OHHL). On sait, par ailleurs, que l'hexanoylhomosérine lactone (HHL) déclenche la production d'antibiotiques phénazine chez le biopesticide Pseudomonas aureofaciens 30-84. L'expression, chez des plantes, de gènes permettant la production de ces deux phéromones dans le chloroplaste, entraîne une communication entre plante et bactéries du sol sensibles à ces phéromones. C'est ce qui a été fait chez des tabacs transgéniques. On devrait donc pouvoir jouer sur ce facteur pour protéger les plantes. RG Fray et al.; Nature Biotechnology 17 (OCT99) 1017-1020.

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Les pectinases d'Erwinia chrysanthemi sont un des facteurs majeurs de virulence de cette bactérie. Parmi elles, on a identifié deux pectates lyases alcalines, pelD et pelE, considérées comme particulièrement importantes. Leur production est soumise à régulation par plusieurs régulateurs dont le répresseur KdgR et l'activateur CRP (cyclic AMP receptor protein) combiné au cAMP ainsi que l'atténuateur PecS. CRP et ARN polymérase se fixent de façon coopérative sur les régions régulatrices des deux gènes, tandis que PecS freine la fixation de CRP et du complexe CRP-polymérase, KdgR ne faisant que stabiliser la fixation de PecS. C Rouanet et al.; Journal of Bacteriology 181,19 (OCT99) 5948-5957.

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Un des cDNAs d'Arabidopsis caractérisés lors d'une attaque par Erwinia carotovor avait été celui d'un allène oxyde synthase qui intervient dans la biosynthèse des jasmonates. Des éliciteurs de cette réponse sont les oligogalacturonides libérés des parois par les enzymes d'Erwinia. C Norman et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 12 (JUL99) 640-644.

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Le faba bean necrotic yellows virus de la fève a besoin d'un autre virus (virus auxiliaire) pour pouvoir être transmis par son aphide vecteur, Acyrthosiphon pisum. AW Franz et al.; Virology 262 (15SEP99) 210-219.

Acyrthosiphon pisum est porteur d'une bactérie symbiotique. Le même groupe vient de séquencer les 36524 pb d'un de ses bactériophages, APSE-1 (A. pisum secondary endosymbiont 1). F van der Wilk et al.; Virology 262 (15SEP99) 104-113.

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Le complexe de l'ARN du virus de la mosaïque du tabac et de sa protéine de mobilisation ne peut être traduit in vitro, alors qu'il l'est in-vivo. Des chercheurs de Moscou ont montré que c'était dû au fait, qu'in vivo, une phosphorylation de la protéine de mobilisation entraîne sa traductibilité. OV Karpova et al.; Virology 261 (15AUG99) 20-24.

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Usuellement, les viroïdes sont considérés comme ayant une structure en bâtonnets. Le chrysanthemum chlorotic mottle viroïd (CChMVd) consiste en un ARN de 398-399 nucléotides pouvant adopter une structure en marteau dans ses deux brins. Une souche non pathogène (bien que se multipliant) et protectrice a été identifiée par Northern-blot. La substitution UUUCÕGAAA dans une des quatre boucles suffit pour assurer ce changement de comportement. M de la Pena et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (17AUG99) 9960-9965.

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Les protéases peuvent contribuer à la pathogénicité des champignons. C'est ce qu'on a démontré pour une subtilisine de Magnaporthe poae qui aggrave les lésions observées sur sa cible, Poa pratensis. L Sreedhar et al.; Gene 235 (22JUL99) 121-129.

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Le cDNA d'une ß-1,4-endoglucanase de juvéniles du stade 2 de Meloidogyne incognita (un nématode à galle) a été séquencé. Le gène correspondant est exprimé à ce stade juvénile qui est une étape migratrice au cours du développement chez les mâles, ainsi que chez les femelles adultes sédentaires. Elle sert probablement, dans ce cas, lors de l'oviposition. MN Rosso et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 12 (JUL99) 585-591.

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MAGGY, un rétrotransposon à LTR (Long Terminal Repeats) de Pyricularia grisea (encore un autre nom de Magnaporthe grisea) transpose dans d'autres champignons filamenteux, Colletotrichum lagenarium et Pyricularia zingiberi, probablement chez bien d'autres. Il le fait en passant bien par une forme ARN (un intron artificiellement inséré est éliminé). Il devrait pouvoir être utilisé pour le marquage et le séquençage de gènes. H Nakayashikia et al.; Genetics 153 (OCT99) 693-703.

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Les Symbioses

On trouvera dans MJ Harrison; Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology 50 (1999) 361-389, une revue sur les aspects moléculaires et cellulaires de la symbiose mycorrhizienne arbusculaire et des Glomales (les champignons impliqués).

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L'analyse des flux de carbone chez Glomus intraradices, un champignon mycorrhizien arbusculaire, symbiote obligatoire, ainsi que chez sa spore en germination, qui est sa seule forme libre, indique que les sucres sont synthétisés à partir des lipides de réserve. Le glucose et le fructose, mais pas le mannitol, peuvent être absorbés, qu'il existe une fixation à l'obscurité du CO2 importante et que le champignon peut fabriquer ses acides aminés. B Bago et al.; Plant Physiology 121 (SEP99) 263-272.

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La transduction du signal Nod fait intervenir une élévation du Ca++ cytoplasmique à partir de sources extracellulaires. Il constitue un second message. HH Felle et al.; Plant Physiology 121 (SEP99) 273-280.

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Le mutant T482 de Sinorhizobium meliloti CXM1-105 présente une efficacité symbiotique améliorée. Il porte une insertion du transposon Tn5 dans le méga plasmide 1. Trois gènes sont présents au voisinage de l'insertion, eglC qui code une endoglucanase, cya3 qui code une adenylate cyclase et syrB2 qui code une protéine devant être impliquée dans des interactions entre protéines et qui réprime sa propre transcription ainsi que celle de cya3. Tn5 est inséré entre les gènes à transcription divergente eglC et syrB2 éliminant l'expression de eglC et diminuant celle de syrB2 ainsi que de eglC qui est situé en aval de syrB2. LA Sharypova et al.; Molecular & General Genetics 261 (JUL99) 1032-1044.

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Sinorhizobium meliloti 1021 répond à un signal biotine extérieur provenant de la luzerne grâce au locus bioS. Une mutation dans ce locus accroît le pompage de biotine et la phase stationnaire tandis qu'il diminue la compétitivité en présence de biotine. Ce gène code probablement un régulateur de type LysR, comme NodD ou SyrM. On ne l'a pas trouvé en dehors des Sinorhizobium. EB Heinz et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 12 (SEP99) 803-812.

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Le haricot Phaseolus vulgaris peut être nodulé par de nombreux Rhizobium et reconnaît donc autant de facteurs Nod. En faisant exprimer les gènes de sulfatation des facteurs Nod, nodHPQ, de Rhizobium tropici CFN299 chez Azorhizobium caulinodans, on constate que les transconjugants ainsi montés sulfatent complètement leurs facteurs Nod comme attendu, avec un arabinose à l'extrémité réductrice. En jouant sur les différentes décorations possibles de cette extrémité, on peut montrer que l'efficacité de la nodulation du haricot est favorisée, en ordre décroissant, par la présence d'un fucose, d'un arabinose ou un sulfate et, enfin, un hydrogène. T Laeremans et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 12 (SEP99) 820-824.

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L'étude de l'expression d'ENOD20, un gène précoce de nodulation, de Medicago truncatula a été réalisée par une chimère MtENOD20-GUS (Mt pour M.truncatula) chez des Medicago varia transgéniques qui se révèlent un bon outil d'analyse. Elle a lieu, classiquement, sous l'influence des facteurs Nod de Sinorhizobium meliloti, et dans les cellules du cortex interne en division et dans les cordons infectieux. Des mutants de S. meliloti, chez qui l'infection est découplée de la nodulation, confirment bien que cette transcription est liée à l'activation corticale. Celle-ci est déclenchée en 12 à 24 h par du facteur Nod purifié agissant à 10-11 M. La longueur de la chaîne acyl du lipo-chitooligosaccharide est importante pour cette activation. V Vernoud et al.; Molecular Plant Microbe Interactions 12 (JUL99) 604-614.

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Le transfert de plasmides Ti d'Agrobacterium vers la flore du sol a été analysé par des chercheurs de Lyon. Le transfert est effectivement observé et, dans leur expérience, c'est surtout des espèces étroitement apparentées à Sinorhizobium qui donne l'essentiel des transconjugants (exprimant le plasmide transféré). S Teyssier-Cuvelle et al.; Molecular Ecology 8 (AUG99) 1273-1284.

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Les productions hétérologues

L'article plusieurs fois évoqué dans la presse sur la synthèse de poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalérate) dans les chloroplastes des graines de colza et de feuilles de choux est un véritable tour de force car il a fallu exprimer trois gènes bactériens de synthèse du poly (3-hydroxybutyrate) mais également dévier le métabolisme des acides aminés pour alimenter le pool de propionyl-CoA, normalement réduit, pour produire le 3-hydroxyvalérate. Et pourtant la production reste insuffisante et il faudra exprimer au moins deux autres gènes pour l'améliorer. On comprend les hésitations de Monsanto à poursuivre l'aventure. C'est d'ailleurs probablement vrai pour la plupart des caractères qualitatifs que l'on souhaiterait mettre en avant pour promouvoir les plantes transgéniques. S Slater et al.; Nature Biotechnology 17 (OCT99) 1011-1016.

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Axis Genetics a montré que le cowpea mosaic virus (CPMV) est un très bon vecteur pour les antigènes vaccinants exprimés chez les plantes. L'efficacité d'un vaccin contre la protéine F de membrane externe de Pseudomonas aeruginosa a été démontrée chez la souris. FR Brennan et al.; Microbiology 145 (AUG99) 2061-2067. Cela n'a pas empêché la société de ne pas arriver à lever des fonds indispensables au développement de tels vaccins. (voir le chapitre Vie des sociétés).

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SemBiosys Genetics, une petite compagnie canadienne utilise les oléosines (protéines associées aux huiles dans les graines des oléagineux) pour produire des protéines hétérologues dans ces graines. La firme exploite les brevets de l'University of Alberta à Calgary. Ces protéines sont présentes, chez le colza sous trois isoformes de 19 kDa. Les recherches sur les promoteurs sont plutôt concentrées au John Innes Centre. La société recherche des partenaires pour développer des nouveaux produits.

On trouve parmi ses partenaires actuels Dow AgroSciences qui est un actionnaire minoritaire. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Les plantes recombinantes

L'US Patent 5 942 659 a été octroyé à l'Institut National Polytechnique de Toulouse, pour le montage de plantes oléagineuses dont les graines contiennent une lipase libérée lors du broyage, permettant ainsi une production directe d'acides gras. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Pioneer Hi-Bred International et Dow AgroSciences envisage d'introduire aux Etats-Unis leur maïs résistant au corn root worm (Diabrotica virgifera). Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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Les Insectes et leur Maîtrise

Celera a annoncé la fin du séquençage proprement dit du génome de la drosophile entrepris avec Berkeley (voir le bulletin d'Avril) et va publier les résultats au début de 2000. Il reste une phase d'assemblage définitif, pour laquelle Craig Venter est délibérément optimiste. Nature 401 (16SEP99) 204.

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Le système en cascade spaetzle/Toll/cactus constitue une défense majeure des insectes contre les champignons (voir le bulletin de Septembre). Si on inactive le gène d'un inhibiteur de protéases sérique de la Drosophile, Spn43Ac (serine protease inhibitor), on obtient une expression constitutive (permanente) de ce système de défense. Spaetzle a besoin, en effet, d'être activé par protéolyse pour jouer son rôle ligand. C'est cette forme active qui devient permanente. Spn43Ac régule donc négativement la réponse. EA Levashina et al.; Science 285 (17SEP99) 1917-1919.

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La résistance aux organophosphorés est liée, au moins chez certains insectes, à la perte d'une activité carboxylestérase et à l'acquisition d'une activité organophosphate hydrolase. On avait montré en 1997 que la substitution d'un seul aminoacide assure cette conversion pour une seule et même enzyme, avec une substitution Gly137-->Asp dans une estérase de (Lucilia cuprina (RD Newcomb et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94 (08JUL97) 7464-7468). Le même groupe australien montre que c'est également le cas chez la mouche domestique, avec la même substitution. C Claudianos et al.; Insect Biochemistry & Molecular Biology 29 (AUG99) 675-686.

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Les Wolbachia sont des rickettsies inféodées aux insectes et associées à des perturbations de la reproduction (voir les numéros de Février, Juillet et Septembre). Des chercheurs de Wageningen ont étudié leur évolution en se basant sur un gène qui semble évoluer beaucoup plus vite que les autres gènes classiquement utilisés. C'est le gène wsp. L'arbre évolutif de cette bactérie ne coïncide pas avec les phénotypes entraînés par leur présence (incompatibilité cytoplasmique, thélytoquie ou féminisation). De plus on a ainsi pu déceler un transfert horizontal probable du ver de farine vers Trichogramma (sa guêpe parasitoïde). MM Van Meer et al.; Insect Molecular Biology 8 (AUG99) 399-408.

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Orseolia oryzae est la mouche des galles du riz, et c'est une peste majeure dans un grand croissant de l'Asie du Sud Est. Des chercheurs indiens ont typé les populations de cet insecte d'abord par RAPD puis par SCARs (sequence characterized amplified regions). La technique permet de différencier les biotypes asiatiques et africains ainsi que les variants au sein de ces populations. Elle évite d'avoir à vérifier le comportement alimentaire des insectes. SK Behura et al.; Insect Molecular Biology 8 (AUG99) 391-397.

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Il est maintenant possible de vérifier, avec des marqueurs moléculaires, la paternité également chez les abeilles. On constate une fluctuation dans le temps, comme si le mélange des spermatozoïdes n'est pas parfait au début de la période de ponte des œufs dans la spermathèque, et qu'il se réalise progressivement au cours du temps. Aucune prééminence d'un mâle particulier n'est notable. P Franck et al.; Insect Molecular Biology 8 (AUG99) 419-421.

La gelée royale des abeilles est sécrétée par glandes céphaliques des ouvrières nourricières. Elle contient une série de protéines particulières aux fonctions inconnues. Le cDNA de l'une d'entre elles vient d'être caractérisé. Il code une protéine très voisine de la protéine qui constitue le pigment jaune de la cuticule de la Drosophile et a probablement acquis une nouvelle fonction au cours de l'évolution. S Albert et al.; Journal of Molecular Evolution 49 (AUG99) 290-297.

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On pense que la spéciation peut provenir d'incompatibilités induites par l'hybridation qui déclencherait une mobilisation de certains éléments transposables. C'est bien le cas pour les éléments P, hobo et I de Drosophila melanogaster. Cette stimulation de la transposition vient d'être vérifié pour l'élément à longues répétitions terminales Osvaldo chez des hybrides entre Drosophila buzzatii et Drosophila koepferae. M Labrador et al.; Molecular Biology & Evolution 16 (JUL99) 931-937. Le transposon a d'ailleurs été cloné et séquencé. C'est un rétrovirus apparemment fonctionnel, bien distinct des éléments gypsy. A Pantazidis et al.; Molecular Biology & Evolution 16 (JUL99) 909-921.

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Des vecteurs pour insectes dérivant des quatre familles d'éléments transposables à courtes répétitions terminales, Minos, piggyBac, mariner et Hermes, sont actuellement utilisables. Du fait d'une ubiquité assez grande de ces éléments chez les insectes, il est fort probable que le vecteur va se trouver confronté à l'un ou l'autre de ces éléments dans l'insecte cible. Le cas de Hermes et hobo (un élément de la même famille) a été étudié. Les séquences terminales de hobo et Hermes sont reconnus avec une égale efficacité par la transposase de hobo, et cette dernière permet une bonne transposition des deux éléments. Cela n'est pas vrai en sens inverse, la transposase de Hermes est très peu efficace sur hobo. P Sundararajan et al.; Insect Molecular Biology 8 (AUG99) 359-368.

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Les Biopesticides

Les protoxines de Bacillus thuringiensis doivent être clivées par les enzymes digestives de l'insecte cible pour être efficaces. La "-endotoxine Cry2Aa1, efficace sur Lymantria dispar, donne deux fragments dont l'un, celui de 58 kDa, est toxique pour la larve et un fragment de 49 kDa qui ne l'est pas. Le clivage du domaine I de la protéine de 58 kDa a lieu après une action prolongée des enzymes digestives et donne le fragment résistant à la protéolyse de 49 kDa. Le clivage a lieu juste en aval de la Tyr49 pour donner le fragment de 58 kDa et de la Leu144 pour le fragment de 49kDa. On peut empêcher ce clivage en effectuant les substitutions L144D, L144A, L144G, L144H ou L144V, et augmenter ainsi l'efficacité de la toxine. M Audtho et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4601-4605.

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Des chercheurs de Purdue ont disséqué le domaine I de la "-endotoxine cry1Ac1 de Bacillus thuringiensis. Ce dernier est indispensable à la toxicité. Ils ont travaillé sur 31 paires de bases codant une partie de l'hélice transmembranaire 4 ainsi que la boucle reliant cette hélice à l'hélice a 5. Elle s'insère probablement sous la forme d'une épingle hydrophobe dans les membranes cibles pour y créer un pore. Ces modifications ont donné des effets variables, les uns augmentant la toxicité, d'autres la diminuant ou entraînant un perte totale. Les protéines mutantes non toxiques conservent leur stabilité ainsi que leurs capacités de fixation sur la cible. L'hélice a4 a apparemment un rôle direct dans la formation du pore. AS Manoj Kumar et al.; Journal of Bacteriology 181,19 (OCT99) 6103-6107.

Les résidus Gln509, Arg511 et Tyr513 du domaine III de Cry1Ac sont impliqués dans la fixation initiale sur le récepteur digestif de Lymantria dispar, Manduca sexta et Heliothis virescens. Cette fixation ne devient limitante que quand on la déprime de cinq fois. MK Lee et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4513-4520.

Les acides aminés du domaine III de la "-endotoxine Cry1C de Bacillus thuringiensis impliqués dans la spécificité vis-à-vis de Spodoptera exigua et, dans une certaine mesure de Manduca sexta, ont été identifiés en utilisant des toxines hybrides. RA de Maagd et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4369-4374.

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Les chercheurs de l'Institut Pasteur ont identifié le récepteur de la toxine binaire de Bacillus sphaericus sur les cellules intestinales du moustique Culex pipiens. C'est une protéine de 60 kDa. avec une ancre glycosyl-phosphatidylinositol. C'est probablement une a-glucosidase. MH Silva-Filha et al.; Insect Biochemistry & Molecular Biology 29 (AUG99) 711-721.

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L'analyse d'une population de Pseudomonas fluorescens DR54-BN14, souche intervenant comme agent de biorégulation de la flore racinaire a été marquée à la protéine fluorescente verte pour suivre son sort dans le sol. En réalité la pauvre bête donne tous les signes de carences. A saturation d'humidité 80% des cellules arrivent cependant à survivre plus ou moins, tandis que dans un sol sec la majorité d'entre elles ne sont plus viables. B Normander et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4646-4651.

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Horticulture Research International a identifié une toxine insecticide de Xenorhabdus nematophilus. New Scientist 163 (18SEP99) 15.

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Des chercheurs de l'University of Florida utilisent Dactylaria higginsii pour lutter contre les cypéracées (US Patent 5 945 378 relativement étroit). UAP, une filiale de ConAgra continue le développement. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Les Productions animales

Les génomes

Les chercheurs de Liège (M Georges), associés à Womack, étudient les QTLs associés à la production laitière. L'un d'entre eux avait été localisé sur le chromosome 14. Il vient d'être localisé plus finement en concentrant des marqueurs dans cette région. J Riquet et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (03AUG99) 9252-9257.

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Il existe de très nombreux transposons de type Gypsy chez les vertébrés (rétrotransposons à longues répétitions terminales). La grande majorité d'entre eux sont voisins les uns des autres. Un petit nombre d'entre eux ont des parents fongiques (le plus souvent) végétaux, ou chez les insectes. Les transferts horizontaux sont donc probablement très peu fréquents. K Miller et al.; Journal of Molecular Evolution 49 (SEP99) 358-366.

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Les vecteurs

On trouvera dans Current Opinion in Biotechnology 10 (OCT99) trois revues sur les acquisitions récentes dans le domaine des vecteurs de la thérapie génique basés sur les adénovirus (K Benihoud et al.; p.440-447), les alfavirus (S Schlesinger et al.; p.434-439) et les lentivirus (M Federico; p.448-453). On trouvera également dans ce numéro une revue sur le ciblage des vecteurs viraux et les diverses techniques utilisées (KW Peng et al.; P.454-457).

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L'expression d'un gène de sélection par résistance dans un vecteur rétroviral entraîne parfois une dépression de l'expression du gène que l'on transfère. De plus il peut induire une réponse immunitaire. On vient de montrer que la transcription réverse, qui n'aime pas les répétitions, permet d'éliminer les gènes de sélection avec une efficacité de 99%. KA Delviks et al.; Journal of Virology 73 (OCT99) 8837-8842.

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BTG International a acquis les droits exclusifs sur les vecteurs coxsackie de l'University of Nebraska. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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On sait que les protéines Rep (il y en a deux catégories, classées par taille) des adeno-associated virus (AAV) sont nuisibles pour les cellules. Il faut donc les éliminer pour obtenir des lignées productrices stables. Les grandes Rep sont nécessaires à l'empaquetage du virus. On peut cependant limiter leur expression à la seule période utile en utilisant le système de déclenchement Cre-lox. Y Ogasawara et al.; Journal of General Virology 80 (SEP99) 2477-2480.

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L'expression génique

Le récepteur des glucocorticoides active la transcription par ses deux fonctions AF-1 et AF-2, N- et C-terminales. Ces domaines interagissent avec d'autres protéines dans ce but. AF-1 est capable de recruter des facteurs de régulation activateurs comme inhibiteurs.

Les deux protéines DRIP150 et DRIP205 (vitamin D receptor-interacting protein 150 et 205) en font partie, DRIP se liant au domaine AF-1, et DRIP205 au domaine liant le ligand, associant ainsi fonctionnellement les domaines AF-1 et -2. AB Hittelman et al.; EMBO Journal 18 (01OCT99) 5380-5388.

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On admet que les récepteurs hormonaux nucléaires sont régulés par acétylation et désacétylation des histones grâce à leur association avec les enzymes correspondantes. On vient de montrer qu'une hormone induit une forte activité acétylante du domaine histone acétylase (HAT) de la protéine p300/CBP. Cette acétylation est transitoire et entraîne, paradoxalement, une atténuation de l'effet de l'hormone sur la transcription des gènes cibles. En fait, l'effet de p300/CBP est indirect, et c'est l'acétylase ACTR qui est acétylée par p300/CBP et activée. Elle acétyle alors deux lysines, et cela sépare le complexe co-activateur de la transcription de HAT des récepteurs des œstrogènes fixés sur le promoteur. C'est donc un nouvel élément dans la régulation de ce type de récepteurs. H Chen et al.; Cell 98 (03SEP99) 675-686.

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Le développement

Les C-myb et A-myb sont importants dans l'hématopoïèse et la spermatogenèse. Le rôle du troisième membre de la famille, B-myb, dans le développement était inconnu. La construction de souris "knock-out" homozygotes pour ce gène indique qu'il intervient de façon très précoce dans la formation du bouton embryonnaire. C'est d'ailleurs le seul gène de la famille qui est exprimé dans les cellules souches embryonnaires (ES cells). Y Tanaka et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (01OCT99) 28067-28070.

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Le signal Wnt est indispensable au maintien de la détermination ventrale des cellules au cours de l'embryogenèse. Son inactivation entraîne une détermi-nation dorsale. K Itoh et al.; Genes & Development 13 (01SEP99) 2328-2336.

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La protéine Patched1 (Ptc1) se lie à la protéine Hedgehog (Hh) et l'empêche ainsi d'activer ses gènes cibles. Chez les Vertébrés l'un des homologues de Hh, Sonic hedgehog (Shh) intervient dans l'établissement du plan de développement des membres). Comme les embryons homozygotes pour ce gène inactivé meurent très précocement, on ne peut étudier facilement ce mécanisme. On l'a, cependant, fait en insérant dans ces souris un gène normal induit par les métaux qui permet de compenser à volonté le défaut. L'une des fonctions de Ptc1 semble être de réprimer l'expression de Shh dans le bourgeon du membre antérieur. L Milenkovic et al.; Development 126, 20 (1999) 4431-4440.

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Chez le poulet, l'expression asymétrique de Sonic hedgehog (Shh) dans le nœud de Hensen fait partie de l'amorce de l'organisation asymétrique de l'embryon. Ceci est contesté chez les autres Vertébrés. L'utilisation de souris ou les deux homologues sont inactivés, montre des anomalies de l'organisation droite-gauche. L'une des cibles majeures de cette voie est, apparemment, le gène Lefty-1 vers lequel convergent les stimulations par Shh et l'acide rétinoïque. T Tsukui et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (28SEP99) 11376-11381.

Pitx1 et Pitx2 sont deux facteurs de transcription très voisins. Pitx2 est exprimé de façon asymétrique dans la partie gauche du mésoderme. Son inactivation dans des souris entraîne des problèmes de symétrisation des poumons et du cœur, accessoirement de morphogenèse des dents. CR Lin et al.; Nature 401 (16SEP99) 279-282.

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Les cellules précurseurs des masses ventrales et dorsales des muscles des membres migrent à partir du dermomyotome. Une série de gènes sont exprimés au cours de cette migration. Il reste à établir leurs rôles respectifs dans l'établissement du patron musculaire. L'inhibition des gènes Pax3 ou Met bloque l'étape précoce, de sorte que le rôle des autres n'est plus analysable. Les chimères caille-poulet suggéraient que les régulations autonomes de la cellule ne sont pas importantes pour la différenciation individuelle des muscles. En réalité le gène à homéobox Lbx1h permet le positionnement des cellules dans la région dorsale du membre. K Schafer et al.; Nature Genetics 23 (OCT99) 213-216.

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Le TGF-ß (Transforming growth factor-ß) peut avoir deux effets antagonistes. Il bloque la prolifération de beaucoup de types cellulaires (notamment les cellules épithéliales), tandis qu'il stimule celle de quelques autres (par exemple les fibroblastes). On ne connaissait pas encore le domaine actif de ce facteur. On vient de montrer que la séquence du 52 au 55° aminoacide est nécessaire à ces effets et constitue le site actif. SS Huang et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (24SEP99) 27754-27758.

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Le domaine extra-cellulaire du récepteur du TGF-ß joue un rôle de répression du récepteur en l'absence du ligand. HJ Zhu et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (08OCT99) 29220-29227.

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On vient de montrer que l'un des facteurs de la famille des TGF-ß, l'activine est impliqué dans la prolifération et la différenciation des kératinocytes. B Munz et al.; EMBO Journal 18 (01OCT99) 5205-5215.

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Les protéines Smad sont des transducteurs en aval des TGF-ß. Suivant le type, elles transmettent ou bloque le signal et son transport vers le noyau (voir le bulletin de juin). Ces protéines sont activées par une phosphorylation. Leur activité peut être contrée par une oncoprotéine, Ski, en recrutant le co-répresseur de la transcription CoR, et probablement son histone-désacétylase associée. K Luo et al.; Genes & Development 13 (01SEP99) 2196-2206.

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Les Smads ne se lient pas seulement entre elles pour migrer dans le noyau lors de la transduction du signal TGF-ß, mais également à des co-activateurs comme CBP/p300. E1A, une oncoprotéine d'adénovirus inhibe le signal TGF-ß en se liant à CBP/p300. Deux régions adjacentes de ce co-activateur sont nécessaires pour cela. L'une d'entre elles est la région commune entre CBP et p300, l'autre est dans une région non conservée. A Nishihara et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (01OCT99) 28716-28723.

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Les gènes des C/EBP-ß et -" (CCAAT/enhancer-binding proteins) sont exprimés de façon très précoce au cours de la différenciation des adipocytes, mais leur effet ne se fait sentir qu'à retardement. Cet effet est dû à l'activation de la transcription du gène C/EBP-a qui est lui-même l'activateur de nombreux gènes des adipocytes. Les protéines C/EBPß- se localisent au centromère quand les pré-adipocytes entrent en phase S de façon synchrone. Le site de fixation spécifique est situé dans les ADN satellites centromériques. C/EBP--  est un antimitotique, qui ne se localise au centromère que beaucoup plus tard quand la phase d'amplification clonale s'arrête et que la différenciation commence. QQ Tang et al.; Genes & Development 13 (01SEP99) 2231-2241.

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Deux types de protéases, les caspases (pour cystéine aspartases), sont impliquées dans l'apoptose. Les caspases initiatrices sont activées par autoclivage lorsqu'elles sont convenablement placées sur une trame moléculaire. Les caspases effectrices une fois activées en aval des initiatrices, vont amplifier le phénomène. La caspase-8 (initiatrice) peut agir, soit en aval sur des caspases effectrices, soit en amont vers la mitochondrie elle-même libérant de nombreux facteurs létaux. L'un d'entre eux se lie à une protéine de trame cytoplasmique appelée Apaf-1 qui peut alors se lier avec la procaspase-9 (effectrice) et l'activer en caspase qui déclenche une cascade mortelle pour la cellule (Bulletin de Mars). On admettait, par ailleurs, que les facteurs antiapoptotiques prévenaient cette liaison. On vient de montrer que l'adaptateur Apaf-1 se fixe bien sur la procaspase-9 par un domaine particulier, mais que des facteurs antiapoptotiques comme Bcl-2 ne se lient pas à Apaf-1, et ne peuvent donc pas empêcher directement, par séquestration, l'activation de la procaspase. K Moriishi et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (17AUG99) 9683-9688.

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La reproduction

La leptine a un effet stimulant sur l'axe reproducteur. Mais on ne sait pas si les niveaux physiologiques de cette hormone des adipocytes sont suffisants pour une action notable. Des chercheurs japonais ont montré qu'ils le sont sur l'hormone lutéinisante et la prolactine. H Watanobe et al.; Biochemical Biophysical Research Communication 263 (16SEP99) 162-165.

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Le récepteur de l'hormone lutéinisante (lutéotropine/choriogonadotropine ou LH/CG) est activé en présence de son ligand et déclenche une adénylyl cyclase et une phospholipase C. Les voies activées par le ligand divergent à partir du récepteur par la voie d'une activation indépendante des diverses G-proteins, Gs, Gi et probablement Gq. Utilisant une expression dans des cellules d'insectes et une transformation par des vecteurs baculovirus, des chercheurs de Berlin ont montré que le récepteur de la LH agit sur l'adénylyl cyclase par l'intermédiaire de Gs et la phospholipase C par l'intermédiaire de Gi2. B Kuhn et al.; Biochemistry 38 (21SEP99) 12490-12498.

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On commence à comprendre mieux le chimiotactisme du spermatozoïde par le fluide folliculaire chez les mammifères. Seule une minorité des spermatozoïdes (de l'ordre de 10 %) répond à ce stimulus et donne lieu à l'activation. Cet état est transitoire et dure de 50 minutes à quatre heures, et ne se renouvelle pas. On n'a cependant pas réussi à identifier le chimioattractant intervenant qui est probablement un peptide thermostable. M Eisenbach; Developmental Genetics 25,2 (1999) 87-94.

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Deux des trois glycoprotéine majeures de la zone pellucide de l'ovocyte, ZP2 et ZP3, subissent un clivage protéique de leur extrémité C-terminale au niveau d'un site furine (-Arg-X-Lys/Arg-Arg-) avant leur incorporation dans la zone pellucide. ESZ Litscher et al.; Biochemistry 38 (21SEP99) 12280-12287.

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Une courte mise au point sur la fécondation chez les mammifères est parue dans PM Wassarman; Developmental Genetics 25,2 (1999) 83-86.

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La Physiologie

L'hormone de croissance (GH) entraine une lipolyse sans circulation de leptine. On observe également un effet insulinomimétique de la GH. Chez des souris mâles Stat5b-/- la lipolyse a lieu, mais, de plus, la sécrétion de leptine est stimulée. Chez des souris Stat5ab-/- femelles la GH n'a plus d'effet sur la lipolyse, mais la stimulation de la sécrétion de leptine est également observée. L'effet insulinomimétique n'est pas modifié chez les souris Stat5ab-/-. Il doit utiliser une autre voie. JN Fain et al.; Biochemical Biophysical Research Communication 263 (16SEP99) 201-205.

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La protéine membranaire FAT (CD36) intervient dans la capture et le transport des acides gras à longues chaînes. Sa surexpression dans le muscle favorise l'oxydation des acides gras au cours de la contraction, réduit le niveau des acides gras et des triglycérides sériques et accroît le niveau d'insuline et de glucose dans le plasma. Elle joue donc un rôle qui doit être important dans l'équilibre énergétique de l'organisme. A Ibrahimi et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (17SEP99) 26761-26766.

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Les gènes de la lipogenèse sont activés grâce à l'intervention des protéines SREBPs (sterol regulatory element-binding proteins). Trois formes, SREBP-1a, -1c et -2, existent dans le foie et leur forme mature (tronquée) active les gènes de la lipogenèse. L'incapacité à cliver les SREBPs au niveau de leur site 1, à la suite d'un défaut de la SREBP cleavage-activating protein (SCAP) empêche la production du cholestérol et sa capture à partir des LDL). Cette absence de clivage empêche le passage dans le noyau du fragment N-terminal qui est l'élément stimulant la transcription des gènes de la lipogenèse. RB Rawson et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (01OCT99) 28549-28556.

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L'analyse du fonctionnement des mitochondries du corps gras brun (responsable de la thermogenèse chez les rongeurs) chez des souris dont les gènes codant l'UCP-1 (uncoupling protein 1 qui découple l'oxydation de la régénération de l'ATP) ont été inactivés, montre que cette protéine n'est pas impliquée dans le découplage par les acides gras libres comme on le pensait. A Matthias et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (01OCT99) 28150-28160.

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La gustducine est une "G-protein" voisine de la transducine, et toutes deux sont exprimées dans les bourgeons du goût. Elles sont activées lors de la perception du goût amer. L'AMP se combinerait aux récepteurs correspondants et modifie le couplage avec les G-protéines est joue, de ce fait, son rôle de modificateur de goût. D Ming et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (17AUG99) 9903-9908.

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Le groupe de Breer à Stuttgart a montré que les cinq gènes de la sous-famille de récepteurs olfactifs OR37 sont regroupés sur seulement 60 kb. On retrouve à 70 kb deux gènes d'autres sous-familles, mais qui leur sont liés phylogénétiquement et s'expriment dans les mêmes régions de l'épithélium olfactif. Tout se passe comme si ce regroupement génique entraine une co-expression topographique. J Strotmann et al.; Gene 236 (20AUG99) 281-291.

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Le système immunitaire

En l'absence de co-stimulation, le pontage des récepteurs chez les cellules B immatures entraîne l'apoptose et la délétion clonale de ces cellules. Un pontage par des anti-IgM active la caspase-7 indépendamment de la caspase-8 et l'apoptose. C'est la calpaïne qui déclenche la maturation et l'activation de la caspase-7 et qui réprime l'expression de la calpastatine qui, elle, est normalement stimulée par l'interleukine CD40L. La calpaïne est donc un intervenant dans le développement des cellules B. A Ruiz-Vela et al.; EMBO Journal 18 (15SEP99) 4988-4998.

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CD95 induit l'apoptose nécessaire aux équilibres de populations de cellules B et T au cours des processus immunitaires. Les cellules B stimulent la production de CD95 après activation. La protection des cellules B contre une telle apoptose par la caspase 8 peut être assurée par un signal délivré par le récepteur des antigènes. Ce qui est remarquable est que ce signal ne nécessite pas une synthèse protéique. La caspase 8 n'est pas activée et le complexe CD95-FADD (Fas-associated death domain containing protein) ne se constitue pas normalement. IM Catlett et al.; Journal of Immunology 163 (01SEP99) 2378-2381.

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Les molécules du complexe MHC II jouent un rôle important dans la constitution de la population des lymphocytes en participant à la sélection dans le thymus (en dehors de leur contribution aux réponses aux antigènes). Elles font, apparemment, intervenir une voie de l'apoptose qui ne fait pas jouer les caspases (voir plus haut), ni les phosphatidylinositol-3-kinases, ni le système Fas/CD95. B Drenou et al.; Journal of Immunology 163 (15OCT99) 4115-4124.

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Des souris entièrement dépourvues de gènes du MHC-II ont été construites par excision des 80 kb qui les portent grâce à la technique Cre-lox. On ne trouve pas d'autres anomalies que celles auxquelles on peut s'attendre dans le système immunitaire. Cette absence devrait permettre de remplacer ces protéines importantes par celles d'autres organismes sans risque d'appariement interspécifique des chaînes MHC-II. L Madsen et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (31AUG99) 10338-10343.

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La recombinaison V(D)J, qui remanie les gènes d'immunoglobulines, est initiée par la fixation des recombinases RAG1-RAG2 (RAG1/2) sur leurs séquences cibles (RSS). Parmi les autres acteurs de cet événement, on trouve les protéines HMG1 ou HMG2 (pour High Mobility Group). L'homéodomaine de RAG1 interagit avec les HMG box de HMG1 et HMG2, ce qui permet la fixation sur les RSS. Ces séquences sont constituées de nonamères et d'heptamères que le complexe permet de rapprocher par repliement. V Aidinis et al.; Molecular Cell Biology 19 (OCT99) 6532-6542.

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SOCS1 (suppressor of cytokine signaling-1) est une protéine à domaine SH2 (Src homology 2) exprimée essentiellement dans les thymocytes. La délétion du gène est létale juste après la naissance. SOCS1 est impliqué dans la différenciation et la régulation des lymphocytes. Les réponses des souris déficientes ressemblent à celles induites par l'interféron g avec une réponse exagérée aux attaques virales et une capacité renforcée de tuer un parasite comme Leishmania major. C'est donc un modérateur essentiel de la réponse à l'interféron g, empêchant des réponses pathologiques à son action. WS Alexander et al.; Cell 98 (03SEP99) 597-608 et JC Marin et al.; p; 609-616.

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L'activation puis la prolifération des cellules T périphériques fait intervenir un récepteur de cytokines comme ceux de l'IL-2 et IL-4. Stat5a et Stat5b, deux protéines très voisines, jouent un rôle essentiel dans ce mécanisme après l'activation. Ces protéines sont phosphorylées sur une tyrosine à la suite de l'intervention de la cytokine et de son récepteur et ne fait pas intervenir les récepteurs d'antigènes des cellules T. R Moriggl et al.; Immunity 11 (AUG99) 225-230.

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Les cellules Th1 (T helper cells type 1) produisent de l'interferon-g et le tumor necrosis factor a (TNFa), tandis que les Th2 produisent interleukine-4 (IL-4), IL-5 et IL-13. L'intervention des cellules B permet de favoriser la différenciation des cellules Th2 plutôt que celle des cellules Th1. Des souris CD40-/- n'assure pas ce processus.

Des cellules B au repos ne produisent que du TGF-ß. Quand on les active, elles produisent les messagers des IL-6 (InterLeukine-6), IL-10 et TNFa, et ceci d'autant plus vite qu'on les traite par l'IL-12 (produite par les cellules présentatrices d'antigènes ou APCs). L'analyse du fonctionnement dans ce cas montre que l'interaction des APCs (avec leur IL-12) est décisive pour le basculement vers la différenciation des Th2 (avec leur marqueur IL-4).

C'est une sorte de régulation en retour, car cela évite un excès d'interféron g par les Th1 (précisément sous la stimulation par l'IL-12). J Skok et al.; Journal of Immunology 163 (15OCT99) 4284-4291.

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On trouvera dans LA Babiuk et al.; Journal of Biotechnology 73 (20AUG99) 131-140, un survol des techniques d'immunisation des animaux d'élevage par les ADNs. Il montre qu'il est possible de moduler la nature de la réponse immunitaire en co-administrant antigène et cytokines. Il apporte des éléments originaux sur l'importance des cibles utilisées pour l'expression des antigènes sur la nature de la réponse.

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L'immunité vis-à-vis de Listeria monocytogenes repose sur les cellules T CD8+, ainsi que sur la sécrétion d'interféron g. Utilisant comme antigène la listériolysine et la protéine p60, des chercheurs allemands ont induit une réponse des cellules Th1 en utilisant la technique biolistique en injectant ainsi des plasmides codant ces antigènes (Chly et Ciap) ainsi que des oligodésoxynucléotides contenant des répétitions CpG qui ont la propriété d'être immunostimulantes dans certaines conditions. J Fensterle et al.; Journal of Immunology 163 (15OCT99) 4510-4518.

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Une injection d'anticorps monoclonal de souris contre la listériolysine O protège celle-ci contre l'infection par Listeria monocytogenes, même chez des souris SCID (sans cellules T et B). BT Edelson et al.; Journal of Immunology 163 (15OCT99) 4087-4090.

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Embrex, Boehringer Ingelheim Vetmedica et la North Carolina State University ainsi que le Kenan Institute for Engineering, Technology and Science vont collaborer dans l'utilisation du viral neutralising factor d'Embrex pour monter de vaccins animaux autres que ceux déjà utilisés pour la volaille par Embrex dans son procédé InOvoJect. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99)

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Les Pathogènes et les Vaccins

La FDA envisage, comme l'a fait l'Europe, de restreindre l'usage des antibiotiques chez les animaux, a annoncé un de ses responsables à l'ouverture, à San Francisco, de la 39éme conférence sur les agents antimicrobiens et la chimiothérapie. Agence France Presse (27SEP99).

L'apparition des résistances à la vancomycine, un glycopeptide antibiotique, est suivie avec inquiétude. On attribue l'accélération de l'apparition de cette résistance à l'utilisation d'avoparcine dans la nutrition des poulets et porcins. Le premier cas d'une telle résistance au Brésil chez Enterococcus faecium du fait de la présence du gène vanA a été détecté dans un cas de méningite. RC Zanella et al.; Microbial Drug Resistance 5 (SUM99) 159-162. L'association de la résistance à l'utilisation de l'avoparcine est confirmé par une étude norvégienne: H Kruse et al.; p.135-139. En effet 106 des 109 élevages ayant utilisé cet antibiotique entre la date de son autorisation en 1986 et son interdiction en 1995 sont contaminés, tandis que 6 des 33 élevages analysés qui ne l'ont pas utilisé le sont également. Plus grave, six des dix éleveurs de la première catégorie sont contaminés et aucun des seize de la seconde. Une autre étude norvégienne montre que la transmission de la résistance VanA des animaux à l'homme est directe dans les fermes exposées. soit par transmission des souches soit par transfert horizontal de leur gène de résistance. GS Simonsen et al.; p.113-122.

L'utilisation de l'avoparcine a été interdite au Danemark depuis 1995. La présence de souches d'Enterococcus résistantes est suivie depuis. On observe un déclin de ces populations chez les poulets de chair depuis l'interdiction, alors qu'il n'en est rien chez les porcs. Ceci est probablement dû à l'utilisation de cohortes (fournées synchronisées) dans le cas des volailles, alors que l'élevage des porcs est continu. Il existe d'autre part des différences entre agents antimicrobiens utilisés qui, chez les porcs, favorisent un co-sélection des souches résistantes alors que chez la volaille les antimicrobiens utilisés sélectionnent plutôt les souches sensibles aux glycopeptides. F Bager et al.; p.53-56.

On ne retrouve plus que très peu de ces souches résistantes dans un quart des carcasses de volaille en Allemagne. On observe le même déclin dans la flore intestinale des personnes des mêmes régions. I Klare et al.; p.45-52.

La présence du transposon Tn5482 semble responsable de la diffusion de la résistance au moins aux Etats-Unis chez les Enterococcus faecium (surtout des vanA) et Enterococcus faecalis (vanB). La séquence d'insertion IS 1485 intervient également. La très grande diversité génétique des souches semble résulter de conjugaisons entre souches sensibles et résistantes. H de Lencastre et al.; p.113-129 et SK McAshan et al.; p.101-112.

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Une étude de la flore intestinale de porcs sains indique que les souches d'E.coli sont porteuses de très nombreuses résistances, la résistance à la streptomycine entraînée par les gènes strA-strB étant la plus fréquente. Ces animaux sont donc un réservoir de résistance très important. M Sunde et al.; Microbial Drug Resistance 4 (WIN98) 289-299.

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Les sources de résistances aux antibiotiques ne doivent pas obligatoirement être recherchées dans les additifs alimentaires des animaux, car une étude vient de montrer que la flore intestinale des populations de campagnols et de souris des champs (non soumises de façon évidente à une sélection par des antibiotiques) est résistante aux sept antibiotiques à usages humains étudiés. Cela voudrait dire que l'arrêt de l'usage des antibiotiques ne devraient pas entraîner une baisse obligatoire des résistances dans les populations microbiennes. MA Gilliver et al.; Nature 401 (16SEP99) 233-234.

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Selon des chercheurs de Harvard la protéine Prp qui donne le prion a une configuration qui la rend particulièrement sensible à un processus d'agrégation par nucléation à partir de l'a-hélice 1 (ß-nucléation). MP Morrissey et al.; . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (28SEP99) 11293-11298.

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Le polymorphisme du prion au niveau des codons 136, 154 et 171, théoriquement impliqués dans la sensibilité à la scrapie, a été étudié dans la race islandaise du mouton. Ceci a été facilité par le fait qu'il existe des régions de l'île qui sont dépourvues de cas de scrapie (et maintenues isolées), et d'autres où elle est présente. Les acides aminés Val, Arg, Gln (VRQ) à ces sites sont fortement associés à la sensibilité tandis que le cumul Ala, His, Gln (AHQ) n'est jamais associé à la maladie. On retrouve la liaison prévue. La combinaison VRQ homozygote est peu fréquente. Il n'y a aucun polymorphisme au niveau du codon 171. Deux nouveaux allèles au niveau des codons 138 et 151 ont été détectés, mais semblent présents dans les deux populations. S Thorgeirsdottir et al.; Journal of General Virology 80 (SEP99) 2527-2534.

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L'origine du virus de la grippe A H5N1 de Hong Kong qui a tué 6 des 18 patients humains en 1996-97 (voir les bulletins de Janvier, Avril et Octobre 1998 et celui d'Août 1999) n'est toujours pas établie. La caractéristique inquiétante de cette souche est son passage direct de la volaille à l'homme. Deux souches coexistaient au moment de l'épidémie, H5N1 et H9N2, ce qui a fait penser à un réarrangement entre les segments du génome. H9N2 existe actuellement chez les populations de canards domestiques de tout le sud-est asiatique. Les souches de H9N2 recueillies sur les marchés de Hong Kong sont, elles-mêmes de trois lignées différentes. Six des huit segments sont ceux de souches de poulet prévalentes antérieurement en Chine. Les deux autres PB1 et PB2 sont celles de H5N1 ou d'autres H9N2 de caille qui ont été identifiées. La population virale a donc déjà subi plusieurs réarrangements. La souche aviaire et humaine en cause possède les gènes internes de la souche de caille Qa/HK/G1/97. Le sens des transferts reste cependant encore indéterminé. Y Guan et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96 (03AUG99) 9363-9367.

Un autre virus très proche, A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) de l'oie et détecté antérieurement à l'épidémie humaine de 1997 a également été analysé en détail. Elle a causé une épidémie en 1996 chez les oies du Guandong (province voisine de Hong Kong). Si l'hémagglutinine H5 est identique à celle détectée en 1997, la neuraminidase N1 ne possède pas la délétion de 19 aminoacides observée chez la souche humaine et la protéine NS est différente de celle de 1997. X Xu et al.; Virology 261 (15AUG99) 15-19.

Les élevages de porcs de North Carolina, Texas, Minnesota et Iowa ont souffert au cours de l'hiver 1998 de sérieuses maladies respiratoires dues à des virus de l'influenza. Quatre isolats ont été génotypés et on a montré que l'isolat de North Carolina est issu d'un réarrangement entre un virus H3N2 humain et le virus porcin classique H1N1. Les autres sont issus de réarrangements plus complexes avec des segments génomiques, classic swine H1N1 porcins, H3N2 humains et aviaires. Toutes les hémagglutinines sont les variantes humaines de 1995. NN Zhou et al.; Journal of Virology 73 (OCT99) 8851-8856.

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Les recombinaisons entre entérovirus semblent très fréquentes. Ce sont pourtant des virus à ARN monobrin (voir également le bulletin de Septembre). Cela a été établi avec un catalogue de 60 sérotypes d'entérovirus humains. J Santti et al.; Journal of Virology 73 (OCT99) 8741-8749.

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Le Rift Valley fever virus (RVFV) est un virus du groupe Bunyamvera transmis par les arthropodes et qui, périodiquement, se manifeste dans toute l'Afrique subsaharienne. Il comporte trois segments génomiques. L'analyse des populations du virus par des chercheurs de l'Institut Pasteur de Dakar indique que les réarrangements entre ces segments ont fréquemment lieu et permettent une variabilité génétique aisée. Cela indique que des immunisations dans les zones d'endémie avec des virus vivants atténués sont à éviter, car elles pourraient permettre une reconstitution d'une virulence par ce processus. AA Sall et al.; Journal of Virology 73 (OCT99) 8196-8200.

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Des chercheurs de l'USDA ont mis au point des sondes permettant de distinguer les cinq souches connues aux Etats-Unis du virus bluetongue. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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On peut rendre des souris résistantes à la maladie d'Aujezsky (Pseudorabies virus) en leur faisant exprimer un gène chimérique codant le domaine fixant l'ADN de la protéine précoce immédiate (IE) et la protéine VP16 sans son domaine activant la transcription qui réprime l'expression de IE. Ce gène a été placé sous la commande du promoteur Mx1 qui est induit par le virus et par l'interféron. E Ono et al.; Virology 262 (15SEP99) 72-78.

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La famille des intégrines (récepteurs glycoprotéiques transmembranaires hétérodimériques) joue un grand rôle dans les interactions cellules/cellules et cellules/matrice extracellulaire. Les intégrines assurent la liaison entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette intracellulaire, intervenant ainsi dans l’adhésion, la migration et la transmission de signaux de voisinage. Or l'invasine de Yersinia pseudotuberculosis qui permet l'entrée dans la bactérie dans la cellule hôte a une plus forte affinité pour les intégrines que la fibronectine qui est le ligand normal. On vient de montrer que c'est grâce à une configuration presque identique à celle de la fibronectine qui n'a aucune séquence en commun. La forte affinité invasine/intégrine est dû à un mimétisme moléculaire accompagné d'une optimisation de l'interface côté bactérien. ZA Hamburger et al.; Science 286 (08OCT99) 291-295.

La même bactérie utilise un système de sécrétion de type III pour injecter une série de protéines (facteurs de virulence) dans la cellule hôte. Parmi celles-ci, YopJ, inhibe les kinases de MPKs (mitogen-activated protein kinase) ce qui interrompt des chaînes de signalisation, empêchant notamment la production de cytokines. On trouve le même type de protéines dans des bactéries pathogènes de plantes. K Orth et al.; Science 285 (17SEP99) 1920-1923.

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Des chercheurs suédois ont étudié des séquences du génome de Rickettsia qui ne sont pas soumises à une pression de sélection, comme certains pseudogènes et les ont comparées aux gènes fonctionnels voisins (le génome de R prowazekii a été complètement séquencé. Ils montrent, en comparant diverses souches, que le processus de réduction du génome est un phénomène en cours. JO Andersson et al.; Molecular Biology & Evolution 16(SEP99) 1178-1791.

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On trouvera dans MP Bradley et al.; Journal of Biotechnology 73 (20AUG99) 91-10, un article sur l'utilisation potentielle de vaccins pour la régulation de la prolifération des animaux sauvages en freinant leur reproduction. La lenteur de la mise en œuvre de telles techniques dont l'idée n'est pas nouvelle, tient au fait que la biologie immunitaire des animaux cibles est encore trop peu connue. Un des critères essentiels sera la durée de l'effet, car on ne peut se payer le luxe d'une revaccination. La voie des microorganismes recombinants exhibant les antigènes utiles est probablement la plus intéressante mais, quand même, discutable car on ne sera jamais sûr de la spécificité d'hôte.

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PowderJect Pharmaceuticals et PowderJect Vaccines vont commencer leurs essais de vaccins ADN contre le paludisme. Biocommerce Abstracts 21 (15SEP99). Clear Spring Foods a mis au point un vaccin ADN contre la nécrose hématopoïétique des salmonidés. New Scientst (28AUG99) 4.

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On trouvera dans Journal of Applied Microbiology 87 (AUG99) une série d'articles tournant autour de la pathologie due au bacille du charbon, provenant des exposés à un colloque.

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La Defence Evaluation and Research Agency britannique cherche un partenaire pour développer un vaccin contre la peste bubonique, basé sur les antigènes F1 et V et les techniques de Cortecs. Biocommerce Abstracts 21 (29SEP99).

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Les animaux recombinants

Des chercheurs de l'University of Florida ont commencé les premiers essais cliniques de l'a-1-antitrypsine de PPL Therapeutics produite dans le lait de brebis. Biocommerce Abstracts 21 (29SEP99).

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Les Productions Microbiennes

Une revue sur l'état des connaissances actuelles dans le domaine de la production de protéines hétérologues chez E.coli est parue avec F Baneyx; Current Opinion in Biotechnology 10 (OCT99) 411-421.

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Deux gènes de cellobiohydrolases ont été caractérisés chez Aspergillus niger, cbhA et cbhB. Les exigences de leur expression ont été étudiées. La cellobiohydrolase CbhB est modulaire et porte un domaine liant la cellulose associé par un linker à un domaine catalytique, alors que ChbA ne possède que le domaine catalytique. Elles n'ont, par ailleurs, rien d'extraordinaire, sinon qu'elles semblent commandées par les systèmes xylanasiques. MM Gielkens et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4340-4345.

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Une revue (E Rosenberg et al.; Applied Microbiology and Biotechnology 52 (AUG99) 154-162) fait l'apologie des biosurfactants pour les usages industriels. Elle décrit les différents types caractérisés.

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Archer Daniels Midland a breveté un vecteur plasmidique pour l'amélioration de la production de tryptophane, avec l'opéron tryptophane, les gènes aroG et serA d'Escherichia coli (US Patent 5, 939 305) ainsi que des souches recombinantes d'E.coli pour la production de thréonine (US Patent 5 939 307). Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Des chercheurs coréens défendent une attitude originale vis-à-vis des polyhydroxyalcanoates (PHAs). Au lieu de perfectionner leur production pour en abaisser le prix (ce qu'ils font quand même), ils montrent qu'on peut produire des acides (R)-(-)-hydroxycarboxyliques purs en les dépolymérisant biologiquement par Alcaligenes latus (ce qui est leur sort naturel) ce qui permet d'obtenir des produits plus valorisants. Le rendement est de 96 % en 30 minutes. SY Lee et al.; Biotechnology and Bioengineering 65 (05NOV99) 363-368. Un nouveau brevet (voir le bulletin de Septembre) de Procter & Gamble (US Patent 5 942 597) sur l'extraction des polyhydroxyalcanoates par solvants (acétone, benzène, diethylformamide et autres). Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Des chercheurs de l'Universidad de Leon ont étudié la production d'un poly (3-hydroxy-n-phénylalcanoate) par Pseudomonas putida U, liée à l'activité d'une acyl-CoA synthétase (gène fadD), activant les précurseurs aryles, d'une voie de ß-oxydation (fadA) donnant les 3-OH-aryl-CoAs et un système de polymérisation-dépolymérisation (codé par phac1 i -2) et une dépolymérase (PhaZ).

Les souches mutantes dans le cycle glyoxylique (isocitrate lyase), ou dans la voie de la ß-oxydation accumulent une plus grande quantité de polymères et on devrait pouvoir améliorer cette production. B Garcia et al.; Journal of Biological Chemistry 274 (08OCT99) 29228-29241.

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On parle souvent des messages du quorum sensing relevant des acyl-homosérine lactones. Les peptides sont beaucoup plus variés et devraient intervenir. Des dipeptides cycliques de Pseudomonas aeruginosa activant les biocapteurs des N-acylhomosérine lactone ont été caractérisés par des chercheurs de Nottingham chez Pseudomonas aeruginosa. Ce sont des dicétopipérazines (DKPs), cyclo("Ala-L-Val) et cyclo(L-Pro-L-Tyr). Ils sont également émis par Proteus mirabilis, Citrobacter freundii et Enterobacter agglomerans [cyclo("Ala-L-Val)]. Chez Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas alcaligenes, un troisième dipeptide cyclique [cyclo(L-Phe-L-Pro)] a été caractérisé. MT Holden et al.; Molecular Microbiology 33 (SEP99) 1254-1266.

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On trouvera dans T Schweder et al.; Biotechnology and Bioengineering 65 (20OCT99) 151-159, une illustration intéressante des réponses dans la seconde, de gènes exprimés lors de stress dus à une trop forte concentration de glucose, ou de manque d'oxygène dans un réacteur en vraie grandeur.

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Une technique permettant d'évaluer des paramètres physiologiques comme le pH intracellulaire de cellules individuelles est décrit dans M Jakobsen; Microbiology 145 (JUL99) 1703-1709. Elle permettrait de suivre individuellement les composantes des populations microbiennes mixtes au cours d'un procédé.

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Contrairement à la superoxyde dismutase des organismes aérobies, la superoxyde réductase de l'archée anaérobie hyperthermophilie Pyrococcus furiosus ne produit pas d'oxygène en détoxifiant les ions superoxydes; Cette superoxyde réductase fonctionne à 80° (cad en dessous de l'optimum de croissance qui est de 100° pour cet organisme), conditions où l'oxygène risque d'être gênant. FE Jenney et al.; Science 286 (08OCT99) 306-309.

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Les Protéines et les Enzymes

Une phytase ayant une forte affinité pour l'acide phytique a été caractérisée chez une souche d'Aspergillus niger par des chercheurs de Shin Nihon Chemical Co. T Nagashima et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4682-4684.

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L'US Patent 5 942 430 de Diversa couvre des estérases de Staphylothermus, Pyrodictium, Archaeoglobus, Aquifex, Thermococcus, Teredinibacter et Sulfolobus. L'US Patent 5 939 300 couvre des catalases d'Alcaligenes (Deleya) et Microscilla, tandis que les US Patent 5 939 250 couvre une méthode de sélection d'enzymes améliorées parmi les produits d'un PCR infidèle. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Les cellulosomes de Clostridium cellulolyticum contiennent une dizaine d'enzymes dégradant les parois végétales, chacune ancrée par un domaine appelé dockerine sur un axe squelettique constitué par la protéine CipC au niveau de domaines appelés cohésines. L'interaction entre cohésine 1 et dockerine de la cellulase CelA a été étudiée par des chercheurs de Marseille. L'affinité de ces deux domaines ne dépend pas du reste des molécules. Si on supprime la deuxième des deux séquences de 22 acides aminés caractéristiques des dockerines, on perd l'affinité pour la cohésine 1. Il suffit de doubler le segment persistant pour rétablir l'affinité. HP Fierobe et al.; Biochemistry 38 (28SEP99) 12822-12832.

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Le champignon anaérobie Piromyces produit un complexe cellulase-hémicellulase dont fait partie une cinnamoyl ester hydrolase (EstA) à trois domaines distincts. Le domaine N-terminal ressemble beaucoup au domaine d'amarrage de 40-résidus retrouvés chez d'autres cellulases de champignons anaérobies et qui se lie probablement à la protéine de type CipC des cellulosomes de 97 kDa. Le domaine médian est manifestement un linker avec des répétitions de 13 acides aminés. Ce n'est que le domaine C-terminal de 270 résidus qui contient le domaine catalytique relativement complexe. Il est actif à l'état isolé et libère l'acide férulique des arabinoxylanes. IJ Fillingham et al.; Biochemical Journal 343 (01OCT99) 215-224.

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On trouvera dans H D Mootz et al.; Current Opinion in Biotechnology 10 (JUN99) 341-348, une revue sur un autre groupe d'enzymes modulaires, les peptides synthétases. Ce sont elles qui sont responsables de la synthèse non ribosomiques de certains peptides. Il est possible, compte tenu de cette structure modulaire, d'envisager des synthèses séquentielles de molécules intéressantes, car elles incorporent des composants tout à fait inusuels, et ces enzymes ont une spécificité très large. Des enzymes de ce type permettent en effet de produire, naturellement, des peptides actifs très modifiés comme des précurseurs de ß-lactames, la cyclosporine ou la vancomycine, mais aussi des sidérophores, surfactine, pristinamycine IA, etc…. Ces enzymes utilisent plusieurs domaines ordonnés pour assurer la séquence de réactions indispensables. Ces domaines sont organisés en modules qui assurent chacun une étape de l'élongation du peptide. Des essais sur la surfactine synthétase ont montré qu'il reste encore des choses à étudier pour obtenir, non pas la spécificité recherchée (qui semble prévisible), mais une efficacité acceptable. La construction de peptide synthétases hybrides suppose que l'on connaisse bien les frontières des modules et des linkers qui les joignent.

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On trouvera également une revue sur la conversion de la biomasse en produits de type "commodités" grâce aux cellulases dans: ME Himmel et al.; Current Opinion in Biotechnology 10 (JUN99) 358-364. L'utilisation économique des cellulases suppose une amélioration d'un ordre de grandeur de l'activité spécifique des cellulases. Le terme de cellulase couvre des complexes dont celui, bien étudié, de Trichoderma reesei contient au moins 14 enzymes. Ces enzymes sont notoirement inefficaces, et ceci pour des raisons biologiques. Il n'existe pas de pression dans la nature poussant dans cette direction. Il faudrait améliorer l'activité enzymatique, mais aussi la température à laquelle l'enzyme peut opérer. Il faudrait, à plus long terme améliorer la fixation sur la cellulose (éviter une fixation non associée à une catalyse, probablement facilitée par la lignine) et la capacité de décristallisation de la cellulose, probablement combinée avec une amélioration des prétraitements de la biomasse.

Il faut cependant souligner que ces prétraitements éloignent le substrat des conditions naturelles qui ont animé la sélection naturelle des cellulases. La thermodynamique de décristallisation est encore très mal connue et pourrait expliquer les mauvais rendements sur ces substrats. Un des points importants discuté dans cette revue est le prix acceptable pour une activité donnée en fonction de divers paramètres de la biomasse et de son prix. Une étude du National Renewable Energy Laboratory montre que si l'accroissement de l'activité spécifique améliore beaucoup le prix de revient de l'enzyme nécessaire pour un litre d'éthanol pour les premières étapes de l'amélioration. Le coût de l'enzyme nécessaire tombe de 0,30 $/gallon d'éthanol à 0,17 pour une amélioration de 600 à 1000 unités enzymatiques par gramme de protéine mais seulement de 0,17 $/gallon d'éthanol à 0,10 quand cette activité spécifique passe de 1000 à 3600 à cause de la non linéarité des coûts. Il faudrait pouvoir atteindre 0,07 $/gallon d'éthanol. Changer de substrat pour la production de l'enzyme ne semble pas intéressant car le coût ne baisse que de 0,08$/gallon d'éthanol quand le prix du substrat passe de +50$ par tonne à -50$ par tonne (déchets valorisés par exemple). Ceci est dû au fait que les autres coûts (aération, capital etc…) sont beaucoup plus importants dans le prix de revient final.

La réduction de la complexité des mélanges cellulasiques naturels est en route, ce qui permettrait de cibler les améliorations moléculaires sur un petit nombre d'acteurs seulement.

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L'Idaho National Engineering and Environmental et l'University of California à Santa Barbara, ont cloné les gènes de plusieurs protéines du byssus des moules, avec un financement de l'US Navy. Allied-Signal avait déjà produit une des protéines dans des Escherichia coli recombinantes dès 1990. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Une subtilisine BPN' adaptée au froid a été sélectionnée par des chercheurs de Tokyo. Son kcat/Km est 70% plus élevé à 10° que pour l'enzyme d'origine. Trois substitutions sont associées à ce changement: Ala-31-->Thr dans le prodomaine, Ala98-->Thr qui contribue à 30 % de l'effet et Ala88-->Val qui, seule est neutre, renforce à 70 % l'effet de la mutation précédente. S Taguchi et al.; Journal of Biochemistry 126 (01OCT99) 689-693.

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Une para-nitrobenzyl estérase découverte en 1975 par Eli Lilly and Co. a été améliorée par les techniques de Frances Arnold (US Patent 5 945 325 de Caltech entre autres). Eli Lilly détient les droits d'exploitation dans le domaine des antibiotiques ß-lactames, mais dans les autres domaines c'est CalTech. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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L'agro-alimentaire

On trouvera dans Biofutur d'Octobre une série d'articles intéressants sur les matériaux d'origine agricoles (agromatériaux). Pour l'instant ces matériaux sont produits par des techniques classiques. Une analyse des brevets dans le domaine par domaine et par pays permet de constater que les biotechnologies sont encore balbutiantes dans ce domaine, pas tellement pour des raisons techniques, mais plutôt des problèmes de prix de revient, voire d'objectifs suffisamment définis pour l'établissement de normes. Les préoccupations environnementales sont prises en compte de façon très inégales suivant les pays. La concurrence entre firmes et l'appropriation par brevets finissent, par ailleurs, par freiner le développement économique des matériaux biodégradables. P Colonna; Biofutur 193 (OCT99) 16-18, M Nieddu; p.22-25 et B Bettels et al.; p. 26-30. Le problème des emballages est particulier car une biodégradabilité est gênante quand elle est trop grande pour la fonction emballage et trop faible pour la fonction dégradabilité. Les pétroliers se servent de ces arguments, d'autant que le coût en énergie fossile est parfois supérieur pour les productions biologiques. Inversement les produits pétroliers recyclés ont parfois des fonctions de barrières affaiblies pour les produits alimentaires. Tout cela indique que très probablement chacun des types de polymères devrait avoir son champ de prédilection.

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Les chercheurs de Wageningen explorent l'adaptation au froid de souches thermophiles du Streptococcus thermophilus CNRZ302. Cette bactérie est capable de s'adapter rapidement à la congélation-décongélation après une période à 20°. Cette adaptation n'a plus lieu à 10° (c'est à dire à une température inférieure à la température minimale de croissance de la bactérie (15°). Cela est dû au fait que la bactérie produit pendant la période d'acclimatation au moins une protéine cold-shock. On retrouve des protéines homologues chez Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes et Lactococcus lactis. JA Wouters et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4436-4442.

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On trouvera dans J Hugenholtz et al.; Current Opinion in Biotechnology 10(OCT99) 492-497, une revue sur l'ingénierie du métabolisme des bactéries lactiques. Celles-ci ont, en effet, un métabolisme relativement simplifié où l'utilisation des sucres est découplée des biosynthèses qui se font généralement à partir de précurseurs provenant de l'hydrolyse des protéines. L'extraordinaire efficacité de la conversion des sucres en lactates est une des composantes de l'avantage sélectif de ces bactéries en milieux riches (l'autre étant l'abaissement du pH par la synthèse de l'acide lactique). Elle est liée à celle de la lactate déshydrogénase. Il est théoriquement facile de rediriger un tel métabolisme vers la production d'autres molécules que le lactate. On a récemment décrit la réorientation vers la production aussi bien de produits primaires comme le diacétyl et l'alanine mais également de produits du métabolisme secondaire comme d'autres arômes et les exopolysaccharides.

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Aquasearch a commencé ses premières ventes, via Cultor, d'astaxanthine, un caroténoïde utilisé en aquaculture, produit par Hematococcus pluvialis, et s'attaque au Japon. Sa querelle avec la société voisine Cyanotech porte sur la turbulence dans les cuves, et leur remplissage qui est couvert par l'US Patent 5 541 056. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

Igene Biotechnology fait produire au Mexique son astaxanthine issue de la levure basidiomycète Phaffia rhodozyma. Ce produit (un stéréo isomère de celui d'Hematococcus), est maintenant autorisé en aquaculture au Canada (après le Chili où il est commercialisé) comme alternative au caroténoïde de chimiosynthèse actuellement utilisé. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Nutraceutix et Biotal vont vendre des additifs microbiens pour les aliments, facilitant ainsi la digestion des ruminants. Biocommerce Abstracts 21 (15SEP99).

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Les protéines du grain du sarrasin provoqueraient une hypertrophie musculaire et une réduction du tissu graisseux chez le rat. J Kayashita et al.; Biosciences Biotechnology and Biochemistry 63 (JUL99) 1242-1245.

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Le National Center for Agricultural Utilization Research de l'USDA est actuellement en train de développer l'alternane, un substitut de gomme arabique produit par fermentation bactérienne à partir de saccharose grâce à l'alternane-sucrase de Leuconostoc mesenteroides, le fructose est un sous-produit dans ce cas. L'alternane est un polysaccharide composé alternativement de a-(1,6) et a-(1 ,3) glucoses. Pour l'instant on se contente de viser un prix situé dans la fourchette haute de la gomme arabique (dont le prix fluctue considérablement, jusqu'à 9 dollars par kg). On devrait pouvoir le produire au même prix que les dextranes (6 dollars par kg). Des souches améliorées ont été isolées. L'USDA détient les US Patents 5 702 942, 5 786 196 et 5 789 209 sur le sujet. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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La sécurité alimentaire

Le consommateur a tendance à se méfier des aliments et, pourtant, notre alimentation est de plus en plus sûre, contrairement aux idées reçues, l'industrialisation de la production agroalimentaire ayant fortement participé à la diminution du risque. Les données chiffrées sont là pour le confirmer.

Le nombre de intoxications et des infections alimentaires collectives est de 400 à 500 par an ces dernières années, 1 cas sur 100 étant mortel), et ceci malgré une augmentation de la population à risque (SIDA et personnes âgées). Ce nombre est six fois plus faible qu'aux Etats-Unis relativement aux populations. Soixante-dix pour cent des infections sont liées à Salmonella, suivies de Staphylococcus aureus, puis de Clostridium perfringens. `

Listeria, pourtant plus médiatisée, arrive loin derrière. Le nombre de listérioses déclarées a augmenté parce que les médecins savent mieux les diagnostiquer. L'augmentation des cas n'est donc qu'apparente. Non seulement le nombre de produits contenant des Listeria diminue, mais la quantité de cette bactérie par gramme de produit diminue également. Le seuil de dangerosité (fixé par le Conseil supérieur d'hygiène publique de France) est de 100 germes par gramme de produit, à la date limite de consommation alors que l'on déclare contaminé des produits où l'on détecte (grâce aux méthodes modernes) des quantités cent fois inférieures. Le Quotidien du Médecin (06OCT99).

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On trouvera dans le numéro de Septembre de Journal of Food Protection plusieurs revues sur l'état de l'art dans diverses techniques de stérilisation. S Jeyamkondan et al.; p. 1088-1096 traite de la stérilisation des aliments par champ électrique pulsé qui reprend de la vigueur après des premiers essais dans les années 60s. L'inactivation des microorganismes est liée à l'instabilité des membranes dans ces conditions. Il faut appliquer des champs d'au moins 15kV/cm. Cette technique, valable à petite échelle, est cependant trop coûteuse quand on passe aux gros volumes. Il faudrait travailler en continu et des pilotes fonctionnent à 300l/h), mais beaucoup de données manquent encore et un abaissement des coûts de génération du champ est indispensable pour rendre ce procédé compétitif avec les traitements thermiques. Curieusement ce traitement peut favoriser, probablement pour les mêmes raisons, la germination de certaines spores aux pH acides.

Les traitements par l'ozone sont analysés par JG Kim et al.; P.1071-1087. La compétition avec d'autres substances oxydables des aliments limite un peu son efficacité, et entraîne parfois des altérations des aliments. C'est donc plutôt un décontaminant de surfaces et des eaux. Son utilisation dans la détoxication de certaines mycotoxines et de pesticides est mentionnée.

On trouvera également dans D Knorr; Current Opinion in Biotechnology 10 (OCT99) 485-491, une autre revue sur les techniques de stérilisation par champ électrique pulsé et par les hautes pressions. Elle insiste sur le fait que le jeu de la température et de la pression peut être utilisé pour piloter, en parallèle, les transformations enzymatiques.

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Escherichia coli O157:H7 est la souche entérohémorrhagique à la mode aux Etats-Unis, où on la trouve dans de nombreux produits, notamment les beefsteack hachés, certains jus de fruits, etc…La stérilisation par hautes pressions (400 MPa pendant 1 min) a été préconisée, mais il existe des souches résistantes (NCTC 12079). Cette survie est déprimée par les pHs acides ce qui indique que le pH des jus d'orange doit être ajusté à au moins 3,4-3,6 pour être réellement efficace. M Linton et al.; Journal of Food Protection 62 (SEP99) 1038-1040.

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Pour ceux qui sont intéressés par le problème des contaminations des aliments par les PCBs (polychlorinated biphenyls) et les dioxines, vous pouvez trouver une brève mise au point sur les antécédents de telles contaminations avec des conclusions sur l'épisode récent (février 1999) dans A Bernard et al.; Nature 401 (16SEP99) 231-232.

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Des chercheurs de l'University of Surrey ont étudié les mécanismes d'adhésion de Staphylococcus aureus, Pseudomonas fragi, Escherichia coli, Listeria monocytogenes et Serratia marcescens sur l'acier inoxydable avec différents stades de finition. La rugosité du support ne semble pas affecter l'adhésion. Par contre un traitement par les protéines du lait écrémé (a-caséine, ß-caséine, k-caséine et a-lactalbumine) réduit l'adhésion de S.aureus et L.monocytogenes, et dans une moindre mesure S.marcescens. On perd tout le pouvoir inhibiteur en pontant les protéines qui semblent intervenir par encombrement stérique associé à une flexibilité des protéines. L Barnes et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4543-4548.

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L'adhésion de trois souches de Listeria monocytogenes sur l'acier inoxydable a été étudiée par des chercheurs de Massy. Les souches plus hydrophobes, ou rendue telles par les cultures, adhèrent plus facilement, et une supplémentation du milieu par de l'acide lactique facilite la fixation. R Briandet et al.; Journal of Food Protection 62 (SEP99) 994-998.

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Une bactérie comme Escherichia coli rencontre dans les biofilms des conditions stressantes avec une forte densité cellulaire (et donc une compétition, notamment pour l'oxygène), des pressions osmotiques supérieures à la normale. Elles lancent alors une reprogrammation physiologique correspondante avec surexpression de porines comme OmpC, les transporteurs à haute affinité de la glycine bétaine (proU) et du nickel (nikA), etc…. C Prigent-Combaret et al.; Journal of Bacteriology 181,19 (OCT99) 5993-6002.

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Les Salmonella envahissent des cellules non phagocytaires comme l'épithélium intestinal après injection de protéines bactériennes qui provoquent la réorganisation du cytosquelette. La cellule parasitée retrouve rapidement sa morphologie grâce à la bienveillance de Salmonella qui injecte la protéine SptP (une protéine activatrice de GTPase) qui inhibe les acteurs du remaniement cytosquelettique, Rac-1 et Cdc42. Y Fu et al.; Nature 401 (16SEP99) 293-297 avec un commentaire de MS Donnenberg; p.218-219.

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Le diacétyl est un composant aromatique des produits laitiers. Il a un effet antimicrobien qui est renforcé sur Escherichia coli O157:H7 et Salmonella typhimurium quand on le conjugue avec des cultures starters de Pediococcus acidilactici dans les traitements des viandes. DH Kang et al.; Journal of Food Protection 62 (SEP99) 975-979.

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Les bactériocines dites de type II comme nisine, lactococcine et pediocine ont des points communs dans leur système de production ce qui laisse à penser qu'il est possible d'en faire produire plusieurs simultanément à des Lactococcus lactis en procédant à des échanges de déterminants génétiques. Ainsi Lactococcus lactis IL1403 sécrète la lactococcine A, mais aussi la pédiocine PA-1 de Pediococcus acidilactici 347 grâce à des montages décrits par le groupe de Gasson. Ces montages ont été perfectionnés et avec introduction du système de translocation de la lactococcine A (gènes lcnC et lcnD) on arrive à une production équivalente de la pédiocine PA-1 à celle de la souche d'origine de Pediococcus. Les gènes indispensables pour la production et la sécrétion de pédiocine PA-1 ont été exprimés avec succès dans la souche productrice de nisine L. lactis FI5876. N Horn et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4443-4450.

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La brochocine-C est une bactériocine d'un Brochothrix campestris constituée de deux peptides issus du clivage d'un propeptide. Elle est active contre l'espèce voisine Brochothrix thermosphacta qui contamine les viandes réfrigérées et stockées sous faible tension d'oxygène (viandes emballées) et beaucoup d'autres bactéries gram+ contaminant la viande, y compris Clostridium botulinum. Son activité a donc un spectre large, un peu comme la nisine. Comme la nisine elle n'a pas besoin d'un récepteur spécifique pour agir, et cause la formation de pores d'ailleurs de taille différente de ceux de la nisine. Elle a cependant une faiblesse car la membrane externe des gram- bloque son action. Y Gao et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4329-4333.

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La nisine provoque une réduction de la résistance thermique de Listeria monocytogenes dans les préparations liquides d'œufs pasteurisées. KP Knight et al.; Journal of Food Protection 62 (SEP99) 999-1003.

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L'idée de faire produire du peroxyde d'hydrogène par des microorganismes pour inhiber les microorganismes pathogènes des aliments est amusante, mais pas facile à mettre en œuvre. Un chercheur de Karlsruhe a utilisé deux souches de Penicillium nalgiovense surexprimant le gène de glucose oxydase d'Aspergillus niger avec un effet notable contre Listeria monocytogenes, Salmonella enteritidis et Staphylococcus aureus. R Geisen ; Journal of Food Protection 62 (AUG99) 940-943.

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Il est possible de différencier les espèces de Listeria en utilisant seulement cinq amorces correspondant aux segments variables du gène iap codant la protéine p60, commune à toutes les Listeria. On utilise ensuite une PCR multiplex. A Bubert et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4688-4692.

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Le carvacrol, présent dans les extraits huileux du thym et de l'origan, a des vertus antiseptiques. Il intervient, dans le cas de Bacillus cereus, sur la perméabilité à K+ et H+ et dissipe le gradient ionique. A Ultee et al.; Applied & Environmental Microbiology 65 (OCT99) 4606-4610.

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L'Environnement

La formation de méthane est l'étape finale de la dégradation anaérobie des matières organiques quand les puits à électrons que constituent oxygène, nitrates, fer ferrique et sulfates ont disparu. On pensait que les alcanes à longues chaînes résistent bien et constitue un dépôt final dans les anciens sédiments. Il n'en est rien et on a montré que leur biotransformation en méthane est possible. K Zengler et al.; Nature 401 (16SEP99) 266-269.

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La dioxygénation des phtalates par les bactéries a été évoquée dans le bulletin de Juillet. Je signalais que l'un des problèmes mal résolus était celui de la perméation de la membrane au phtalate (qui est par ailleurs toxique du fait qu'il est un inhibiteur compétitif de la quinolinate phosphoribosyl transférase). Les Burkholderia cepacia qui l'oxydent doivent résoudre ce problème. On vient justement de décrire le système de perméation d'une souche de Burkholderia, et montré qu'il doit même en exister un deuxième. Ce système transporte également 4-hydroxyphthalate, 4-chlorophthalate, 4-méthylphthalate, et cinchoméronate. HK Chang et al.; Journal of Bacteriology 181,n°19 (OCT99) 6197-6199.

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La souche TA441 de Comamonas testosteroni s'est adaptée spontanément à l'utilisation du phénol comme source principale de carbone. Elle possède un groupe de gènes (aphKLMNOPQB) codant une phénol hydroxylase et une catéchol 2,3-dioxygénase avec un gène régulateur à transcription divergente (aphR). Ces gènes ne sont pas exprimés chez les souches non adaptées. Il existe un second gène régulateur (aphS) en aval de aphR. AphS est un régulateur de transcription de la famille GntR. Ce gène est systématiquement muté dans toutes les souches adaptées, et des mutations dans la région entre aphR et aphS ont le même effet. L'inactivation du gène aphS entraîne l'adaptation. AphS se fixe sur deux sites spécifiques dans la région promotrice entre aphK et aphR. C'est un répresseur des gènes aph. H Arai et al.; Molecular Microbiology 33 (SEP99) 1132-1140.

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Les Tubifex sont des oligochètes benthiques des eaux douces dans toutes les régions du globe. On sait que certains d'entre eux sont particulièrement résistants aux métaux lourds comme le cadmium. Tubifex tubifex est fréquemment utilisé comme marqueur de pollutions mais les résultats sont entachés d'une variabilité certaine probablement due à une variabilité génétique et une incertitude systématique. Utilisant les ADN ribosomaux 16S mitochondriaux, des chercheurs d'Innsbruck ont analysé les diverses formes. La systématique basée sur les données morphologiques est manifestement inutilisable dans ce cas et les marqueurs moléculaires distinguent plusieurs espèces cryptiques. Il faut donc être prudent dans l'utilisation de cet indicateur. C Sturmbauer et al.; Molecular Biology & Evolution 16(JUL99) 967-974.

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On trouvera dans DA Perry; Annual Review of Ecology & Systematics 29 (1998) 435-466, une revue sur l'état des lieux dans les recherches en foresterie, aux Etats-Unis essentiellement. Elle discute sur la soutenabilité des cultures forestières intensives avec l'accroissement des problèmes de prédateurs et pathogènes, en particulier. En fait, tous ces problèmes sont les problèmes de base de toute approche écologique.

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Des vers marins comme Thelepus crispus et Notomastus lobatus se défendent en produisant des répulsifs halogénés. Cela ne gêne pas Amphitrite ornata qui détoxifie ces composés grâce à une déhaloperoxidase qui s'est révélée être une globine très proche d'une myoglobine. On savait que les hémoglobines peuvent avoir des fonctions enzymatiques. Cette déhaloperoxidase a évolué à partir d'un transporteur d'oxygène chez qui la poche distale fixe les halophénols et où l'halogène est excisé par l'attaque enzymatique d'un oxygène activé. L Lebioda et al.; Nature 401 (30SEP99) 445.

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Energy BioSystems, qui commercialise un système de biodésulfuration du pétrole vient d'obtenir un brevet sur la production sur l'utilisation du sous-produit hydroxy phenyl benzène sulfinate (voir le bulletin de Mai, mais aussi les bulletins de Février, Mars, Juin et Septembre) qui devrait lui permettre d'améliorer la rentabilité financière du procédé de désulfuration. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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BioRemedial Technologies améliore un procédé basé sur une licence d'Infectec utilisant des Pseudomonas pour biodégrader de façon aérobie, et par co-métabolisme, le trichloréthylène. Le procédé est actuellement appliqué dans une aciérie de Pennsylvanie depuis 1996 et la réduction de la pollution est actuellement de 96 %. La partie biologique du traitement a lieu en fin de processus. Il faut parfois, soit pratiquer une extraction de vapeurs, soit ozoner les nappes contaminées, pour réduire au préalable la teneur en hydrocarbures chlorés. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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L'Idaho National Engineering and Environmental Laboratory et British Nuclear Fuels Plc vont essayer un bioprocédé de décontamination de béton dans le Windscale Pile 1 reactor à refroidissement par air de Sellafield, qui a fonctionné depuis les années 40s jusqu'en 1957. Il s'agit de mobiliser les quelques millimètres de surface auxquels se limite la contamination radioactive. Un gel de cellulose avec des Thiobacillus oxidans avec du soufre qui va être oxydé en acide sulfurique solubilisant les métaux présents va être appliqué pendant une année. Il permettra de désagréger 10-12 millimètres, un peu comme ce qui se passe (involontairement dans certains ouvrages d'art). On pilote le film bactérien en jouant sur la température et l'humidité. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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La Vie des Sociétés

Alors qu'elle allait se lancer dans les essais cliniques d'un vaccin contre l'hépatite B produit dans les plantes, Axis Genetics est en cessation de paiement, faute de pouvoir lever des fonds pour ces essais, à la suite des réticences de la bourse vis-à-vis des biotechnologies.

ForBio est également à vendre, ses techniques de production d'Eucalyptus transgéniques prenant trop de temps pour être rentables. Biocommerce Abstracts 21 (15SEP99).

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Cyanotech a mis au point une méthode améliorée de production de Spirulina, abaissant les prix de revient et a réussi, en cherchant à améliorer le produit, à augmenter de 50 % le rendement de ses bassins.

Les spirulines représentent actuellement 95 % de ses ventes. Biocommerce Abstracts 21 (15SEP99) et Industrial BioProcessing 21 (OCT99). Les choses devraient changer, car Cyanotech est maintenant autorisée à vendre son astaxanthine d'Hematococcus comme additif alimentaire aux Etats-Unis. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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Diversa a obtenu deux Small Business Innovation Research grants du NIH pour développer ses techniques de récupération de gènes dans l'environnement. Biocommerce Abstracts 21 (15SEP99).

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Novo Nordisk va filialiser ses productions d'enzymes industrielles, la filiale américaine ZymoGenetics étant traitée séparément. Biocommerce Abstracts 21 (15SEP99).

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Affymetrix commercialise des GeneChip™ de génome du rat et de la souris pour les essais de toxicologie. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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AstraZeneca va évaluer les techniques d'Atugen Biotechnology de validation des cibles pharmacologiques. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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Zeneca Agrochemicals a signé un accord pour cinq ans en génomique végétale avec Maxygen. Maxygen recevra une somme initiale de 5 millions de dollars plus 20 millions en financement de recherches et licences. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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International Specialty Products va racheter Kelco à Monsanto. avec les usines de production d'alginates de San Diego et de Girvan en Ecosse ainsi que les recherches à Tadworth en Grande-Bretagne. Industrial BioProcessing 21 (OCT99).

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Science ironise sur le fait que Affymetryx et Incyte Pharmaceuticals se querellent à propos de la technique des microarrays (le procès devrait se tenir en Septembre 2000) alors que l'un des protagonistes (le fondateur de Synteni) répand sur le web une forme plus simple de la technique. E Marshall; Science 286(15OCT99) 446.

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Nature prend parti dans la querelle entre Lexicon Genetics et certains chercheurs auxquels des droits importants (15 000 dollars) ont été demandés pour une utilisation non commerciale de matériels utilisés dans une publication dans Nature l'an passé. Il s'agit d'un article sur une méthode à haut débit de criblage de mutants dans des cellules ES qui a permis d'établir 70 000 clones porteurs d'une mutation marquée (Omnibank™). L'article concluait pourtant que "Lexicon will distribute the cell clones described here to requesting investigators for non-commercial research." La firme demande maintenant le payement de droits d'utilisation. Nature n'est pas content et le Howard Hughes Medical Institute a averti ses ressortissants des problèmes. Ce n'est probablement qu'un des problèmes qui se posent (ou vont se poser) dans l'utilisation de techniques pour lesquelles les firmes impliquées veulent retrouver leurs billes et qui nécessiterait des solutions raisonnables encore à trouver.

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La Politique

Une enquête intéressante de la Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la Répression des Fraudes (DGCCRF) illustre les difficultés liées à l'obligation d'étiquetage des produits contenant des organismes génétiquement modifiés (OGM).

Cette enquête a été réalisée début 1999 auprès de 94 entreprises (12 distributeurs ou importateurs et 82 fabricants). Parmi ces entreprises, 81 ne mentionnait aucune information sur les OGM sur leurs produits, et 13 indiquaient leur présence.

Plusieurs grandes enseignes de la distribution veulent s'engager dans des filières sans OGM, mais il se confirme que ce type d'obligation peut créer plus de problèmes qu'il n'en résout. L'absence d'obligation d'étiquetage à tous les stades de la commercialisation pose les principales difficultés. Une enquête menée il y a un an par la DGCCRF montrait que sur 62 prélèvements, 15 échantillons seulement de 12 produits finis contenaient des OGM, dont 10 ne comportaient aucune mention des OGM sur leur étiquette. Un seul produit mentionnait la présence d'OGM et un mentionnait, à tort, leur absence. .

L'industrie alimentaire est tributaire des informations données par leurs fournisseurs. Cela ne peut fonctionner que si l'étiquetage et la traçabilité se généralisent.

La réaction industrielle, dans ces conditions, est de changer la composition des aliments en évitant maïs et sojas (quand c'est possible). Le surcoût des sojas certifiés non transgéniques est actuellement de l'ordre de 15 %. Seules 40 entreprises ont pu fournir des attestations de leurs fournisseurs sur la nature non-OGM de leurs produits, mais ce sont souvent des déclarations sur l'honneur, imprécises sur les moyens mis en œuvre et seulement 14 ont pu suivre la trace de leurs produits, depuis la culture jusqu'à l'ingrédient. Quant à la vérification finale, elle a été réalisée par seulement 19 entreprises du fait du coût induit. AGIA Alimentation (23SEP99).

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LION bioscience, l'European Molecular Biology Laboratory (EMBL), l'European Media Laboratory et le Centre for Molecular Biology de l'Univeristät Heidelberg vont recevoir 4,2 millions de Dmarks pour développer la simulation et la modélisation des voies métaboliques à partir d'informations génomiques. Biocommerce Abstracts 21 (29SEP99).

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L'Institute of Molecular and Cellular Bioinformatics (IMBA) de Wien va être fondé avec une participation de l'académie des sciences autrichienne et l'Institute of Molecular Pathology de Boehringer Ingelheim qui donnera accès à ses facilités le bâtiment de l'IMBA jouxtant ceux de Boehringer Ingelheim. Q Schiermeier; Nature 401 (14OCT99) 630.

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Le coton Bollgard™ de Monsanto est autorisé en Thaïlande. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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Le Geilweilerhof Institute for Grapevine Breeding a reçu l'autorisation d'essayer ses vignes transgéniques résistantes à deux champignons. Biocommerce Abstracts 21 (01SEP99).

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